BIOINFORMATICA

DISEÑO DE PRIMERS

INTEGRANTES:
 BARTOLO PAREDES, YOMIRA PAMELA
 PULIDO TORRES, JULEISY KATERYN
 DISEÑO DE PRIMERS
I. INTRODUCCIÓN
Un PRIMER es una cadena de ácido nucleico o de una molécula relacionada que sirve como
punto departida para la replicación del ADN.

Es una secuencia corta de ácido nucleico que contiene un grupo 3'hidroxilo libre que forma
pares de bases complementarios a una hebra molde y actúa como punto de inicio para la
adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra molde.

Se trata de secuencias sintéticas de oligonucleótidos que son utilizadas para reconocer por
apareamiento complementario secuencias blanco en ADN de plantilla, que consiste
generalmente en ADN genómico.
Comúnmente un par de iniciadores son usados en PCR para definir los extremos del producto
que se desea amplificar, y a partir de ellos la DNA polimerasa utilizada inicia la polimeración en
dirección 5' - 3'.
También son utilizados en reacciones de secuenciación de ADN, donde se utiliza solo un
iniciador sobre una concentración relativamente alta de ADN blanco, para polimerizar cadenas
sencillas de diferente tamaño truncadas por dideoxinucleótidos y así determinar la secuencia
de bases nitrogenadas.
Como ejemplo si tenemos la siguiente secuencia de ADN de cadena doble a partir de la cual
pretendemos amplificar por PCR un fragmento cuyos límites están indicados por el símbolo de
mayor o menor, los primers a utilizar podrían ser como los siguientes:

REVERSE PRIMER

3’-gaccaggacgctagat<-5’

...5'-aggaggcgagatgtcgagtcggatcgaccagagcgacccacacaggaccaggacgctagatcga-3'...

...3'-tcctccgctctacagctcagcctagcaggtctcgctgggtgtgtcctggtcctgcgatctagct-5'...

5’->gaggcgagatgtcgga-3’

FORWARD PRIMER

+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ <-Secuencia amplificada

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CRITERIOS PARA EL DISEÑO DE PRIMERS:
El diseño cuidadoso de primers es uno de los aspectos más importantes de la PCR.
Primers mal diseñados pueden amplificar otros fragmentos de ADN distintos a los buscados.
En el diseño de los mismos algunas reglas se han demostrado como útiles, por ejemplo:

 LONGITUD:Típicamente se acepta un rango de 18 a 24 nucleótidos. La longitud se

relaciona a la especificidad del primer.
 TEMPERATURA: La temperatura de disociación (TM) es la temperatura en la que el
50% del primer se encuentra disociado. Es un buen indicador para establecer la
temperatura de hibridación en un experimento de PCR:
 Ambos primers deben tener TM similares o próximos.
 La diferencia debe ser menor de los 5 °C.
 CONTENIDO G-C%:El contenido de GC debe situarse entre el 40-60%. Influye en la
estabilidad del híbrido. Se debe evitar la complementariedad de los últimos dos o tres
nucleótidos del terminal 3´ entre los primers. Ayuda a reducir la formación de dímeros.
 ANY:Máxima Complementariedad (o denominada Auto complementariedad Local):
refleja el máximo alineamiento local permisible. Se toma como predictor de la
tendencia de los primers a hibridar entre ellos.
 3:Máxima Complementariedad 3’ (o denominado Alineamiento Global Anclado en 3’):
es un puntaje máximo permisible cuando se testea la complementariedad entre los
primers izquierdo y derecho. Se toma para predecir la probabilidad de generación de
dímeros de primers durante la reacción de PCR.
 La secuencia de los primers individuales debe iniciarse y terminarse con 1 o 2 bases
púricas.
 Evitar regiones con potencialidad para formar estructuras secundarias internas.
 Evitar poli X.
 Secuencias adicionales pueden ser agregadas en el extremo 5’ del primer.
 Se pueden agregar degeneraciones en algunas posiciones del primer:
a. Se incrementa el riesgo de amplificación inespecífica.
b. Se disminuye la concentración en la mezcla de cada uno de los primers
posibles.
c. No se recomienda utilizar más de 64 primers diferentes en la mezcla.
d. Código IUPAC/IUB.

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 II. PROCEDIMIENTO PRACTICO

NOMBRE DEL GEN DE LA D. MELANOGASTER: NM_176411.3

1° PASO:

En una ventana nos dirigimos a la página del National Center for Biotechnology Information
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. En el recuadro de búsqueda se cambió All Database por
Nucleotide. Y a continuación se escribió el número de acceso (NM_176411.3) y oprimimos el
botón Search. Se abrió la ventana de Display Settings y elegimos FASTA, dándonos como
resultado la secuenciación del gen.

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2° PASO:

Posteriormente en una nueva ventana nos dirigimos a la página ORF FINDER

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html, luego en el cuadro de búsqueda introducimos
en código del gen y le dimos clic en ORFIND.

Dándonos como resultados:

3° PASO:

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4° PASO:

5° PASO:

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6° PASO:

Ingresamos a la páginahttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/, y copiamos la secuencia

del gen

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Le dimos clic en PICK PRIMERS y nos arrojó estos resultados:

7° PASO:

Después de arrojarnos los datos generales del PRIMER le dimos clic nuevamente en PICK
PRIMERS. Obteniendo así:

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8° PASO:

Ingresamos a BLAST

9° PASO:

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Ingresamos la secuencia LEFT PRIMER:

Y luego le dimos clic en BLAST: Resultando

10° PASO:

Lo mismo hicimos con la secuencia complementaria del PRIMERACGAGCCATTAACACCCAAG:

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 Obteniendo así:

III. RESULTADOS

Oligo Start Len Tm gc% any 3’ Seg

LEFT PRIMER 1078 20 59.98 50.00 4.00 0.00 TCAGCAGCAGCAATACCATC

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RIGHT PRIMER 1288 20 59.99 50.00 4.00 0.00 CTTGGGTGTTAATGGCTCGT
SEQUENCE SIZE: 2527
LEFT PRIMER 1379 20 60.00 55.00 2.00 1.00 GACGGAACGAGCAAGAAGAC
RIGHT PRIMER 1615 20 59.95 45.00 4.00 2.00 CGTGCATTGATATTGGTTCG
PRODUCT SIZE: 237, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR3’ COMPL: 1.OO
LEFT PRIMER 1382 20 60.00 55.00 2.00 2.00 GGAACGAGCAAGAAGACGAC
RIGHT PRIMER 1615 20 59.95 45.00 4.00 2.00 CGTGCATTGATATTGGTTCG
PRODUCT SIZE: 234, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR3’ COMPL: 2.OO
LEFT PRIMER 878 20 59.92 45.00 6.00 2.00 TACAATGGAGGCCACAATCA
RIGHT PRIMER 1097 20 59.98 50.00 4.00 1.00 GATGGTATTGCTGCTGCTGA
PRODUCT SIZE: 220, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR3’ COMPL: 3.OO
LEFT PRIMER 672 20 60.08 50.00 5.00 1.00 AATCGGATCAGCACAAGGAC
RIGHT PRIMER 867 20 60.02 50.00 3.00 2.00 GCGTTGAATGACTCGCTGTA
PRODUCT SIZE: 196, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR3’ COMPL: 1.OO

IV. REFRENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 Lic. en Genética Ernesto Martín Giorgio, Introducción al diseño de primers (visitar en
línea: http://www.aulavirtual-
exactas.dyndns.org/claroline/backends/download.php?url=L0Z1bmRhbWVudG9zX3Rl
83JpY29zX2RlX2xhX3JlYWNjafNuLnBkZg%3D%3D&cidReset=true&cidReq=BIOINFO).
 Programas utilizados:
NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
PRIMER 3: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/
ORF FINDER: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html

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