GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO - Código FGL 029

EXPERIMENTAL Versión 02
Talleres y Laboratorios de Docencia ITM Fecha 08-10-2018

1. IDENTIFICACIÓN DE LA GUÍA

Purificación de Ácidos Nucleicos mediante método

Nombre de la guía:
de columna
Código de la guía (No.): 008
Taller(es) o Laboratorio(s) aplicable(s): Laboratorio de Ingeniería Biomédica
Tiempo de trabajo práctico estimado: 2 horas
Asignatura(s) aplicable(s): Bioquímica médica II
Programa(s) Académico(s) / Facultad(es): Ingeniería Biomédica/ Ciencias exactas y aplicadas

COMPETENCIAS CONTENIDO TEMÁTICO INDICADOR DE LOGRO

Naturaleza química de los ácidos
Comprende el fundamento de
nucleicos.
Análisis del proceso de purificación de los métodos de purificación
Etapas de la purificación de
ácidos nucleicos a partir de muestras de ácidos nucleicos mediante
ácidos nucleicos.
biológicas. método de columna utilizando
Fundamento purificación de ADN
kit comercial.
mediante método de columna.

2. FUNDAMENTO TEÓRICO

2.1 Estructura de los ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos son macromoléculas biológicas, conformadas por cadenas de nucleótidos. El nucleótido
constituye la unidad o monómero, por lo que es quien les confiere las diferentes características bioquímicas a
los ácidos nucleicos. Un nucleótido está conformado por un azúcar, un fosfato y una base nitrogenada. Existen
dos tipos de ácidos nucleicos: ácido desoxirribonucleico (ADN) contiene nucleótidos con azúcar tipo
desoxirribosa, y el ácido ribonucleico (ARN) que contiene nucleótidos con azúcar tipo ribosa. Los azúcares, son
tipo aldehídos de cinco carbonos (pentosas). La diferencia entre los dos azucares, radica en presencia de un
grupo hidroxilo (-OH) en el extremo 2´ de la ribosa, lo que hace a la molécula de ARN más inestable y reactiva,
es decir más sensible a la degradación en comparación al ADN.

Las bases nitrogenadas, son moléculas orgánicas cíclicas conformadas por átomos de carbono, oxigeno,
hidrogeno y nitrógeno. Se clasifican en purinas, si tienen un solo anillo y en pirimidinas las que tienen doble
anillo. Estas son complementarias entre sí, formando parejas o pares de bases (Adenina-Timina/ Uracilo,
Guanina-Citosina), y son las que les confieren la estructura a los ácidos nucleicos, como también la base de
los procesos biológicos de replicación y transcripción. En el ADN encontramos los pares de bases Adenina-
Timina, Guanina-Citosina, y en el ARN encontramos Uracilo en reemplazo de la Timina, que se diferencian por
el grupo funcional CH3.

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Nucleótido de Ribosa Bases Nitrogenadas de los ácidos nucleicos

Nucleótido de desoxirribosa

Los fosfatos, son los encargados de unir los nucleótidos entre sí, en una misma cadena. Esta unión está dada
por un enlace fosfodiéster que se forma entre el fosfato y el carbono 5´del azúcar. Estos provienen del ácido
fosfórico, le confieren la característica ácida al ADN y al ARN, la carga negativa y el carácter hidrofílico que
poseen las biomoléculas. En la estructura de los ácidos nucleicos, hay enlaces débiles llamados puentes de
hidrogeno, formados entre átomos electronegativos (Oxígeno y Nitrógeno) y un átomo de hidrógeno. La
formación de estos enlaces está dada por la complementariedad de las bases nitrogenada, que determinan la
conformación de doble cadena a las moléculas de ADN y la formación de estructuras secundarias en el RNA.
Adicionalmente en el ADN, se forman estructuras llamadas doble hélice, dadas por el enroscamiento de las dos
cadenas. La separación de estos puentes de hidrógeno, se denomina desnaturalización, que es un proceso
reversible y puede hacerse mediante tratamiento con calor, álcalis, entre otros. El proceso de separación de los
enlaces fosfodiéster, constituye un proceso de degradación de los ácidos nucleicos; esto puede darse por
procesos de hidrólisis causados por enzimas (DNasas, RNasas) o por compuestos reactivos. Este proceso es
irreversible.

Enlace Fosfodiéster Puentes de hidrógeno

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2.2 Fundamento del Método

En general, existen diferentes metodologías para la purificación o aislamiento de ácidos nucleicos, las cuales
incluyen métodos caseros y métodos comerciales, que varian dependiendo el tipo de muestra, el fundamento
utilizado y el grado de pureza final (calidad y cantidad). Las muestras biológicas pueden ser tener diferentes
orígenes (vegetal, animal, bacteriano, viral). En el caso de muestras de origen animal estas incluyen muestras
de sangre total, suero o plasma, tejido, líneas celulares, entre otros. ADN (Nuclear, mitocondríal) o ARN (ARN
total, ARN ribosomal, ARN mensajero o ARN de transferencia). Sin embargo, los pasos generales siguen un
mismo algoritmo:

1. Obtención y almacenamiento de la muestra 2

2. Rompimiento de las estructuras que contienen el material genético
3. Separación del material genético de los componentes homogenizados
4. Precipitación de los ácidos nucleicos
5. Purificación
6. Elusión
7. Preservación del material

Los Kits comerciales permiten la purificación rápida de ácidos nucleicos a partir de órganos, tejidos y células
provenientes de Animales, vegetales, microorganismos y virus. En el caso del presente laboratorio se utilizará
un kit comercial el cual permite la purificación de ADN en muestras de sangre, a través de un método de
columna. Una vez purificado el ADN, este podrá ser amplificado mediante PCR, digerido por enzimas de
restricción, y/o sometido a las diferentes técnicas de ADN recombinante utilizadas en clonación y expresión
génica.

La extracción de ADN mediante el método de columna, se basa en la utilización de una columna de sílica-gel
en presencia de sales caotrópicas. La muestra de sangre será digerida con Proteinasa K a 55ºC con la ayuda
de una solución estabilizante (Buffer de digestión). Cualquier resto de ARN será destruido (digerido) mediante
la digestión con RNasa A la cual ataca específicamente los fosfatos unidos a nucleótidos de pirimidinas (T o C)
en presencia de iones monovalentes. El homogenizado es mezclado con etanol y el buffer genómico de
adsorción, permitiendo la adherencia del ADN a la membrana de sílica en la columna. Una vez adherido el ADN
las impurezas (Lípidos y proteínas) se remueven mediante lavados sucesivos con buffers. Al final del proceso,
el DNA genómico podrá ser solubilizado con el Buffer de Elución.

Esquema de la columna de Silica-Gel, permitiendo la adherencia del ADN

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Aunque todos los pasos de este procedimiento general son cruciales para el aislamiento de material genético,
la obtención de la muestra, su identificación y preservación son vitales para la realización ulterior de análisis
sobre el ADN o el ARN. Por regla general, el material obtenido deberá será transportado y almacenado a la
menor temperatura posible (Desde 4 hasta -86°C), evitando procesos de descongelación y congelaciones
sucesivas.

2.2.1 Etapas de la Purificación de Ácidos Nucleicos

 Homogenización y Lisis.

Consiste en rompimiento de las estructuras celulares que contienen el material genético, ocasionando la
liberación de los ácidos nucleicos de las células animales, vegetales, microorganismos o virus presentes en la
muestra de interés. Para esto se utilizan soluciones de lisis que contienen detergentes que emulsifican los
lípidos de las membranas celulares o lisozima que degrada las estructuras de la pared bacterianas; proteasas
y sales caotrópicas que facilitan la precipitación y homogenización de las diferentes biomoléculas presentes
en la muestra.

 Separación del material de los componentes homogenizados.

Es la extracción de los lípidos y proteínas presentes en la muestra. Se utilizan solventes orgánicos (fenol,
cloroformo) que actúan como desnaturalizantes, los cuales permiten separar diferencialmente las biomoléculas
en dos fases. Fase acuosa donde permanecen los ácidos nucleicos (hidrofílicos) y una fase orgánica donde se
atrapan las proteínas y lípidos.

 2.2.3 Precipitación de Ácidos Nucleicos.

Se basa en la neutralización de las cargas y la deshidratación de los ácidos nucleicos, utilizando soluciones
salinas (NaCl; EDTA; Tris) y alcoholes (etanol, isopropanol), lo que hace que los ácidos nucleicos se separen
de la fase acuosa y se precipiten, mediante el uso de centrifugación de alta velocidad. Esta precipitación es
reversible, mediante la solubilización en medios acuosos. En el caso de los métodos basados en columna, en
esta etapa se adiciona la mezcla proveniente de la etapa de lisis a la columna de sílica-gel, con el fin de que se
dé la adherencia de los ácidos nucleicos a la columna.

 Lavado.

Esta fase consiste en la eliminación de impurezas y trazas de contaminantes presentes en la muestra

(solventes, proteínas, restos celulares) y se realiza generalmente con Etanol al 70-95%, el cual puede inhibir la
amplificación posterior; por esto una vez se realiza el lavado se debe eliminar el etanol y dejar secar bien la
columna. Este paso puede repetirse varias veces con el fin de obtenerse un extracto de ácidos nucleicos de
alta pureza.

 Elución.

En esta etapa se da la rehidratación o solubilización de los ácidos nucleicos precipitados. Para esta fase se
utiliza agua de alta pureza libre de DNasas o RNasas. Específicamente, la solublización de los ácidos nucleicos
que se encuentran adheridos a la columna ocurre mediante la adición del buffer de elución, el cual rompe las
interacciones electrofílicas mediante el cambio de las cargas presentes en la sílica-gel. Una vez solubilizado el

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material, este se deberá alicuotar (dividir en pequeñas porciones a otros microtubos) para evitar que los
procesos de descongelaciones sucesivas ocasionen el deterioro del material genético. Así mismo, se deberá
procurar almacenar el material a una temperatura entre -20°C a -70°C y en el caso del ARN adicionar
inhibidores de RNasas para estabilizar la molécula.

3. OBJETIVO(S)

Comprender el fundamento de los métodos de purificación de ácidos nucleicos mediante el método de columna.

4. RECURSOS REQUERIDOS

4.1 Instalaciones
Laboratorio de Ingeniería Biomédica H-204, Campus Robledo

4.2 Equipos
• Vortex
• Baño serológico o placa de calentamiento 25ºC - 95ºC
• Centrífuga para microtubos (1,5 ml – 2 ml), con capacidad de hasta 14,000 x g

4.2.1 Indicaciones sobre el manejo del equipo

Vortex:
1. Seleccionar el modo de agitación (Continua o toque).
2. Colocar los tubos en la parte superior para agitar.
3. Limpiar con alcohol desinfectante y desconectar al terminar la práctica.

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Baño Serológico:
1. Llenar con agua destilada estéril hasta el nivel indicado.
2. Encender y programar a 37ºC.
3. Cuando termine la práctica completa, apagar el equipo.

Microcentrífuga:
Será manejada únicamente por el docente o los coordinadores de laboratorio.
1. Encender y oprimir el botón para abrir la cubierta.
2. Ubicar los tubos para microcentrífuga en el rotor asegurando que cada posición del rotor contenga la
misma cantidad de volumen al frente. En caso de no tener tubos pareados con muestras, se debe llenar
con agua destilada un tubo del mismo tamaño, adicionando el mismo volumen de la muestra.
3. Programar la centrifuga a más de 10.000 x g durante el tiempo requerido.
4. Al finalizar los periodos de centrifugación el equipo debe limpiarse con alcohol antiséptico.

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4.3 Herramientas

 Micropipetas de volumen variable 0.5 - 10μL y de 10 - 100 μL

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4.4 Reactivos
• Solución de Lisis T.
• Solución de Lisis C.
• Solución para la preparación de la columna.
• Solución de lavado
• Solución de elución
• Proteinasa K
• Etanol
4.5 Materiales
• Guantes y bata de laboratorio (Estudiantes).
• Gafas de laboratorio (Estudiantes)
• Tapabocas (Estudiantes)
• Canecas de bolsa roja para el desecho de químicos y biológicos
• Toallas absorbentes
• Tubos de 1,5 ml (microtubos) para Microcentrifuga, estériles y libres de DNasa
• Puntas nuevas y estériles con capacidad para tomar micro-volúmenes entre 1 μl y 1000 μl
• Columna “GenElute Miniprep Binding Columns”
• Tubos colectores

5. PROCEDIMIENTO O METODOLOGÍA PARA EL DESARROLLO

Notas antes de comenzar:

 Realice todos los pasos de centrifugación a temperatura ambiente (15-25 °C).
 Si algún reactivo se precipita, incube a 55-65°C, hasta que no se visualice el precipitado, deje enfriar
a temperatura ambiente antes de usarlo.
 Agregue etanol a la solución de lavado.
 Tempere los gránulos de células o tejidos congelados a temperatura ambiente.
 Precaliente el baño serológico a 56 ° C.
 Identifique los guardianes o recipientes con bolsa roja que utilizará para desechar el material de
plástico contaminado, y los frascos de vidrio debidamente marcados para descartar los reactivos del
estuche comercial.
 Utilice bata, guantes, gafas de laboratorio y tapabocas para manipular los reactivos del estuche
comercial y el ADN (Este ácido nucleico es sensible a DNasas presentes en la saliva, la piel y las
superficies. Se recomienda no hablar durante el procedimiento ni tocar la parte interna de los tubos).
 Limpie la superficie de trabajo con hipoclorito y alcohol antiséptico (70%).

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 Marque claramente los microtubos en los que se hará el procedimiento, indicando la fecha, su grupo
de trabajo y el curso.

Muestra

Para la extracción de ADN se empleará una muestra de tejido animal (ej. hígado de res o de cerdo comercial)

Procedimiento:

1.Tejido: Corte el tejido (≤10 mg de bazo o ≤25 mg de otro tejido) en trozos pequeños, y colóquelo en un tubo
de microcentrífuga de 1.5 mL. Agregue 180 μL de solución de lisis T. Luego agregue 20 µL de la solución de
proteinasa K. Mezcle mediante agitación Vórtex e incube la muestra a 55°C durante 15 minutos. Agite con
Vórtex ocasionalmente durante la incubación.

2. Agregue 200 μL de la Solución de Lisis C, a la muestra. Mezcle completamente agitando en el Vórtex por 15
segundos. Incubar a 70 ° C durante 10 min.

3. Ubique la columna GenElute en el tubo colector de 2 mL. Agregue 500 μL de la solución de preparación de
columnas, y centrifugue a 12.000 x g por un minuto. Descarte el líquido.

4. Agregue 200 μL de etanol (95-100%) al tubo que contiene la muestra. Mezcle completamente agitando en el
Vórtex.

5. Pipetee la mezcla en la columna, que fue previamente tratada en el paso 3. Centrifugue a ≥6500 x g por 1
minuto. Deseche el tubo de recolección

6. Coloque la columna giratoria en un nuevo tubo de recolección de 2 mL. Agregue 500 μL de la solución de
lavado. Centrifugar durante 1 minuto a ≥6500 x g. Deseche el tubo de flujo y de recolección.

7. Coloque la columna en un nuevo tubo de recolección de 2 mL. Agregue 500 μL de solución de lavado.
Centrifugar durante 3 minuto a la velocidad máxima (12.000-16.000 x g). Nota: La columna debe estar libre
de etanol antes del siguiente paso, centrifugue a la velocidad máxima 1 minuto adicional, si se observa
etanol residual. Deseche el tubo de flujo y de recolección.

8. Coloque la columna en un nuevo tubo de recolección de 2 mL, agregue 200 μL de la solución de elución,
directamente en el centro de la columna. Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente (15-25 ° C).
Centrifugar durante 1 minuto a ≥6500 x g.

9. Opcional: repita el paso 8 para aumentar el rendimiento de ADN.

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6. PARÁMETROS PARA ELABORACIÓN DEL INFORME

6.1 Explique el efecto de cada uno de los componentes del Buffer de Lisis en la etapa de homogenización del
ADN.
6.2. Realice un esquema/dibujo y un diagrama de flujo del procedimiento donde explique el fundamento
bioquímico de cada una de las etapas de la extracción de ADN.
6.3 Explique el fundamento bioquímico que permite la Elución de ADN de la columna de sílica-gel
6.4 Realice una comparación e indique las ventajas y desventajas entre el método de separación de ADN
mediante métodos de columna (en inglés: Spin Column), y los métodos caseros de extracción de ácidos
nucleicos como fenol-cloroformo y Salting out. De una breve fundamentación de estos métodos.
6.5 Explique cómo se puede analizar la calidad y pureza del ADN purificado ¿Cómo se puede asegurar que el
producto final de extracción es Acido desoxirribonucleico (ADN) y no Ácido ribonucleico (ARN)?
6.6 Describa cómo se realiza la cuantificación de ácidos nucleicos mediante espectrofotometría ¿Cuál es el
componente del ADN que absorbe a la longitud de 260nm y para que puede servir esta característica en la
cuantificación del ADN? ¿Qué sustancias absorben a 280nm? ¿Qué se puede decir si un extracto de ADN
presenta un radio de absorbancia 260/280:>1.8?
6.7 Describa algunas aplicaciones biomédicas de la extracción de ácidos nucleicos

7. DISPOSICIÓN DE RESIDUOS

Para la presente práctica se manipularán muestras biológicas y reactivos como sales, solventes
orgánicos para lo cual se utilizarán todos los elementos de protección personal detallados en esta
guía más adelante.
Todo el material plástico contaminado con restos biológicos y los restos de sangre, células o tejidos
serán descartados en bolsa roja rotulada con el símbolo de riesgo biológico para su disposición
final con la empresa encargada de la recolección de residuos biológicos en el ITM. Para el caso de
los restos de material biológico estos serán almacenados a -20°C hasta su recolección. Para el
caso del material plástico contaminado con químicos serán descartados en bolsa roja rotulada con
el símbolo de riesgo químico para su disposición final con la empresa encargada de la recolección
de residuos químicos. Los restos de químicos serán descartados en contenedor de plástico con
tapa rotulado según el tipo de químico (orgánicos, inorgánicos, ácidos y bases o sales),
componentes y concentración para su entrega final con la empresa encargada de la recolección
de residuos químicos en el ITM.

8. BIBLIOGRAFÍA

Instituto Tecnológico Metropolitano. Manual de Bioseguridad, generalidades de

bioseguridad en el laboratorio nivel II de biología celular y molecular. Laboratorio de
Ingeniería Biomédica, ITM.

Gerald Karp. Biología celular y molecular: Conceptos y experimentos. Editorial Mcgraw

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Hill. GUÍA DE TRABAJO Ingeniería Biomédica Código FDE 048 Versión 03 Fecha
200906-09

Geofrey M Cooper. The Cell a molecular approach. Editorial Sinauer Associates. Aysha
Divan and Janice Royds. Tools and Techniques in Biomolecular Science. Editorial
Oxford.

McKee, Trudy; McKee, James R; Palacios Martínez, Juan Roberto. Bioquímica: la base
molecular de la vida (4a ed). 2009.

Karp, Gerald. Biología Celular y Molecular. Quinta edición. Edit: Mc Graw Hill. 2009.
Mary K. Campbell, Shawn O. Farrell. Bioquímica. Sexta edición. 2010

Lodish. Biología Celular y Molecular. Tercera edición. Edit: Panamericana. 2003.

Comparisons of direct extraction methods of microbial DNA from different paddy soils.
Islam MR, Sultana T, Melvin Joe M, Cho JC, Sa T. Saudi J Biol Sci. 2012
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A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for
extraction of DNA from faecal samples. Claassen S, du Toit E, Kaba M, Moodley C, Zar
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Comparison of protocols for DNA extraction from long-term preserved formalin fixed
tissues. Paireder S, Werner B, Bailer J, Werther W, Schmid E, Patzak B, Cichna-Markl
M. Anal Biochem. 2013 Aug 15;439(2):152-60.

A simple Chelex protocol for DNA extraction from Anopheles spp. Musapa M,
Kumwenda T, Mkulama M, Chishimba S, Norris DE, Thuma PE, Mharakurwa S. J Vis
Exp. 2013 Jan
9;(71).

Extraction of viral nucleic acids: comparison of five automated nucleic acid extraction
platforms. Verheyen J, Kaiser R, Bozic M, Timmen-Wego M, Maier BK, Kessler HH. J
Clin Virol. 2012 Jul;54(3):255-9.

Fabian M. Cortés Mancera – Natalia Restrepo

Elaborado por:
Johanna Carolina Arroyave
Revisado por: Nombre del profesional del Taller o Laboratorio
Versión: 008
Fecha: 14/11/2017

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