Você está na página 1de 80
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Instituto de Química "Desenvolvimento e validação de metodologia para determinação
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Instituto de Química
"Desenvolvimento e validação de metodologia para
determinação de resíduos de pesticidas piretróides por
HPLC em feijão"
Sérgio Henrique Monteiro
Dissertação de Mestrado
Orientador: Prof. Dr. Jorge César Masini
São Paulo
30 de junho de 2006
índice: 11 1. INTRODUÇÃO 11 1.1 Pesticidas 12 1.2 Piretróides 13 1.3 Resíduos de pesticidas
índice:
11
1. INTRODUÇÃO
11
1.1 Pesticidas
12
1.2 Piretróides
13
1.3 Resíduos de pesticidas
13
1.4 Cromatografia
17
1.5 Emprego da HPLC na analise de piretróides
18
1.6 Feijão
20
1.7 Validação
21
2. OBJETIVO
21
3. MATERIAIS E MÉTODO
21
3.1 Materiais
22
3.2 Reagentes
23
3.3 Equipamentos
24
3.4 Preparo de Reagentes / Padrões
3.4.1 Solução de eluição para GPC (Acetato de etila : Ciclohexano 1:1)
24
3.4.2 Solução da Fase Móvel (Acetonitrila: Água 8:2)
24
3.4.3 Preparo do sulfato de sódio PA anidro:
24
3.4.4 Preparo do cloreto de sódio PA:
24
2 3.4.5 Preparo dos padrões analíticos: 25 3.4.6 Procedimento de Fortifícação 27 3.5 METODOLOGIA ANAlíTICA
2
3.4.5 Preparo dos padrões analíticos:
25
3.4.6 Procedimento de Fortifícação
27
3.5
METODOLOGIA ANAlíTICA
27
3.5.1 Extração
27
3.5.2 Partição
28
3.5.3 Purificação em Coluna de GPC
28
3.5.4 Condições Cromatográficas
29
3.5.5 Fórmula para cálculo da concentração de piretróide na amostra (R)
32
3.5.6 Pesticidas a serem estudados
33
3.5.7 Amostras analisadas
38
4.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
38
4.1 Cultura Estudada
38
4.2 Otimização das Condições Cromatográficas
39
4.2.1 Comprimento de onda do detector UV-Visível
39
4.2.2 Fase Estacionária
40
4.2.3 Fase Móvel
40
4.2.4 Fluxo da fase móvel
40
4.2.5 Condições do integrador
45
4.3 Linearidade, faixa e função de resposta
45
4.4 Discussão do Desenvolvimento da metodologia de extração e purificação
da amostra:
50
3 4.4.1 Extração 50 4.4.2 Partição 51 4.4.3 Purificação 51 4.5 Validação do método 51
3
4.4.1 Extração
50
4.4.2 Partição
51
4.4.3 Purificação
51
4.5
Validação do método
51
4.5.1 Especificidade/Seletividade
58
4.5.2 Recuperação
61
4.5.3 Limite de Detecção
64
4.5.4 Limite de Quantificação
66
4.5.5 Precisão
67
4.5.6 Exatidão
68
4.5.7 Robustez
68
4.6
Resultado das análises de amostras de feijão
70
5.
CONCLUSÃO
71
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
72
4 índice de Tabelas: Tabela 1 - Concentração dos piretróides na Solução Estoque 25 Tabela
4
índice de Tabelas:
Tabela 1 - Concentração dos piretróides na Solução Estoque
25
Tabela 2 - Concentração dos piretróides na Solução Intermediaria
26
Tabela 3 -
Volume da Solução Intermediaria a ser pipetado para o
preparo das soluções da curva analítica
26
Tabela 4 - Volume da Solução Intermediaria a ser pipetado para os três
níveis de fortificação
27
Tabela 5 - Tempo de retenção médio dos piretróides
30
Tabela
6
-
Limites máximos de resíduo permitido dos piretróides
estudados, na cultura de feijão
39
Tabela
7
-
Valores de resolução dos picos para solução CoqP-1
0,02 ng/lJL
45
Tabela
8
-
Valores de resolução dos picos para solução CoqP-2
0.02 ng/lJL
45
Tabela 9 - Dados da equação linear e coeficiente de correlação das
curvas analíticas de calibração
50
Tabela 10- Recuperações para a Fenpropatrina
62
Tabela 11 - Recuperações para o Fenvalerato
62
5 Tabela 12 - Recuperações para a Cipermetrina 62 Tabela 13 - Recuperações para a
5
Tabela 12 -
Recuperações para a Cipermetrina
62
Tabela
13 -
Recuperações
para a Deltametrina
62
Tabela
14 -
Recuperações
para
a Trans-permetrina
63
Tabela
15 -
Recuperações para a Cis-permetrina
63
Tabela
16 -
Recuperações para a Lambda-cialotrina
63
Tabela 17 -
Recuperações para a Sifentrina
63
Tabela 18 -
Limite de detecção para os piretróides estudados
65
Tabela 19 - Limite
de quantificação para os piretróides estudados
66
Tabela
20
-
Intervalos de coeficiente de variação (CV%) e
recuperações aceitos com relação à concentração do analito na
amostra
67
Tabela 21 - Recuperação e desvio padrão encontrados pelas duas
equipes, A e S, que analisaram as amostras fortificadas.
69
6 índice de Figuras: Figura 1 - Cromatograma com todos os piretróides juntos em uma
6
índice de Figuras:
Figura
1
-
Cromatograma com todos os piretróides juntos em uma
mesma solução
42
Figura
2
-
Cromatograma
da
Solução
Coq.
P1,
fenpropatrina,
cipermetrina, fenvalerato e bifentrina
43
Figura
3 -
Cromatograma da Solução Coq. P2, lambda-cialotrina,
deltametrina, trans-permetrina e cis-permetrina
44
Figura
4 -
Curva analítica de calibração da bifentrina
46
Figura 5 -
Curva analitica de calibração da fenpropatrina
46
Figura 6 -
Curva
analítica de calibração do fenvalerato
47
Figura
7 -
Curva analítica de calibração da cipermetrina
47
Figura
8 -
Curva analítica de calibração da deltametrina
48
Figura
9 - Curva
analítica de calibração da trans-permetrina
48
Figura
10- Curva
analítica de calibração cis-permetrina
49
Figura
11 -
Curva analítica de calibração da lambda-cialotrina
49
Figura 12 - Cromatograma de amostra fortificada em 0,01 mg/kg
com o Coq P1
52
7 Figura 13 - Cromatograma de amostra fortificada em 0,01 mg/kg com o Coq P2
7
Figura 13 - Cromatograma de amostra fortificada em 0,01 mg/kg
com o Coq P2
53
Figura 14 - Cromatograma de amostra fortificada em 0,10 mg/kg
com o Coq P1
54
Figura 15 - Cromatograma de amostra fortificada em 0,10 mg/kg
com o Coq P2
55
Figura 16 - Cromatograma de amostra fortificada em 1,00 mg/kg
com o Coq P1
56
Figura 17 - Cromatograma de amostra fortificada em 1,00 mg/kg
com o Coq P2
57
Figura 18 - Cromatograma de uma amostra testemunha de feijão
58
Figura 19 - Cromatograma da solução padrão Copo P1 1,00
119/IJL injetada no cromatógrafo de fase gasosa com detector de
captura de elétrons
59
Figura 20 - Cromatograma da solução padrão Copo P2 1,00
I1gh.JL injetada no cromatógrafo de fase gasosa com detector de
captura de elétrons
60
Figura
21-
Cromatograma
da
amostra
de
feijão
testemunha
injetada no
cromatógrafo
de
fase
gasosa
com
detector
de
captura de elétrons
60
8 Figura 22- Cromatograma da amostra fortificada com o Coq. P1 injetada no cromatógrafo de
8
Figura 22- Cromatograma da amostra fortificada com o Coq. P1
injetada no cromatógrafo de fase gasosa com detector de
captura de elétrons
61
Figura 23 - Cromatograma da amostra fortificada com o Coq. P2
injetada no cromatógrafo de fase gasosa com detector de
captura de elétrons
61
9 . RESUMO Um método rápido utilizando cromatografia liquida (LC) foi desenvolvido para determinação simultânea
9
.
RESUMO
Um método rápido utilizando cromatografia liquida (LC) foi desenvolvido
para determinação simultânea de 7 pesticidas piretróides (bifentrina, cipermetrina,
fenpropatrina, fenvalerato, permetrina, lambda-cialotrina, e deltametrina).
Os resíduos são extraídos com acetona e a partição realizada de acordo
com o método multi-resíduos DFG-S 19, substituindo
diclorometano por acetato de
etila/ciclohexano (1 +1) e purificação usando cromatografia de permeação a gel
com uma coluna Biobeads SX3 e acetato de etila/ciclohexano (1 +1) como eluente.
A separação por LC é realizada com uma coluna LiChrospher 100 RP-18 e
acetonitrila/água (8+2) como fase móvel. Os pesticidas são detectados em 212nm.
As recuperações dos 7 pesticidas piretróides em amostras de feijão
fortificadas em 0,010; 0,100; e 1,000 mg/kg ficaram entre 71-105%. A diferença
particular deste método é o limite de quantificação, os quais ficaram entre 0,004-
0,011 mg/kg, abaixo de muitos outros métodos de LC descritos na literatura.
A cromatografia a gás (GC) com detector de captura de elétrons é mais
sensível que a LC, mas o método com LC facilita a identificação dos picos. A GC
apresenta muitos picos enquanto a LC apresenta apenas um para a maioria dos
piretróides. A análise com LC é uma boa alternativa para a determinação de
resíduos de piretróides em feijão.
Durante o ano de 2005, um total de 48 amostras de feijão comercializadas
na
cidade de São Paulo, foram analisadas. Nenhum resíduo de pesticida piretróide
foi
detectado nas amostras.
10 ABSTRACT A rapid liquid chromatographic (LC) method has been developed for simultaneous determination of
10
ABSTRACT
A
rapid
liquid
chromatographic
(LC)
method
has
been
developed
for
simultaneous determination of 7 pyrethroid insecticides (bifenthrin, cypermethrin,
fenpropathrin, fenvalerate, permethrin, lambda-cyhalothrin and deltamethrin) in
beans.
Residues are extracted from beans with acetone and the partition realized
according to the multi-residue method DFG-S 19, replacing dichloromethane by
ethyl acetate/cyclohexane (1 +1) and cleaned up using gel-permeation with a
Biobeads SX3 column and ethyl acetate/cyclohexane (1 +1) as eluant. LC
separation is performed on a LiChrospher 100 RP-18 column with
acetonitrile/water (8+2) as mobile phase. The pesticides are detected at 212 nm.
Recoveries of 7 pyrethroid insecticides from beans fortified at 0.010; 0.100;
1.000 mg/kg leveis were 71-105 %. The particular differential of this method is the
quantification limíts, which were between 0.004-0.011 mg/kg, lower than most of
the Iimits reported for LC methods described in the literature.
The gas chromatographic (GC) with electron capture detection is more
sensitive than LC, but the LC method facilitates the identification of the peaks.
Analysis of pyrethroids by GC shows several peaks, but LC shows only one for
most pyrethroids. The analysis by LC was a good alternative for determination
pyrethroid residues in beans.
During 2005 year, a total of 48 bean samples commercialized in Sao Paulo
City were analyzed. No residues of pyrethroids pesticides were detected in the
samples.
11 1. INTRODUÇÃO 1.1 Pesticidas Os pesticidas (também denominados de agrotóxicos, defensivos agrícolas,
11
1.
INTRODUÇÃO
1.1
Pesticidas
Os pesticidas (também denominados de agrotóxicos, defensivos agrícolas,
agroquímicos, biocidas, praguicidas ou produtos fitossanitários) são produtos
químicos utilizados no combate as pestes, doenças e ervas daninhas, as quais
causam prejuízos aos produtores agrícolas, reduzindo a qualidade e quantidade
da produção.
Os pesticidas, diferentemente dos fertilizantes e sementes melhoradas, cujo
uso têm como resposta uma produtívidade maior e têm como função evitar quedas
de produção por ataques de pestes, doenças de plantas e ervas daninhas.
Servem também como coadjuvantes na preservação de produtos armazenados.
Porém, quando utilizados inadequadamente podem provocar sérios problemas
para a saúde humana e para o meio ambiente. (FERREIRA & TSUNECHIRO,
1998).
O Codex Alimentarius (Programa das Nações Unidas sobre Harmonização
de Normas Alimentares gerenciado pelo FAO/ WHO - Food and Agriculture
Organization e World Health Organizatíon) conceitua pesticídas como quaisquer
substâncias utilizadas para prevenir, destruir, atacar, repelir ou controlar pragas,
incluindo espécies de plantas ou animais que devam estar presentes durante a
produção, estocagem, transporte, distribuição ou processamento de alimentos e
rações animais, ou que devam ser administradas a animais para o controle de
ectoparasitas. O termo inclui substâncias utilizadas como reguladores de
crescimento para plantas, desfoliantes, dessecantes, agentes promotores de
amadurecimento de frutos, inibidores de germinação e substâncias que são
aplicadas aos grãos antes e depois da colheita para evitar a deterioração do
alimento durante a estocagem e transporte. São excluídos desse conceito os
fertílizantes, nutrientes animais ou vegetais, aditivos alimentares e medicamentos
de uso veterinário. (CODEX, 1997).
12 Nos últimos anos, a luta mundial contra as pragas da agricultura e o controle
12
Nos últimos anos,
a luta mundial contra
as
pragas da agricultura e o
controle de vetores e zoonose tem se baseado no uso intensivo de pesticidas.
Dentre esses, os mais utilizados atualmente são os organofosforados, os
carbamatos e os piretróides, sendo estes últimos os que serão abordados no
presente projeto.
1.2 Piretróides
De acordo com GEBARA (1998), as piretrinas são extraídas de flores de
plantas do gênero Chrysanthemum; as propriedades destas plantas são
conhecidas pelo menos desde o primeiro século da nossa era, como
testemunhado pelos chineses (TESSIER, 1983), mas foram os comerciantes
armênios que a trouxeram do Cáucaso e de regiões vizinhas, para a Europa
Ocidental. O Piretro utilizado desde aproximadamente 400 anos no controle de
insetos, era conhecido como o "PÓ da Pérsia" (LHOSTE, 1966). Em 1880 o piretro
foi introduzido no Japão, que passou a exportá-lo em 1886, tendo sido, até a
Primeira Guerra Mundial, o principal produtor.
A estrutura química dos compostos biologicamente ativos do piretro, as
piretrinas naturais, tornou-se conhecida em 1924. A partir de então foi possível
produzir análogos sintéticos da piretrina. O primeiro destes piretróides a ser usado
em saúde pública foi a aletrina, sintetizada em 1949 por SCHECHTER et ai e logo
em seguida comercializada. A estabilidade dos piretróides não era então
satisfatória; podiam ser decompostos principalmente pela ação da luz. As
investigações prosseguiam de modo intenso em vários países, principalmente
Inglaterra e Japão (BRADBURY & COATS, 1989). O fenvalerato começou a ser
produzido no Japão em 1976. Na mesma época surgiu, na Inglaterra, a
permetrina. Foram estes os primeiros inseticidas piretróides fotoestáveis,
denominados de segunda geração. Em seguida vieram a cipermetrina e a
deltametrina. No fim da década de 1980 surgiram os inseticidas de terceira
geração, isômeros mais ativos de compostos já conhecidos, tais como: ciflutrina,
lambda-cialotrina.
13 1.3 Resíduos de pesticidas Resíduos de pesticidas são definidos como a presença destas substâncias
13
1.3 Resíduos de pesticidas
Resíduos de pesticidas são definidos como a presença destas substâncias
nos alimentos, grãos e outras culturas, resultantes do uso de pesticidas (CODEX,
1997). O termo inclui também qualquer derivado de um pesticida como os
produtos de conversão, metabólitos, produtos de reação e impurezas que possam
ser consideradas de importância toxicológica.
Como a presença de pesticidas nos alimentos revela tendências de
crescimento, medidas preventivas e de controle devem ser incrementadas.
Portanto é de máxima importância o estabelecimento de medidas eficientes
de controle para proteger a saúde da população. Entre estas medidas destaca-se
o monitoramento ou análises de vigilância, amplas e freqüentes, realizadas nos
alimentos, principalmente naqueles consumidos "in natura" como hortaliças e
frutas, a fim de detectar a presença de resíduos de pesticidas.
Para dar suporte ao monitoramento de resíduos de pesticidas, novas
técnicas e métodos são necessários para otimizar a qualidade da análise e
também facilitar o trabalho dos analistas.
1.4 Cromatografia
A cromatografia é uma técnica físico-química de separação de
componentes de uma mistura através da distribuição desses entre duas fases que
estão em íntimo contato. Uma das fases permanece estacionária, enquanto a
outra se move através dela; durante a passagem da fase móvel sobre a
estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de
tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase
estacionária, resultando em migrações diferenciais destes componentes. Desta
forma, o termo é empregado a várias técnicas de separação, baseadas na
partição da amostra entre uma fase móvel, que pode ser líquida ou gasosa, e uma
fase estacionária (KAZAKEIRCH Y. & McNAIR H., 2000).
14 Há vários tipos de técnicas cromatográficas e de acordo com COLLlNS et aI. (1993),
14
Há vários tipos de técnicas cromatográficas e de acordo com COLLlNS et
aI. (1993), são:
a) Cromatografia em papel: esta técnica separa os componentes de uma
mistura em função do deslocamento diferencial dos solutos arrastados por
uma fase móvel, sendo seletivamente retidos pela fase estacionária;
b) Cromatografia em camada delgada: os componentes de uma mistura são
separados através da migração diferencial sobre uma camada delgada de
adsorvente retido sobre uma superfície plana;
c) Cromatografia por adsorção: neste método a coluna cromatográfica
encontra-se recheada por um sólido (fase estacionária) que é capaz de
adsorver substâncias presentes na fase móvel (líquido);
d) Cromatografia por troca iônica: a fase estacionária encontra-se ionizada e o
soluto ao ser eluído na coluna modifica seletivamente a carga desta fase,
permitindo a separação das substâncias químicas;
e) Cromatografía de permeação em gel: é também conhecida como
cromatografía por exclusão, filtração ou cromatografia em peneira molecular
de difusão restrita. É um método simples, introduzido em 1960, que separa
substâncias, desde aquelas com massa molar abaixo de 1.000 Da/tons, até
vários milhões, variando-se apenas a matriz do gel da fase estacionária -
géis de dextrano (Sephadex®), géis de poliacrilamida (Biogel), géis de ágar
e agarose, dentre outros. As macromoléculas do gel apresentam ligações
cruzadas e insolúveis aos solventes (fase móvel); o gel apresenta-se
inchado com a fase móvel que carrega as substâncias a serem separadas.
O caráter da fase estacionária é que determina o movimento das moléculas
a serem separadas. Na cromatografia de permeação em gel a distribuição
homogênea entre a fase móvel e estacionária é muito intrincada, as
moléculas menores do soluto, penetram nos poros da fase estacionária e
ficam mais tempo retidas, enquanto as maiores moléculas não têm acesso
a estes poros, passando direto pela coluna.
15 f) Cromatografia por bioafinidade: baseia-se principalmente nas propriedades biológicas ou funcionais das espécies
15
f) Cromatografia por bioafinidade: baseia-se principalmente nas propriedades
biológicas ou funcionais das espécies que interagem, a substância a ser
analisada e a fase estacionária;
g) Cromatografia gasosa: baseia-se na separação de gases ou substâncias
volatilizáveis, estáveis termicamente, presentes na amostra. A separação
dos componentes se dá através da passagem de um gás inerte (fase móvel
- nitrogênio, hélio, hidrogênio ou argônio) pela coluna cromatográfica,
promovendo o arraste das diferentes substâncias sobre a fase estacionária.
Esta última apresenta um filme com determinada natureza química, que
confere a polaridade à coluna, promovendo através de interações entre as
moléculas da amostra e da fase estacionária a separação das substâncias
químicas. Quando a fase estacionária é um sólido (sílica, alumina, carvão
ou polímeros porosos) a separação baseia-se em mecanismos de
adsorção, nos quais os solutos são diferencialmente adsorvidos e
dessorvidos, retornando para a fase móvel, promovendo a separação. É
uma técnica rápída, de alto poder de resolução, com grande sensibilidade,
podendo-se obter resultados em concentrações de miligramas a
picogramas do princípio ativo; permite tanto a separação, como a
ídentificação e quantificação das substâncias presentes na amostra, desde
que comparada a um produto de referência comumente chamado de
padrão. Na cromatografia gasosa o detector é um dispositivo que
transforma num sinal elétrico adequado a variação da composição do gás
de arraste ao sair da coluna cromatográfica.
h) Cromatografía a líquido de alta eficiência (CLAE ou HPLC - high
performance
/iquid
chromatography):
esta moderna técnica de
cromatografia líquida é um importante membro de uma família de técnicas
de separação. Vários termos têm sido utilizados para denominar esta
técnica: alta pressão, alta velocidade, alto desempenho, alta resolução e
alta eficiência, sendo este último o mais aceito na língua portuguesa. A
partir dos anos 70 esse sistema passou por um avanço considerável,
principalmente por ser possível rechear colunas com partículas de pequeno
16 tamanho e equipamentos que trabalham em altas pressões. Esta técnica cromatográfica emprega pequenas colunas
16
tamanho e equipamentos que trabalham em altas pressões. Esta técnica
cromatográfica emprega pequenas colunas fechadas e recheadas de
materiais especialmente preparados para receber uma fase móvel que é
eluída em alta pressão; para isso uma válvula especial permite que a
amostra seja introduzida no sistema. Na HPLC a separação das
substâncias ocorre devido à afinidade das mesmas com a fase estacionária
ou fase móvel, isto é, está relacionada ao coeficiente de partição da
substância (McMASTER & MARVIN, 1994). Os detectores empregados
principalmente em análise de resíduos de pesticidas são: UV-Visível e
fluorescência.
i)
Eletroforese capilar (EC): o fenômeno denominado eletroforese é definido
como sendo a migração de espécies carregadas eletricamente, que ocorre
quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através
do qual uma corrente elétrica é aplicada (HEIGER, 1997). Esta técnica de
separação foi desenvolvida pelo químico Ame Tiselius para o estudo de
proteínas em soro (TISELlUS, 1930), e por este trabalho ele ganhou o
prêmio Nobel em 1948. Este método, denominado solução livre, era
bastante limitado devido à instabilidade do aparelho, e mais
significativamente, pelos efeitos de difusão e aquecimento gerados pelo
campo elétrico, os quais comprometiam a resolução (separação) dos
compostos. Estes efeitos foram minimizados com a introdução de suporte
(gelou papel) que ajudou a conter o movimento livre dos analitos, de forma
que o efeito da difusão fosse diminuído. Entretanto este sistema oferecia
um baixo nível de automação, tempos de análise longos e após a
separação a detecção era feita visualmente. A eletroforese capilar (EC) é
uma técnica que foi introduzida em 1981, por JORGENSON e LUKACS,
1981 e tem sido aceita cada vez mais, como um importante método
analítico. Em sua forma mais simples a EC é uma aproximação da técnica
original, descrita por Tiselius, porém emprega-se um tubo capilar,
preenchido com um eletrólito, conforme o próprio nome sugere (TAVARES,
1997).
17 1.5 Emprego da HPLC na analise de piretróides Na cromatografia líquida de alta eficiência
17
1.5 Emprego da HPLC na analise de piretróides
Na cromatografia líquida de alta eficiência é muito importante determinar
qual será o tipo de substância química a ser analisada e em que tipo de matriz ela
está presente, fatores importantes na escolha da metodologia de preparo da
amostra, extração, purificação e identificação e quantificação. A escolha do
equipamento (bomba, coluna e detector) de HPLC está relacionada às condições
de análise (matriz e pesticidas) e aos custos de compra (equipamento, solventes e
outros materiais), manutenção e treinamento.
Para uma otimização no emprego de HPLC em análise de resíduos de
pesticidas em alimentos (origem vegetal e animal), e amostras ambientais, é
necessário que ocorra um preparo adequado da matriz a ser analisada
Um levantamento bibliográfico sobre a utilização de HPLC para a
determinação de resíduos de pesticidas piretróides mostra vários métodos
analíticos para este fim. Os trabalhos encontrados mostraram que as fases
estacionárias mais utilizadas para a determinação de inseticidas piretróides em
diferentes matrizes são as fases reversas, em especial, colunas octadecil (C18).
Quanto às fases móveis, as mais utilizadas são as misturas de água (H 2 0),
acetonitrila (ACN) e metanol (MeOH), sendo que o detector mais utilizado é o uv-
Visível. (ZANELLA et aI. 1998; BISSACOT & VASSILlEFF 1997; GALERA et aI.
1996; CHEN & WANG 1995; DARWISH 1994; DEBON & SEGALEN 1989;
HADDAD et aI. 1989; BOTTOMLEY & BAKER 1984; BENGSTON et aI. 1983;
MUSZAT et ai 1986).
A cromatografia a líquido de alta eficiência pode ser uma técnica alternativa
para a detecção e quantificação de alguns pesticidas em especial os piretróides
que possuem alta massa molar em comparação com a maioria dos pesticidas.
18 1.6 Feijão Segundo informações recolhidas do na pagina eletrônica da EMBRAPA (MAGALHÃES, 2005), o
18
1.6 Feijão
Segundo informações recolhidas do na pagina eletrônica da EMBRAPA
(MAGALHÃES, 2005), o feijão é um alimento básico para o brasileiro, chegando a
ser um componente obrigatório na dieta diária da população. A média atual de
consumo de feijão é de 14,9 kg brasileiro/ano. A preferência do consumidor é
regionalizada e diferenciada principalmente quanto à cor e ao tipo de grão.
Em 2004, cerca de 86,1% da produção mundial desta leguminosa ficou
restrita a 5 países: Brasil, China, índia, México e Myamar, tendo o Brasil
contribuído com 23,6%. Estes dados colocam o Brasil como o primeiro produtor
mundial de feijão. Neste mesmo ano, a produção brasileira de feijoeiro comum foi
de 2,52 milhões de toneladas, em uma área colhida de 2,64 milhões de hectares,
composta por aproximadamente 20% do tipo preto e 80% de outras variedades,
em que o grupo comercial carioca participa com 90%.
o feijoeiro comum (feijão carioquinha) é cultivado ao longo do ano, na
maioria dos estados brasileiros, proporcionando constante oferta do produto no
mercado, sendo cultivado desde cultura de subsistência em pequenas
propriedades até altamente tecnificadas em cultivos empresariais. A Região Sul
ocupa lugar de destaque no cenário nacional, respondendo por 37% da produção,
seguida da Região Sudeste com 31 %, Região Nordeste com 16%, Região Centro-
Oeste com 13%, e da Região Norte com 3%.
Os grãos de feijão representam uma importante fonte protéica na dieta
humana dos países em desenvolvimento das regiões tropicais e subtropicais,
particularmente nas Américas (47% da produção mundial) e no leste e sul da
África (10% da produção mundial). O feijão apresenta componentes e
características que tornam seu consumo vantajoso do ponto de vista nutricional.
Entre eles citam-se o conteúdo protéico, o teor elevado de lisina, a fibra alimentar,
alto conteúdo de carboidratos complexos e a presença de vitaminas do complexo
B (WANDER, 2006).
19 o feijoeiro comum (Phaseo/us vu/garis L.) é a espécie mais cultivada entre as demais
19
o feijoeiro comum (Phaseo/us vu/garis L.) é a espécie mais cultivada entre
as demais espécies deste gênero. Considerando todos os gêneros e espécies
englobadas nas estatísticas da FAO, o feijoeiro comum envolve cerca de 107
países produtores em todo o mundo. O Brasil e o México são os maiores
produtores do gênero Phaseolus. Entretanto, a produção brasileira de feijão tem
sido insuficiente para abastecer o mercado interno, devido á redução na área
plantada, da ordem de 35%, nos últimos 17 anos.
Mesmo tendo este aumento de 48% na produtividade, estes dados ainda
resultam numa diminuição de 4% na produção, não sendo, ainda, suficiente para
atender a demanda.
o cultivo dessa leguminosa é bastante difundido em todo o território
nacional, no sistema solteiro ou consorciado com outras culturas. É reconhecida
como cultura de subsistência em pequenas propriedades, muito embora nos
últimos 20 anos, tenha havido crescente interesse de produtores que adotam
tecnologias avançadas, incluindo a irrigação e a colheita mecanizada.
Dependendo da região, o plantio de feijão no Brasil é feito ao longo do ano,
em três épocas, de tal forma que, em qualquer mês, sempre haverá produção de
feijão em algum ponto do país, o que contribui para o abastecimento interno
(MAGALHÃES, 2005).
o feijoeiro ocupa o 3° lugar em termos de área plantada com grãos no
Brasil (4,2milhões de ha), mas em termos de utilização de pesticidas, é o 10°
classificado em quantidade consumida (3.844 t de ingredientes ativos - i.a.- em
2003) e o 9° em valor gasto (US$ 85.600.000), superado por culturas como arroz,
1262 trigo e algodão, cultivadas em áreas bem inferiores. Assim, o consumo
relativo de pesticidas na cultura do feijoeiro é de 1,37 kg de i.a./ha, ocupando o
11 ° lugar, e o dispêndio relativo é de US$ 20,28 lha, ocupando o 12° lugar, em
2003. Comparando-se com diversas culturas, a do feijoeiro é superada, entre
outras, pela do tomate (40 kg i.a./ha), batata (25 kg i.a./ha), algodão (11 kg
i.a./ha), soja (3 kg i.a./ha), trigo (1,8 kg i .a./ha), milho (1,7 kg i.a./ha) e arroz (1,4 kg
i.a./ha) (ZUPPI et ai, 2006).
20 Os fungos, tanto no campo quanto no armazém, são os microorganismos responsáveis pelos principais
20
Os fungos, tanto no campo quanto no armazém, são os microorganismos
responsáveis pelos principais danos agrícolas ao feijão. Além dos fungos, outros
causadores de prejuízos em feijão armazenado são os insetos e a própria
atividade metabólica (respiração do grão). Nas condições tropicais os insetos têm
a maior importância. As estratégias de controle de campo e de armazém são
similares e dentre eles destacam-se os controles físicos, químicos e biológicos. De
acordo com SEBRAE (2006), o controle mais efetivo e economicamente mais
viável é o químico, feito com pestícidas organofosforados ou piretróides.
1.7 Validação
A validação de um método estabelece, através de estudos sistemáticos de
laboratório, que o método é adequado à finalidade, isto é, suas características de
desempenho são capazes de produzir resultados correspondentes às
necessidades do problema analítico (AOAC/FAO/IAEA/IUPAC,1999).
Os
parâmetros
de
validação
de
métodos
analíticos
envolvem:
Especificidade/Seletividade, Função de Resposta (gráfico analítico), Intervalo de
Trabalho (Faixa), Linearidade, Exatidão, Precisão, Limite de Detecção, Limite de
Quantifícação e Robustez (BRITO et ai, 2003). Esses parâmetros serão definidos
no decorrer do Item de Resultados e Discussão.
Determinado método é considerado validado se suas características
estiverem de acordo com os pré-requisitos estabelecidos. Portanto, existem
diferenças entre a execução de experimentos que determinam os diversos
parâmetros (coleta dos dados experimentais) e a validação. Essa deve avaliar a
relação entre os resultados experimentais e as questões que o método se propõe
a responder.
O objetivo da validação consiste em demonstrar que o método analítico é
adequado para o seu propósito.
21 A validação deve ser considerada quando se desenvolve ou efetua adaptação em metodologias já
21
A validação deve ser considerada quando se desenvolve ou efetua
adaptação em metodologias já validadas, inclusão de novas técnicas ou o uso de
diferentes equipamentos.
2.
OBJETIVO
Desenvolver, otimizar e validar técnica de cromatografia a líquido de alta
eficiência com detecção por espectrofotometria de absorção molecular na região
do ultra-violeta para determinação de resíduos de pesticidas da classe dos
piretróides em feijão.
3.
MATERIAIS E MÉTODO
3.1
Materiais
• Balão de fundo redondo de 250 mL
• Béqueres de várias capacidades
Erlenmeyer de 25 mL
Frasco Schott® de 250 mL
Tubo de vidro graduado com rolha esmerilhada de 10mL
• Proveta de 100, 200 e 500 mL
Pipetas volumétricas de várias capacidades
• Pipeta Pauster
Funil analítico de vários tamanhos
Baqueta de vidro
Pinça de metal
Haste de aço para Ultra-Turrax®
Cápsula de porcelana
22 Seringa de vidro graduada de 10 mL (para GPC) Microseringa de vidro graduada de
22
Seringa de vidro graduada de 10 mL (para GPC)
Microseringa de vidro graduada de 500 IJL sem ponta para HPLC
Microseringa de vidro graduada de 100 IJL
Pipetador automático de 2,0 mL com graduação de 100 IJL
Espátula
Estante para tubos
Balão Volumétrico de 10 e 100 mL
Funil para Filtração de Água
Membrana Filtrante de 0,45 IJm
Algodão
Coluna para HPLC Merck® RP 18 5IJm x 25 cm x 0,46mm
3.2
Reagentes
Sulfato de sódio PA
• Cloreto de Sódio PA
• Acetona RP
Acetato de etila RP
Cíclohexano RP
Resina BIO-BEADS® SX3 (Bio-Rad®) - para GPC
Acetonitrila grau HPLC
Água grau HPLC
23 3.3 Equipamentos UItra-Turrax® Mufla Dessecador de vidro Balança analítica Balança semi-analítica
23
3.3
Equipamentos
UItra-Turrax®
Mufla
Dessecador de vidro
Balança analítica
Balança semi-analítica
Evaporador rotativo
Ultra Som
Gerador de nitrogênio Peak Scientific®
Bidestilador de Ág ua
Sistema de Purificação de Água MilliQ®
Aparelhagem para cromatografia de permeação em gel (GPC)
Banho Maria a 3SoC
Cromatógrafo Líquido:
Bomba Varian® 9012;
Detector Varian® UV-Visível 90S0
Integrador Varian® 4400
Estabilizador de corrente
Cromatógrafo a gás Agilent® 6890
24 3.4 Preparo de Reagentes I Padrões 3.4.1 Solução de eluição para GPC (Acetato de
24
3.4
Preparo de Reagentes I Padrões
3.4.1
Solução de eluição para GPC (Acetato de etila : Ciclohexano 1:1)
Em balão volumétrico, misturar 500 mL de acetato de etila RP com 500 mL de
Ciclohexano RP e homogeneizar bem.
3.4.2 Solução da Fase Móvel (Acetonitrila: Água 8:2)
Em balão volumétrico misturar 800 mL de acetonitrila HPLC com 200 mL de
água deionizada, homogeneizar bem e deixar em ultra-som por aproximadamente 30
mino
3.4.3 Preparo do sulfato de sódio PA anidro:
Aquecer em mufla o sulfato de sódio por pelo menos 2 horas a 550°C, em
cápsula de porcelana. Deixar esfriar em dessecador. Armazenar em frasco bem
fechado dentro do dessecador.
3.4.4 Preparo do cloreto de sódio PA:
Aquecer em mufla o cloreto de sódio por pelo menos 2 horas a 550°C, em
cápsula de porcelana. Deixar esfriar em dessecador. Armazenar em frasco bem
fechado dentro do dessecador.
25 3.4.5 Preparo dos padrões analíticos: 3.4.5.1 Solução Estoque Pesar 100 mg do padrão primário
25
3.4.5 Preparo dos padrões analíticos:
3.4.5.1 Solução Estoque
Pesar 100 mg do padrão primário dos produtos, fenvalerato, fenpropatrina,
deltametrina, lambda-cialotrina, cipermetrina e bifentrina e permetrina, e dissolver em
100 mL de acetonitrila.
Os padrões primários apresentam purezas diferentes para cada um dos
produtos, portanto, a concentração da solução estoque não será igual para todos os
produtos. A concentração exata para cada produto na solução estoque esta
apresentada na Tabela 1.
Tabela 1 - Concentração dos piretróides na Solução Estoque.
Piretróides
Concentração ng/J
lL
Fenpropatrina
1021
Lambda-cialotrina
1001
Cipermetrina
998
Deltametrina
1043
Fenvalerato
1001
Permetrina
997
Bifentrina
997
3.4.5.2 Solução Intermediária
Pipetar 1,00 mL da solução estoque e transferir para balão de 100 mL
dissolvendo em acetonitrila:água (8:2). A concentração exata para cada produto na
Solução Intermediária esta apresentado na Tabela 2.
26 Tabela 2 - Concentração dos piretróides na Solução Intermediaria. Piretróides Concentração ng/lJL
26
Tabela 2 - Concentração dos piretróides na Solução Intermediaria.
Piretróides
Concentração ng/lJL
Fenpropatrina
10,21
Lambda-cialotrina
10,01
Cipermetrina
9,98
Deltametrina
10,43
Fenvalerato
10,01
Permetrina
9,97
Bifentrina
9,97
3.4.5.3 Soluções da curva analítica
Pipetar o volume da Solução Intermediária, correspondente a cada solução de
acordo com a Tabela 3 e transferir para balão de 10 mL completando com acetonitrila :
água (8:2).
Tabela 3 - Volume da Solução Intermediaria a ser pipetado para o preparo das
soluções da curva analítica.
Concentração da solução
Volume da solução
intermediaria
(119/IJL)
2,00
2mL
1,00
1 mL
0,75
0,75 mL
0,50
0,50 mL
0,25
250 ~L
0,05
50 ~L
0,02
20 ~L
27 3.4.6 Procedimento de Fortificação Adicionar o volume da Solução Intermediária, de acordo com a
27
3.4.6 Procedimento de Fortificação
Adicionar o volume da Solução Intermediária, de acordo com a Tabela 4 em 50
gramas da Amostra Testemunha, deixar em descanso por 15 mino
Tabela 4 - Volume da Solução Intermediaria a ser pipetado para os três níveis de
fortificação.
Nível de Fortificação (mg/kg)
Volume da Solução Intermediaria
0,01 mg/kg
50 IJL
0,10 mg/kg
0,5 mL
1,00 mg/kg
5,0 mL
3.5
METODOLOGIA ANALíTICA
3.5.1
Extração
Pesar em frasco de vidro tipo Schott® de 250 mL, 20 9 de amostra, previamente
triturada e homogeneizada. Utilize para isso uma balança semi-analítica com
resolução até 0,1 mg
Adicionar 36,5 g de água deionizada e homogeneizar agitando com a mão
Adicionar 100 mL de acetona
Homogeneizar no Ultra Turrax® por 3 minutos
Adicionar 17,5 9 de NaCI
Homogeneizar no Ultra Turrax® por mais 1 min
28 3.5.2 Partição • Adicionar 50 mL de solução acetato de etila : ciclohexano (1:
28
3.5.2 Partição
• Adicionar 50 mL de solução acetato de etila : ciclohexano (1: 1)
• Homogeneizar no Ultra Turrax® por 1 minuto
Deixar em repouso para separar as fases por aproximadamente 30 minutos
Coletar 100 mL da fase orgânica (sobrenadante)
• Filtrar em funil analítico com algodão coberto com 50 g de sulfato de sódio anidro
recolhendo em balão de fundo redondo de 250 mL
• Lavar o sulfato de sódio com
2 vezes
10 mL de solução Acetato de Etila
Ciclohexano (1 :1)
• Concentrar no evaporador rotativo a 40° C e 40 psi até aproximadamente o volume
de2 mL
Secar com fluxo suave de nitrogênio
• Ressuspender
em
10
mL
da
solução
eluente
do
GPC
(acetato
de
etila
ciclohexano (1:1))
3.5,3
Purificação em Coluna de GPC
Filtrar os 10 mL obtidos anteriormente em Na2S04 anidro com auxílio de funil
pequeno de vidro e algodão lavado com diclorometano
• Injetar 5 mL, da solução filtrada, no GPC com vazão de 5mUmin usando a solução
acetato de etila : ciclohexano (1:1) como eluente
Desprezar a solução eluida referente aos primeiros 18 minutos (90 mL)
Recolher em balão de 250 mL os próximos 110 mL, onde se encontram os
piretróides. Este volume corresponde a 22 minutos de tempo de eluição
Efetuar a limpeza do GPC eluindo a solução por mais 5 minutos (25 mL)
29 • Concentrar em evaporador rotativo, a 40°C e pressão de 55 psi, os 110
29
• Concentrar em evaporador rotativo, a 40°C e pressão de 55 psi, os 110 mL
recolhidos no GPC até um volume de aproximadamente 2 mL
Secar em N 2 com fluxo suave
Lavar o balão com 5 mL de acetonitrila : água (8:2) e recolher em tubo graduado
de 10 mL com tampa e boca esmerilhada
• Injetar 100 ~L no cromatógrafo a líquido com detector UV-Visível
3.5.4 Condições Cromatográficas
• Análise por HPLC
Cromatógrafo a Líquido Varian® formado pelos seguintes componentes:
Bomba 9012
Detector UV-Visível 9050
Integrador 4400
Coluna: Merck® RP 18 5IJm x 15 cm x 0,46 mm
Fluxo: 0,8 mL!minuto
Tempo de Corrida: 30 minutos
Tempo de estabilização: 2 minutos
Comprimento de onda: 212 nm
Range: 0,020 Aufs
Loop: 1 00 ~L
Fase Móvel: acetonitrila : água (8:2)
30 • Condições do integrador: Integrador 4400 Varian® Atenuação: 16 Velocidade do papel: 0,5 cm/min
30
• Condições do integrador:
Integrador 4400 Varian®
Atenuação: 16
Velocidade do papel: 0,5 cm/min
Inibição de integração: integrar após 11 min
Tipo de integração: Valley-to-Valley Baselines
I
Os tempos de retenção aproximados para todos os piretróides estudados
aparecem na Tabela 5:
Tabela 5 - Tempo de retenção médio dos piretróides
Piretróide
Tempo de
Retenção (min)
Fenpropatrina
11,9
Lambda-cialotrina
12,8
Cipermetrina
13,3
Deltametrina
14,0
Fenvalerato
14,7
Trans-permetrina
16,8
Cis-permetrina
19,5
Bifentrina
24,3
31 • Análise por GC-ECD Injetor: Modo: Slitless Temperatura: 230°C Fluxo da purga: 60 mLlmin
31
• Análise por GC-ECD
Injetor:
Modo: Slitless
Temperatura: 230°C
Fluxo da purga: 60 mLlmin
Tempo de purga: 0,75 min
Tipo do gás: Nitrogênio
Vol. Injeção: 1 ~LL
Coluna:
SPB-20; 30m; 0,32 mm ID; Filme 0,25 ~lm (Supelco® 2-4088)
Fluxo: 1,0 mLlmin
Detector:
~lECD
Temperatura: 300°C
Fluxo combinado (make-up+coluna): 60 mLlmin
Tipo de gás: Nitrogênio
Forno:
Temperatura inicial: 100°C
Tempo de espera: 1 min
Rampa: 25 °C/min
Temperatura 2: 260°C
Rampa: 2°C/min
Temperatura 3: 280°C
Tempo de espera: 10 min
32 3.5.5 Fórmula para cálculo da concentração de piretróide na amostra (R) c*V * A
32
3.5.5
Fórmula para cálculo da concentração de piretróide na amostra (R)
c*V * A
m*ViI*A p
* r
R =
~
onde:
I
.
V*V
*v
l =.f
ex
1'2
.
VIII *V IO
5*142,5*10
f
=
100 * 5
f
= 14,25
Onde:
c =concentração do padrão (llg/IJL)
V, = volume do padrão injetado (IJL)
Vil = volume da amostra injetada (IJL)
A j =Área da amostra (uA)
Af' =Área do padrão (uA)
m =massa pesada da amostra (g)
VI
=volume final obtido para injeção no cromatógrafo (mL)
= volume da solução de extração (mL)
V x
=volume utilizado (mL) do extrato (V ex )
VIII
= volume obtido após ressuspensão de VR1 para
injeção na cromatografia de
VII}
permeação de gel
(mL)
VI':; =volume injetado na cromatografia de permeação de gel (mL)
33 3.5.6 Pesticidas a serem estudados, (ANVI5A, 2004); Permetrina a) Ingrediente ativo ou nome comum:
33
3.5.6
Pesticidas a serem estudados, (ANVI5A, 2004);
Permetrina
a) Ingrediente ativo ou nome comum: PERMETRINA
b) Sinonímia: MP 79; NIA-33297; WL 43479; PP557
c) N° CAS: 52645-53-1
d) Nome químico: 3-fenoxibenzil (1 RS,3RS;1 RS,3SR)-3-(2,2-diclorovinil)-2,2-
dimetilciclopropanecarboxilato
e)
Fórmula bruta: C 21 H 2ü CI 2 0 3
f)
Fórmula estrutural:
CH
g) Grupo químico: Piretróide
h) Classe: Inseticida
i) Classificação toxicológica: Classe III
j) Modalidade de emprego: aplicação foliar nas culturas de algodão, arroz, café,
couve, couve-flor, fumo, milho, repolho, soja, tomate e trigo.
Aplicação em arroz, fumo, milho e trigo armazenado.
Aplicação no controle de formigas, conforme aprovação em rótulo e bula.
Deltametrina
a) Ingrediente ativo ou nome comum: DEL TAMETRINA
b) Sinonímia: NRDC 161; RU-22974
c) N° CAS: 52918-63-5
d) Nome químico: (S)-a-ciano-3-fenoxibenzil (1 R,3R) -3-(2,2-dibromovinil)- 2,2-
dimetilciclopropanecarboxilato
e)
Fórmula bruta: C22H19Br2N03
f)
Fórmula estrutural:
35 Cipermetrina a) Ingrediente ativo ou nome comum: CIPERMETRINA b) Sinonímia: WL 85871 c) N°
35
Cipermetrina
a) Ingrediente ativo ou nome comum: CIPERMETRINA
b) Sinonímia: WL 85871
c) N° CAS: 52315-07-8
d) Nome químico: (RS)-a-ciano-3-fenoxibenzil (1 RS,3RS; 1RS,3SR)-3-(2,2-
diclorovinil)-2,2-dimetilciclopropane carboxilato
e) Fórmula bruta: C 22 H 1 9CI 2 N03
f) Fórmula estrutural:
3
CH
O Ú
CI '" C =CH --,-,~Co'CH O
/ I
-;
I
Cl/
CH
CtA
g) Grupo químico: Piretróide
h) Classe: Inseticida
i) Classificação toxicológica: Classe II
j) Modalidade de emprego: aplicação foliar nas culturas de algodão, amendoim,
arroz, batata, café, cebola, ervilha, feijão, feijão-vagem, fumo, melancia, milho,
pepino, repolho, soja e tomate.
Aplicação no solo na cultura de fumo.
Fenpropatrina
a) Ingrediente ativo ou nome comum: FENPROPATRINA
b) Sinonímia: S-3206
c) N° CAS: 39515-41-8
d) Nome químico: (RS)-alfa -ciano-3-fenoxibenzil 2,2,3,3-
tetrametilciclopropanecarboxilato
e) Fórmula bruta: C22H23N03
f) Fórmula estrutural:
36 g) Grupo químico: Piretróide h) Classe: Inseticida e acaricida i) Classificação toxicológica: Classe II
36
g) Grupo químico: Piretróide
h) Classe: Inseticida e acaricida
i) Classificação toxicológica: Classe II
j) Modalidade de emprego: aplicação foliar nas culturas de algodão, café, cebola,
citros, crisântemo, feijão, gladíolo, maçã, mamão, milho, morango, repolho, rosa,
soja e tomate.
Lambda-Cialotrina
a) Ingrediente ativo ou nome comum: LAMBDA-CIALOTRINA
b) Sinonímia: Cyhalothrin; Cyhalothrin K; Clocythrin; PP 321
c) N° CAS: 91465-08-6
d) Nome químico: (S)-a-ciano-3-fenoxibenzil (Z)-(1 R,3R)-3-(2-cloro-3,3,3-trifluoro
prop-1-enil)-2,2-dimetilciclopropanecarboxilato e (R)-aciano-3-fenoxibenzi/(Z)-
(1 S,3S)-3-(2-c1oro-3,3,3-trifluoroprop -1-enil)-2,2-dimetilciclopropanecarboxilato
e) Fórmula bruta: C23H19CIF3N03
f) Fórmula estrutural:
g) Grupo químico: Piretróide
h) Classe: Inseticida
i) Classificação toxicológica: Classe 111
37 j) Modalidade de emprego: aplicação foliar nas culturas de algodão, amendoim, arroz, batata, café,
37
j) Modalidade de emprego: aplicação foliar nas culturas de algodão, amendoim,
arroz, batata, café, cebola, citros, couve, feijão, fumo, milho, soja, tomate e trigo.
Bifentrina
a) Ingrediente ativo ou nome comum: BIFENTRINA
b) Sinonímia: -
c) N° CAS: 82657-04-3
d) Nome Químico: 2-metilbifenil-3-ilmetil (Z)-(1 RS,3RS)-3-(2-cloro-3,3,3-
trifluoroprop-1-enil)-2,2-dimetilciclopropane carboxilato
e)
Fórmula bruta: C23H22CIF302
f)
Fórmula estrutural:
-",
"
g)
Grupo químico: Piretróide
h)
Classe: Inseticida e acaricida
i)
Classificação toxicológica: Classe II
j)
Modalidade de emprego: aplicação foliar nas culturas de algodão, citros, couve,
crisântemo, feijão, fumo, manga, mamão, melão, pepino, rosa soja, tomate e uva.
Aplicação em arroz, milho e trigo armazenado.
Aplicação no solo na cultura de cana-de-açúcar.
Aplicação no controle de formigas, conforme aprovação em rótulo e bula.
38 3.5.7 Amostras analisadas A amostra usada para os estudos de validação não recebeu aplicação
38
3.5.7 Amostras analisadas
A amostra usada para os estudos de validação não recebeu aplicação de
nenhum pesticida. Antes do inicio dos estudos a amostra foi analisada pelo
método DFG-S19 (DFG, 1997) com a utilização da técnica de cromatografia a gás
com detector de captura de elétrons (GC-ECD). Nestes experimentos não foi
detectado nenhum resíduo de pesticida piretróide.
Foram analisadas 48 amostras de feijão que foram adquiridas no comércio
varejista da cidade de São Paulo durante o ano de 2005, coletadas
aleatoriamente.
4.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1
Cultura Estudada
Os critérios para a escolha da cultura estudada seguiram dois princípios:
• As culturas mais sujeitas à aplicação de pesticidas piretróides,
• A maior porcentagem de comercialização destas culturas no país.
Desta forma foi escolhido o feijão para ser estudado, pois além do grande
consumo deste produto pelos brasileiros, ele também apresenta registro para a
maioria os piretróides estudados, conforme é mostrado na Tabela 6, com
apresentação da modalidade de emprego, o limite máximo de resíduo e o intervalo
de segurança.
39 Tabela 6 - Limites máximos de resíduo permitido dos piretróides estudados, na cultura de
39
Tabela 6 - Limites máximos de resíduo permitido dos piretróides estudados, na
cultura de feijão (ANVISA, 2004).
Pesticida
Modalidade de
LMR**
Intervalo de
Piretróide
emprego *
(mg/kg)
segurança
Permetrina
Sem registro
Cipermetrina
foliar
0,05
14 dias
Fenvalerato
Sem registro
Fenpropatrina
foliar
0,01
14 dias
Deltametrina
foliar
0,2
16 dias
armazenado
0,2
30 dias
Lambda-cialotrina
foliar
0,05
15 dias
Bifentrina
foliar
0,02
20 dias
*Limite Máximo de Resíduo Permitido
4.2
Otimização das Condições Cromatográficas
4.2.1
Comprimento de onda do detector UV-Visível
Os comprimentos de onda utilizados para a quantificação dos piretróides
foram determinados a partir dos espectros de absorção molecular na região do
UV-vis obtidos com um espectrofotômetro entre 190 até 400 11m, com os padrões
em solução de acetonitrila:água (8:2) com aproximadamente 1,0 I1ghlL de
concentração. O comprimento de onda que apresentou maior absorção para a
maioria dos piretróides foi o 208 11m. Porém em 208 11m o cromatograma
apresenta uma grande variação da linha de base, o que dificulta a determinação
dos piretróides. Portanto, foram feitas injeções no cromatógrafo de um coquetel de
piretróides em diferentes comprimentos de onda entre 208 a 215 11m, obtendo
melhor resultado em 212 11m, e este foi o comprimento de onda escolhido para a
utilização no método.
40 4.2.2 Fase Estacionária Através de um levantamento bibliográfico, se observou que na maioria dos
40
4.2.2 Fase Estacionária
Através de um levantamento bibliográfico, se observou que na maioria dos
métodos empregados para análise de piretróides por HPLC, se utiliza fase
estacionária do tipo reversa, em especial colunas C 18. Devido também à
disponibilidade, foi utilizada a coluna LiChrospher® 100 RP-18 (5 ~lm) 250 x 4 mm,
do fabricante Merck@
4.2.3 Fase Móvel
Também de acordo com o levantamento bibliográfico, quando se utiliza
coluna C 18 a fase móvel mais empregada é a mistura de acetonitrila : água, ou
metanol : água.
Foram realizados testes com a mistura metanol : água, porém, devido ao
comprimento de onda utilizado ser muito baixo, a variação da linha de base
(ruído), quando se utiliza esta fase móvel é muito alta, o que atrapalha na
identificação do piretróides.
Optou-se então pela mistura acetonitrila : água e estudada a composição da
mistura. Foi observada a separação e a apresentação dos picos variando a
composição nas seguintes proporções:
ACN:H 2 0 (70:30), ACN:H 2 0 (75:25), ACN:H 2 0 (80:20) e ACN:H 2 0 (85:25)
Observou-se que a composição (80:20) era a que apresentava melhor
resultado na resolução dos picos, decidiu-se manter esta composição
4.2.4 Fluxo da fase móvel
Os estudos da composição da fase móvel foram realizados com fluxo de 1
mLlmin e, após ter sido escolhida a melhor composição, foi feito um estudo do
melhor fluxo. Os fluxos estudados, injetando-se o coquetel de piretróides, foram os
seguintes:
~NSTnUTO DE QUi~r:Ir:;f' U. luetsic2de d'2. Y;'l P;l\l/'l 41 0.5 mLlmin 1.0 mLlmin 0.6 mLlmin
~NSTnUTO DE QUi~r:Ir:;f'
U. luetsic2de d'2. Y;'l P;l\l/'l
41
0.5 mLlmin
1.0
mLlmin
0.6 mLlmin
1.1
mLlmin
0.7 mLlmin
1.3
mLlmin
0.8 mLlmin
1.5
mLlmin
Em todos os fluxos o coquetel de piretróides apresentou o mesmo perfil, ou
seja, apareceram 7 picos característicos. O fluxo escolhido foi 00,8 mLlmin, visto
que apresentou melhor separação e um tempo não muito longo de corrida.
Porém, mesmo depois de se otimizar as condições da fase móvel e do
fluxo, para alguns picos a resolução não era adequada para conduzir uma boa
determinação quantitativa, ou seja, superior a 1,5 (Mc MA8TER, 1994). Optou-se
em separar os piretróides em dois grupos e desta forma obteve-se uma resolução
ideal adequando a separação dos picos para não prejudicar a determinação
quantitativa.
A Figura 1 apresenta o cromatograma antes da separação dos piretróides
em dois grupos, onde se observa uma baixa resolução dos picos, o que não
prejudica a determinação qualitativa visto que os tempos de retenção de cada
piretróide são bem definidos, no entanto a determinação quantitativa fica
prejudicada, em especial para a quantificação de cipermetrina na presença de
lambda-cialotrina e vice-versa, lambda-cialotrina na presença de deltametrina e
vice-versa e de deltametrina na presença de fenvalerato e vice-versa. As Figuras 2
e 3 mostram os piretróides separados em dois grupos Figura 2 (Coq. P1)
fenpropatrina, cipermetrina, fenvalerato e bifentrina e na Figura 3 (Coq. P2),
lambda-cialotrina, deltametrina, trans-permetrina e cis-permetrina, estes
apresentam uma resolução segura para a determinação quantitativa.
42 !! e ; 1l.e5 3io@ t2.29 t6.72 c CH- ?S- t. .~. l1ETHCD e,
42
!!
e
;
1l.e5
3io@
t2.29
t6.72
c
CH-
?S-
t.
.~.
l1ETHCD
e,
-: .669
l
l
.e~
39~lBe 62
::
:2 .e2
2.23766
62
~ .3~3
!3 .29
2Bge22 62
3
5 ,!~e9
!
22~~~e 62
.2~e
~
') .et.
t17387
63
~
~
.6'1
.3e .ege
1t .72
15se871
6t
-:
1
1562873
61
3e .33t
~9
e
! ~ .7'!2
759t.52
61
2~
16
~!52?t.9
TQT~L
~ee
Cromatograma
com todos
os piretróides juntos
em
uma
mesma
Figura
1
solução.
43 CHANNEL A INJECT 41-013-013 137:136:07 SrORED TO BIN n 10 C c I l
43
CHANNEL
A
INJECT
41-013-013
137:136:07
SrORED
TO
BIN
n
10
C
c
I
l
0
11
.93
13.38
---':::=======:-14 .74
r
~
24.32
ER
0
DATA SAUED
TO
BIN
lt
10
PIRETROIOES
41-00-1313
07: 06: 0'7
CH= "A"
PS'"
1
.
F[LE
1
.
r'lETHOD
0.
RUN
10
INDEX
10
BIN
113
PEAl<n
AREAl
RT
AREA
BC
16.01
11
.93
1137591
61
2
28
847
13.38
193867
62
3
21 .873
14.74
146998
63
4
33.27
24.32
223588
61
TOTAL
100
672044
Figura
2
-
Cromatograma
da
Solução
Coq.
P1,
fenpropatrina,
cipermetrina,
fenvalerato e bifentrina.
44 CHANNEL A INJECT 01-00-00 05:52:27 STORED TO BlN U 20 C lI 0 ~==.==--
44
CHANNEL
A
INJECT
01-00-00
05:52:27
STORED
TO
BlN
U
20
C
lI
0
~==.==--
12.58
1374
Ç".22
16.36
,,17.78
18.96
0.94
ER
0
DATA
SAVED
TO
BIN
tt
20
P I RETRO
I m:s
01-00-00
05:53:27
CH=
.• A"
PS=
1.
FILE
1
.
11ETHOD
0.
RUN
21
TNDEX
21
BIN
20
PEAKU
AREA%
RT
AREA
BC
1
23.194
12.58
172421
62
2
23916
13.74
177794
09
3
25.23
16.36
187558
09
4
27 .66
18.96
205625
09
TOTAL
100
743él98
-.-
•.
_--.~. ~--
Figura
3
-
Cromatograma da Solução Coq. P2, lambda-cialotrina, deltametrina,
trans-permetrina e cis-permetrina.
./
As Tabelas 7 e 8 apresentam as resoluções calculadas para cada pico nos
cromatogramas das Figuras 2 e 3, A resolução foi maior que 1,5 para todos os
picos e desta forma é possível à determinação quantitativa para todos os
piretróides desde que não estejam presentes as seguintes combinações de
piretróides em uma mesma amostra: cipermetrina na presença de lambda-
cialotrina, lambda-cialotrina na presença de deltametrina e deltametrina na
presença de fenvalerato.
45 Tabela 7 - Valores de resolução dos picos para solução CoqP-1 0,02 ng/lJL Piretróides
45
Tabela 7 - Valores de resolução dos picos para solução CoqP-1 0,02 ng/lJL
Piretróides
Resolução
Fenpropatrina/Lambda-cialotrina
1,6
Lambda-cialotrina/Fenvalerato
1,5
Fenvalerato/Bifentrina
8,5
Tabela 8 - Valores de resolução dos picos para solução CoqP-2 0.02 ng/lJL
Piretróides
Rs
Cipermetrina/Deltametrina
2,0
Deltametrina/Cis-permetrina
3,7
Cis-permetrinalTrans-permetrina
3,3
4.2.5 Condições do integrador
As condições do integrador foram estabelecidas para que se tenha uma
melhor visualização do cromatograma e repetitividade na integração dos picos. As
condições são as apresentadas no Item 3.5.5.
4.3 Linearidade, faixa e função de resposta
A linearidade refere-se à capacidade do método de gerar resultados
linearmente proporcionais à concentração do analito, enquadrados em faixa
analítica especificada. Esse parâmetro pode ser demonstrado pelo coeficiente de
correlação do gráfico analítico de calibração (BRITO et ai, 2003).
Foram feitas curvas analíticas de calibração para cada piretróide entre as
concentrações de 0,02 a 2,00 ng/!-LL, cobrindo toda a faixa de resposta obtida nos
três níveis de fortificação estudados. As Figuras 4, 5, 6 ,7 ,8 ,9 10 e 11
apresentam as curvas obtidas a partir de 3 injeções consecutivas de 8
concentrações de soluções-padrão injetadas em ordem crescente de suas
concentrações.
46 y :::: 1E+06x - 34858 BIFENTRINA R 2 :::: 0,997 2,5 - • 2,0
46
y :::: 1E+06x - 34858
BIFENTRINA
R 2 :::: 0,997
2,5
-
2,0
<&>
o
-
-
-
1,5
-
<
:J
<
1,0
w
o::
,<
0,5
-
0,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
CONCENTRAÇÃO (ng/uL)
Figura 4 - Curva analítica de calibração da bifentrina.
y :::: 568232x - 16666
FENPROPATRINA
R 2 :::: O,997
1,2
--
0,9
-
<&>
o
-
-
0,6
-
<
-
:J
0,3
-
<
w
o::
,<
0,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
CONCENTRAÇÃO (ng/IJL)
Figura 5 - Curva analítica de calibração da fenpropatrina.
47 y =737219x - 15500 R 2 = O,998 FENVALERATO 1,6 - ID 1,2 o
47
y =737219x - 15500
R 2 = O,998
FENVALERATO
1,6
-
ID
1,2
o
~
-
-
<1:
-
0,8
::J
<1:
w
~
0,4
-
-<1:
0,0
~------------ ----
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
CONCENTRAÇÃO (ng/~L)
Figura 6 - Curva analítica de calibração do fenvalerato.
ALFA-CIPERMETRINA
y =958593x - 16564
R 2 =0,998
2,5
-
2,0
ID
1,5
-
o
~
-
-
1,0
<1:
-
::J
<1:
w
0,5
~
'<1:
0,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
CONCENTRAÇÃO (ng/~L)
Figura 7 - Curva analítica de calibração da cipermetrina.
48 DELTAMETRINA y =878162x + 5506 R2 =0,999 2,0 - 1,5 - tO o T""
48
DELTAMETRINA
y =878162x + 5506
R2 =0,999
2,0
-
1,5
-
tO
o
T""
~
1,0
~
0,5
0,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
CONCENTRAÇÃO (ng/uL)
-
--
----
---------
Figura 8 - Curva analítica de calibração da deltametrina.
y =928117x + 5913
TRANS-PERMETRINA
R 2 =0,999
2,0
-
1,5
-
'b
--
T""
<
-
~
1,0
<
w
l:t:
,<
0,5
0,0
O
0,5
1
1,5
2
2,5
CONCENTRAÇÃO (ng/IJL)
Figura 9 - Curva analítica de calibração da trans-permetrina.
49 CIS-PERMETRINA y =941610x - 5687 R 2 =O,999 2,0 - 1,5 <D o -
49
CIS-PERMETRINA
y =941610x - 5687
R 2 =O,999
2,0
-
1,5
<D
o
-
"r""
1,0
<'
-
::::l
0,5
0,0
.
O
0,5
1
1,5
2
CONCENTRAÇÃO (ng/~L)
----
. ----
---
Figura 10 - Curva analítica de calibração da cis-permetrina.
LAMBIDA-CIALOTRINA
y =880077x + 7453
R 2 == 0999,
2,0
<D o
1,5
"r""
--
«
-
::::l
1,0
«
w
a:::
0,5
0,0
-
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
CONCENTRAÇÃO (ng/~L)
Figura 11 - Curva analítica de calibração da lambda-cialotrina.
BiBLiOTECA ~~~STiTUTOi)E QUj,~1iC~f~ Unlv.er~;idade de São Paulo 50 Podemos observar na Tabela 9 que todos
BiBLiOTECA
~~~STiTUTOi)E QUj,~1iC~f~
Unlv.er~;idade de São Paulo
50
Podemos observar na Tabela 9 que todos os piretróides apresentaram bons
coeficientes de correlação, demonstrando uma boa linearidade de resposta nas
condições cromatográficas especificadas, o que demonstra a habilidade do
método em obter os resultados de teste, proporcionais a concentração dos
piretróides estudados, na faixa de trabalho pretendida.
Tabela 9 - Dados da equação linear e coeficiente de correlação das curvas
analíticas de calibração.
r z
Piretróide
A /10 4
8/10 4
B /10 4
8
/ 10 4
Bifentrina
-3
3
116
3
0,997
Fenpropatrina
-2
1
57
1
0,997
Fenvalerato
-2
1
74
1
0,998
~
Cipermetrina
-2
1,7
96
2
0,998
Deltametrina
0,6
1
88
1
0,999
~
Trans-Permetrina
0,6
0,9
93
1
0,999
Cis-Permetrina
-0,6
0,9
94
1
0,999
Lambda-Cialotrina
0,7
2
88
2
0,999
Nota: Y = a+ bx, A = coeficiente linear, B = coeficiente angular, 8 = desvio padrão
,-2 = coeficiente de correlação.
4.4 Discussão do Desenvolvimento da metodologia de extração e
purificação da amostra:
4.4.1
Extração
A técnica de extração utilizada foi a mesma utilizada no método DFG-S 19
(DFG, 1997) com modificações, (SPECHT, 1995) sendo utilizados apenas 100 mL
de acetona em 20 g de amostra. (Descrito em 3.5.1.)
51 4.4.2 Partição A técnica de partição também foi a mesma utilizada no método DFG-S
51
4.4.2 Partição
A técnica de partição também foi a
mesma utilizada no método DFG-S 19
com modificações (SPECHT, 1995), porém utilizando apenas 50 mL de acetato de
etila : ciclohenxano (1: 1) (Descrito em 3.5.2.)
4.4.3 Purificação
A técnica de purificação estudada foi a cromatografia de permeação em gel
(GPC) também utilizada no método DFG-S19 com modificações (SPECHT, 1995)
(Descrito em 3.5.3.).
Os testes preliminares mostraram que esta técnica proporcionava a
purificação adequada da amostra testemunha, o que foi posteriormente
confirmado em testes com amostras fortificadas. Observou-se uma boa
recuperação nos testes preliminares, de modo que a validação da metodologia foi
realizada utilizando esta técnica de purificação.
4.5
Validação do método
O método foi validado em três níveis de fortificações diferentes, 0,01 mg/kg,
0,10 mg/kg e 1,0 mg/kg.
Os piretróides apresentam vários isômeros, e estes muitas vezes são de
difícil separação quando são sintetizados. A cromatografia liquida de fase reversa
nos revelou uma ótima possibilidade de análise dos piretróides por apresentarem,
na forma que foi realizada, a separação da maioria dos produtos, apresentando
apenas um pico característico da molécula, com exceção da permetrina que
apresentou suas formas CIS e TRANS.
Todo o processo de validação e apresentação dos resultados foi feito
calculando as concentrações dos isômeros da permetrina separadamente.
Portanto, os resultados para a permetrina foram calculados para as suas formas
eis e trans.
52 Outra modificação necessária para a validação do método foi a necessidade de separar os
52
Outra modificação necessária para a validação do método foi a
necessidade de separar os piretróides em dois grupos, intercalando os tempos de
retenção, isto aconteceu, como já discutido em 5.3.3., devido a baixa resolução
dos picos, o que prejudica a determinação quantitativa.
Os cromatogramas nos três níveis de fortificação estudados são mostrados
nas Figuras 12,13,14,15,16 e 17.
INJECT
4'-0~-013 136:37:05
STORED
TO
BIN
U
CHANNEL
A
C
-----=--=--_-_-o -------:-=:1
.::.=J
-~====
-
.
.=J
1I
0
13.34
14. /0
24 .2~
[R0
DATA
SAVEO
TO
BIN
U
9
CH=
-A·
PS=
,.
PIRETROIDES
BlN
<j
9
RUN
lNDEX
'I
0.
fILE
1
.
~lETHOO
BC
RT
AREA
PEAKll
AREAZ
113691
61
11
.9
I (;, .25~3
\3.34
~0S9\ 61
2
31
.313
\ 1944
61
\ 4
.7
3 1B .164
2253?-
61
4 34 .265
Z1 .22
(,575>3
TOTI\L
1130
--
Figura 12 - Cromatograma de amostra fortificada em 0,01 mg/kg com o Coq P1.
53 CHANNEL A INjEC1 06:32:44 STOREU TO BIN n 7 ~0-00-00 t .===:J --===. ---
53
CHANNEL A
INjEC1
06:32:44
STOREU
TO BIN
n
7
~0-00-00
t
.===:J
--===.
---
----------,
11
0
13.77
19.(;15
ER
0
DATA SAVED TO BIN
U
7
CH=
. A"
ps=
I.
P ! RElIW !
DES
~0-00-00 06:32:44
INOEX
7
BtN
7
fILE
1.
t1ETHüO
0.
RUN
7
PEAKU
riflEAI.
RT
AREA BC
28.156
12.58
16481
61
2
24.081
13.77
14096 61
3
24.742
16.4
14483 61
-4
23.02
19.05
13475 61
TOTAL
1i/l0.
')8535
-
~--
Figura 13 - Cromatograma de amostra fortificada em 0,01 mg/kg com o Coq P2.
CHANNEL A INJErT 41-~0-00 09:00:28 STORED TO RIN U 14 [ --- ~ =======-==========================:::::J r:-
CHANNEL A
INJErT
41-~0-00 09:00:28
STORED
TO
RIN
U
14
[
---
~
=======-==========================:::::J
r:-
I
li
13
~1.96
~---=---
13.42
-=::=>
14 .78
(".38
ER
0
DATA
SAVED
TO
BIN
li
14
CH=
-A"
PS=
I.
PIRETROIDES
RUN
I NUl::X
14
51N
14
F I LE
1.
r'lETHOO
0.
14
RT
AR!::A
BC
PEAKll
ARF.AI.
15.766
11
.96
80279
61
2
28.713
13 .42
146205
62
3
21 .365
14.78
108790
63
34.155
2438
173915
61
4
TOTAL
H10.
509189
--_
_---
Figura 14 - Cromatograma de amostra fortificada em 0,10 mg/kg com o Coq P1.
55 CHANNEL A lNJEC1 00-~~-00 06:31:59 STOHED TO BIN n 10 ~ ----============:====== c:= ---
55
CHANNEL
A
lNJEC1
00-~~-00 06:31:59
STOHED
TO
BIN
n
10
~ ----============:======
c:=
---
"--
=
l
========================:"=:":':==============:J=:::J
[.".
----.=-
C::==.
_
12.75
~
13.';3
~
1&.61
C~S3
r-=~
19.2&
ER
0
DATA
SAVED
TO
BlN
U
I~
PIRETROIDES
013-00-130
06: 31: 59
CH=
• A·
PS=
1.
fILE
I.
1'IETHOD
\3.
RUN
10
INDEX
10
B IN
10
PEAKU
AREAY.
RT
AREA
BC
1 .342
10.4
71368
61
2
24.56
lZ.'75
129370
62
3
7.4.479
13.93
12l:l943
63
4
23.785
16.61
125289
63
')
19.26
136079
?~.H34
61
TOTAL
100.
526749
----
-
Figura 15 - Cromatograma de amostra fortificada em 0,10 mg/kg com o Coq P2.
56 CHANNEL A INJECT STORED TO B1N n 42-~0-130 0e:02: 18 Z~ L_~c=.:~=-===~~~~=~'~~ ~ _~~
56
CHANNEL
A
INJECT
STORED
TO
B1N
n
42-~0-130 0e:02: 18
Z~
L_~c=.:~=-===~~~~=~'~~
~
_~~
.--'
I
i
0
113 .56
, 1.98
'"------- ----
.:-::============'=--
13.42
14.78
6.56
L_----===========~
r--
24.41
ER
0
DATA SAVED
TO
BtN
tt
25
138: 02: 113
CH=
" A"
PIRETROlDES
42-00-00
PS=
1
.
fiLE
t.
1'IETHOD
25
0.
RUN
2S
INDEX
L)
BtN
PEAKn
AREAl:
RT
AREA
BC
1
0.232
10.56
15608
6l:
2
13.161
11
.98
884507
08
.3
2Y.I'l8
1342
1962277 66
23,429
, 4.78
15745613 66
4
5
13.023
16.56
1551
67
6
33 .957
24 .41
22821133
61
TOTAL
6720614
Figura 16 - Cromatograma de amostra fortificada em 1,00 mg/kg com o Coq P1.
57 CHANNl:.L A INJECr 00-0~-00 05:26: 11 STÜRED 10 BIN U 8 [ ---------=:-::: :::::.====================
57
CHANNl:.L
A
INJECr
00-0~-00 05:26: 11
STÜRED
10
BIN
U
8
[
---------=:-::: :::::.====================
c:::=:.
=-
[[
0
133
12.73
C===========:::::==::::1:3:::::.=9="l=_
16.59
~
19.23
ER
0
DA1A SAVEU 10
BIN
I
8
P I RETRO UH::S
00-00-013
0S: 27: 11
CH=
• A'
Ps=
I
.
FILE
\
.
HETHOD
0.
RUN
'9
INOEX
9
BIN
8
PEAKtI
AREM:
RT
AREA BC
24 .266
12.73
1680870 62
2
23 .898
13.9
1655318 63
3
25.787
16.59
1786220
61
4
26.1.149
19.23
\804329
&1
TOTAL
6926737
Figura 17 - Cromatograma de amostra fortificada em 1,00 mg/kg com o Coq P2.
58 4.5.1 Espec i ficidade/Seletividade o termo especificidade, muitas vezes utilizado como sinônimo de seletividade,
58
4.5.1 Espec i ficidade/Seletividade
o termo especificidade, muitas vezes utilizado como sinônimo de
seletividade, define a capacidade do método em detectar o analito de interesse na
presença de outros componentes da matriz. Enquanto a seletividade refere-se à
capacidade de detecção de substãncias (BRITO et ai, 2003).
A especificidade do método é demonstrada através do cromatograma da
amostra testemunha, Figura 15, ou seja, amostra de feijão que não contem
nenhuns dos piretróides estudados.
Figura 18 - Cromatograma de uma amostra testemunha de feijão.
59 Observa-se que na região cromatográfica onde os piretróides apresentam seus tempos de retenção (entre
59
Observa-se que na região cromatográfica onde os piretróides apresentam
seus tempos de retenção (entre 11 e 24 minutos) não existe a presença de picos
cromatográficos componentes da amostra que possam interferir na análise,
inviabilizando a identificação e quantificação inequívoca dos piretróides estudados.
Como substâncias diferentes podem apresentar respostas similares em
dadas condições deve-se proceder à verificação da especificidade, seguida por
outras técnicas comprobatórias. Para se ter certeza de que os picos encontrados
nos estudos de fortificação são realmente os picos característicos dos piretróides,
uma amostra do estudo foi injetada em cromatógrafo a gás com detector de
captura de elétrons, Figuras 16 a 20, comparando-se os tempos de retenção com
os tempos característicos dos padrões de piretróides injetados nas mesmas
condições, o que confirmou a identificação qualitativa dos piretróides feitas pelo
HPLC.
No,",.
1000
'000
F'dao (.:(Iq I')
I,UU ng/L:L
1200
"lUOQ
dlJO
1\
i\
:-1)1
--~ '.
F===-==~":"---------,--------,---------,--- e-_----,-----1
:0
2'
Figura 19 - Cromatograma da solução padrão Copo P1 1 ,00 r]g/~L injetada no
cromatógrafo de fase gasosa com detector de captura de elétrons.
60 ~ i ',)('0· I ~~ ê 1'~ i '- ~ , ~ o ;~
60
~
i
',)('0·
I
~~
ê
1'~
i
'-
~
,
~
o
;~
~
f~
ii
'i
I '~
,
,--
"
,~
i-
:i
"
"
"
~;
,
~ *:~\-
, .~
i~
.l
:\
.'
--
I
I
-o
H.n/
15
:0
::~
Figura 20 -
Cromatograma da solução padrão Copo P2 1,00 r]g/~L injetada no
cromatágrafo de fase gasosa com detector de captura de elétrons.
N·""'l
,aoo -j
1"'01] j
FelJao Testemunha
;4UO~
IZÚO ~
1000j
g,jO l
(:·00 ~
00,' 1
I
':'.~
;l ~.'
:::00
r::', ~
,
,
,
:-:-;-
":-:
'.
--"'1
;
o
o
10"
20
'5
~6
Figura 21 - Cromatograma da amostra de feijão testemunha injetada no
cromatágrafo de fase gasosa com detector de captura de elétrons.
ó I ] '. ~'-':":"l ., • t-' ':' •• '.:~ r'l ," ")1)0
ó I
]
'. ~'-':":"l
.,
t-' ':' •• '.:~ r'l
,"
")1)0
'~Xl
Figura 22 - Cromatograma da amostra fortificada com o Coq. P1 injetada no
cromatógrafo de fase gasosa com detector de captura de elétrons.
:000
1200
lClOO
000 -
,0·
'----''---
.=:
!2
::0
~
~5
Figura 23 - Cromatograma da amostra fortificada com o Coq. P2 injetada no
cromatógrafo de fase gasosa com detector de captura de elétrons.
4.5.2
Recuperação
As Tabelas 10 a 19 mostram as médias das recuperações obtidas para as 7
repetições nos três diferentes níveis de fortificações estudados. As tabelas
também contêm os desvios padrões e os coeficientes de variação que serão
discutidos no decorrer deste tópico.
62 Tabela 10- Recuperações para a Fenpropatrina Nível de Fortificação Média (%) Desvio Coeficiente de
62
Tabela 10- Recuperações para a Fenpropatrina
Nível de Fortificação
Média (%)
Desvio
Coeficiente de variação
Padrão
(%)
0,01 mg/kg
105
12,6
12,0
0,10 mg/kg
80
2,9
3,7
1,00 mg/kg
91
12,1
13,2
Tabela 11 - Recuperações para o Fenvalerato
Nível de Fortificação
Média (%)
Desvio Padrão
Coeficiente de variação
(%)
0,01 mg/kg
97
11,4
11,8
0,10 mg/kg
79
3,7
4,7
1,00 mg/kg
100
6,1
6,1
Tabela 12 - Recuperações para a Cipermetrina
Nível de Fortificação
Média (%)
Desvio Padrão
Coeficiente de variação
(%)
0,01 mg/kg
99
8,1
8,2
0,10 mg/kg
78
1,8
2,3
1,00 mg/kg
99
1,9
1,9
Tabela 13 - Recuperações para a Deltametrina
Nível de Fortificação
Média (%)
Desvio Padrão
Coeficiente de variação
(%)
0,01 mg/kg
96
12,2
12,8
0,10 mg/kg
72
2,5
3,5
1,00 mg/kg
93
3,5
3,8
63 Tabela 14 - Recuperações para a Trans-permetrina Nível de Fortificação Média (%) Desvio Padrão
63
Tabela 14 - Recuperações para a Trans-permetrina
Nível de Fortificação
Média (%)
Desvio Padrão
Coeficiente de variação
(%)
0,01 mg/kg
105
13,5
12,8
0,10 mg/kg
70
6,5
9,3
1,00 mg/kg
98
1,5
1,5
Tabela 15 - Recuperações para a Cis-permetrina
Nível de Fortificação
Média (%)
Desvio Padrão
Coeficiente de variação
(%)
0,01 mg/kg
101
14,5
14,4
0,10 mg/kg
80
10,5
13,1
1,00 mg/kg
99
1,7
1,7
Tabela 16 - Recuperações para a Lambda-cialotrina
Nível de Fortificação
Média (%)
Desvio Padrão
Coeficiente de variação
(%)
0,01 mg/kg
104
11,9
11,5
0,10 mg/kg
71
2,2
3,2
1,00 mg/kg
94
2,6
2,8
Tabela 17 - Recuperações para a 8ifentrina
Nível de Fortificação
Média (%)
Desvio Padrão
Coeficiente de variação
(%)
0,01 mg/kg
106
11,0
10,4
0,10 mg/kg
85
5,9
7,0
1,00 mg/kg
96
0,9
0,9
64 Observamos que todos os piretróides apresentaram recuperações dentro do intervalo de 70 a 120%,
64
Observamos que todos os piretróides apresentaram recuperações dentro
do intervalo de 70 a 120%, proposto pela Agência de Proteção Ambiental dos
Estados Unidos da América (EPA) (EPA, 1996) e pelo Codex Alimentarius
(CODEX, 2000) e também estiveram de acordo com a Comissão Européia para
monitoramento de resíduos de pestícídas, que propõe um intervalo de 70 a 110%
(EURACHEM, 1998). Os valores de coeficientes de variação porcentual também
estão de acordo com os índices propostos, de até 20 % segundo a comissão
formada por membros das organizações AOAC, FAO, IAEA & IUPAC, 1999. Isto
só foi possível após se ter separado os piretróides em dois grupos intercalando os
tempos de retenção que apresentaram. Quando se realizou o estudo de
recuperação com todos os piretróides junto o Fenvalerato e a Deltametrína não
apresentaram todas as suas recuperações entre dos intervalos aceitos. Isto
aconteceu devido à baixa resolução cromatográfica dos picos destes dois
compostos. Podemos observar no cromatograma característico de uma amostra
fortíficada em 0,10 mg/kg, Figura 6, que outros compostos também apresentam
baixa resolução, no entanto, as recuperações foram satisfatórias, mas não nos dá
a certeza de estar quantificando de forma correta.
Após terem sido realizados estudos de fortificação com os dois grupos de
compostos separados, nos três mesmos níveís de concentração das que foram
feitas para o coquetel e nas mesmas condíções os resultados foram todos dentro
dos íntervalos aceitos, o que comprova que a baixa recuperação do fenvalerato e
da deltametrina nas amostras fortificadas com o coquetel foi devido a uma
superposição dos picos destas moléculas, ou seja, baixa resolução
cromatográfica, o que resultou em áreas não representativas dos mesmos, não
podendo desta forma ser quantificado adequadamente.
4.5.3
Limite de Detecção
o limite de detecção é definido como a menor concentração do analito que
pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, sob condições
experimentais estabelecidas (BRITO et ai, 2003). Pode ser definido também como
65 o menor valor detectado em confiabilidade de precisão aceitável, em função do limite do
65
o menor valor detectado em confiabilidade de precisão aceitável, em função do
limite do sistema (eletrônica, instrumental, ganho etc.) (LEITE, 1996).
Não há um consenso para a utilização de um único método para a
determinação do limite de detecção em quantificações analíticas. O limite de
detecção pode ser determinado mediante a relação sinal/ruído, o desvio padrão da
resposta e do coeficiente angular e por processos estatísticos.
A relação sinal/ruído pode ser aplicada somente para processos analíticos
que exibem linha de base. A determinação da razão sinallruido é realizada por
meio da comparação dos sinais medidos da amostra com baixas concentrações
conhecidas do analito com· as do branco, estabelecendo-se a concentração
mínima na qual o analito pode ser detectado. O limite de detecção pode ser
considerado igual a razão sinal/ruído com valores de 2:1 ou 3:1 (KUSELMAN &
SHENHAR, 1995, ICH 1996, EURACHEM 1998, SWARTZ & KRULL 1998,
HUBER, 1998, BRITO et ai, 2003).
Os valores encontrados da relação sinal ruído 2:1 para os piretróides
estudados que estabelecem os limites de detecção do método estão apresentados
na Tabela 18.
Tabela 18 - Limite de detecção para os piretróides estudados
Piretróide
Limite de detecção
(mg/kg)
Fenpropatrina
0,001
Lambda-cialotrina
0,001
Cipermetrina
0,001
Deltametrina
0,002
Fenvalerato
0,002
Trans-permetrina
0,002
Cis-permetrina
0,002
Bifentrina
0,002
66 4.5.4 Limite de Quantificação o limite de quantificação é definido como o menor valor
66
4.5.4 Limite de Quantificação
o limite de quantificação é definido como o menor valor que pode ser quantificado,
com confiabilidade de precisão e exatidão aceitáveis, para aquela condição
analítica (LEITE, 1996). No presente trabalho o limite de quantificação foi
estabelecido pela razão sinal/ruído 10: 1, obtida por meio da comparação dos
sinais medidos da amostra com baixas concentrações conhecidas do analito com
as do branco (KUSELMAN & SHENHAR, 1995, ICH 1996, EURACHEM 1998,
SWARTZ & KRULL 1998, HUBER, 1998, BRITO et ai, 2003). Os limites de
quantificação do método estão apresentados na Tabela 19.
Tabela 19 - Limite de quantificação para os piretróides estudados
Piretróide
Limite de quantificação
(mg/kg)
Fenpropatrina
Lambda-cia lotri na
Cipermetrina
Deltametrina
Fenvalerato
Trans-permetrina
Cis-permetrina
Bifentrina
0,006
0,008
0,004
0,008
0,011
0,008
0,011
0,011
De acordo com o procedimento estatístico utilizado para análise de
resíduos de pesticidas, o limite de quantificação corresponde ao menor nível de
fortificação estudado (DFG, 1997; AMARANTE et ai, 2001).
67 4.5.5 Precisão É a proximidade de concordância entre resultados de testes independentes obtidos sob
67
4.5.5 Precisão
É a proximidade de concordância entre resultados de testes independentes
obtidos sob condições estipuladas (AOAC/FAO/IAEA/IUPAC, 1999).
A precisão é determinada através dos estudos de recuperação efetuados
em replicatas, ou seja, está relacionado com a repetitividade dos resultados da
análise.
A precisão é dada pelo coeficiente de variação em relação à média das
recuperações e ou pelo desvio padrão, quanto menor o coeficiente de variação
das recuperações mais preciso será o método.
Para concentrações baixas, como em análise de resíduos de pesticidas, os
valores de recuperação e coeficientes de variação são geralmente semelhantes os
propostos pela comissão de especialistas das organizações AOAC, FAO, IAEA &
IUPAC, 1999, mostrado na Tabela 22 (GREEN 1996, EPA 1996, BRITO et ai
2003).
Tabela 20 - Intervalos de coeficiente de variação (CV%) e recuperações aceitos
com relação a concentração do analito na amostra
Concentração
Repetitividade I Precisão
Exatidão
Intervalo de CV aceito
Intervalo de
(%)
recuperação aceito (%)
$
1 1J.9/kg
35
50-120
>
1 ).!g/kg $ 0,01 mg/kg
30
60-120
> 0,01
mg/kg $ 0,1 mg/kg
20
70-120
>
0,1 mg/kg $
1 mg/kg
15
60-110
> 1 mg/kg
10
60-110
Os CV% apresentados nas Tabelas 10 a 19 variaram entre 0,9 - 14,4 % e
estão dentro do que é internacionalmente aceito para analise de resíduos de
pesticidas, o que mostra que o método é preciso nas concentrações estudadas.
68 4.5.6 Exatidão É a proximidade de concordância entre um valor médio obtido de um
68
4.5.6 Exatidão
É a proximidade de concordância entre um valor médio obtido de um largo
conjunto de resultados de testes a um valor de referência aceitável
(AOAC/FAO/IAEA/IUPAC, 1999, GREEN 1996, EPA 1996, BRITO et ai 2003).
A exatidão é estabelecida através das porcentagens de recuperação. Estes
valores deverão estar entre 70 e 120% dentro do que está especificado na Tabela
22.
Todas as recuperações variaram entre 70 - 106%, resultados apresentados
no Item 4.3.2, Recuperação, Tabelas 10 a 17, de acordo com os intervalos aceitos
para as concentrações estudadas, o método proposto se mostra exato. Não foi
possível a comparação com materiais certificados por não existir esta combinação
(feijão/piretróide) específica no mercado.
4.5.7 Robustez
É a medida da capacidade dos resultados da análise permanecer inalterada
por variações pequenas, mas deliberadas dos parâmetros do método que indicam
a confiabilidade durante sua utilização normal (AOAC/FAO/IAEA/IUPAC, 1999).
Foi verificada através da realização das análises por diferentes analistas e
diferentes datas. Ou seja, as 7 amostras fortificadas foram separadas em dois
grupos de 3 e 4 amostras. Um dos grupos foi analisado em um dia por uma equipe
de analistas (A) e o outro grupo em outro dia, 5 dias depois, por outra equipe de
analistas (B) e a robustez pode ser observada verificando os valores de
recuperação, Tabela 21, que se mantiveram sem grandes variações nos dois
grupos de amostras analisadas separadamente.
69 Tabela 21 - Recuperação e desvio padrão encontrados pelas duas equipes, A e B,
69
Tabela 21 - Recuperação e desvio padrão encontrados pelas duas equipes, A e
B, que analisaram as amostras fortificadaso
Produto e Nível de
Fortificação
(mq/kg)
Equipe de Analistas
A
B
Fenpropatrina
Recuperação
Desvio Padrão
Recuperação
Desvio Padrão
Média Obtida
Relativo (%)
Média Obtida
Relativo (%)
(mg/kg)
(mg/kg)
0 O~Jg_
108
17,0
101
8,8
-_o
,.
--"
-
-
-."
--
I- --- ---
-
00_0
0
-------
0-
-,-~--.-~ -
0,100
80
2,3
80
3,9
1,000
91
14,3
92
12,7
Alfa-Cipermetrina
0,010
93
7,4
105
1,6
0,100
78
2,4
79
1,4
1,000
o
99
o_o
L 2,3
99
1,8
0_- 1--
.0
0
0
-
-----
Fenvalerato
0,010
98
11,6
95
13,6
0,100
78
3,4
80
4,5
1,000
101
8,1
99
5,0
Bifentrina
0,010
107
17,1
106
3,3
0,100
83
1,7
87
8,6
1,000
96
1,2
96
0,6
Lam bda-C ia lotri na
0,010
102
12,3
106
13,8
0,100
72
1,2
69
-- _?_~?--------
- ---
.
-
-
1,000
95
3,6
94
1,3
Deltametrina
0,010
87
6,8
104
10,2
0,100
72
1,5
72
3,7
1,000
95
4,6
91
1,2
Trans-Permetrina
0,010
103
4,7
103
9,5
0,100
72
6,5
70
3,1
1,000
99
1,8
97
1,3
Cis-Permetrina
0,010
94
5,9
99
6,3
--- --
--
--
----
---
0,100
84
0,7
85
3,9
1,000
99
1,5
99
2,2
I
70 4.6 Resultado das análises de amostras de feijão Nenhuma das 48 amostras de feijão
70
4.6 Resultado das análises de amostras de feijão
Nenhuma das 48 amostras de feijão analisadas apresentou resíduos de
pesticidas piretróides, este resultado é perfeitamente aceito visto a baixa
persistência desses no meio ambiente e devido a alta atividade inseticida dos
piretróides é possível a aplicação em pequenas dosagens.
Em um estudo realizado por LOPES & DÓRES (2003), na cidade de
Aracaju Estado de Sergipe, foi encontrado 1,83 mg/kg de deltametrina em uma
amostra de feijão, juntamente com o inseticida diazinon e propanil. Nenhuma outra
referência da literatura nacional apresenta resíduo de piretróides em amostras de
feijão. A presença destes inseticidas em amostras de feijão se dá pelo uso desses
no processo de armazenamento dos grãos. Conforme discutido na introdução, a
aplicação de pesticidas durante o armazenamento é recomendado como a técnica
com melhor custo/beneficio para controle de insetos. Os inseticidas mais
recomendados para esta finalidade são os piretróides e organofosforados. Como
nas amostras estudadas não se detectou a presença de piretróides, pode-se inferir
a possibilidade de ocorrência de outros inseticidas, sendo que os
organofosforados seriam uma primeira classe a ser estudada.
Os resultados obtidos na presente dissertação são coerentes com os
estudos de NAKAMURA et ai (1993), que obtiveram taxa de recuperação entre 60
e 103,5% em amostras fortificadas com concentrações entre 0,25 e 1,0 mg/kg.
GALERA et ai (2003) estudaram a dissipação de sete piretróides em condições de
campo, definindo as equações matemáticas que melhor descreveram o
decaimento das concentrações dos piretróides em função do tempo, bem como o
tempo de meia vida. Os intervalos para colheita foram definidos a partir da curva
de decaimento e do nível de concentração máximo permitido pela comunidade
européia, verificando-se que a concentração residual de piretróides decai até
mesmo mais rapidamente do que informado pelos fabricantes das formulações,
indicando, portanto, o consumo seguro dos alimentos.
71 5. CONCLUSÃO o método desenvolvido, utilizando a técnica de cromatografia líquido de alta eficiência
71
5.
CONCLUSÃO
o método desenvolvido, utilizando a técnica de cromatografia líquido de alta
eficiência com detecção por espectrofotometria de absorção molecular na região
do ultra-violeta, que teve como base o método multi-resíduos DFG-S19, para a
determinação de resíduos de 7 pesticidas da classe dos piretróides, mostrou-se
eficiente para análise de feijão. Isto foi demonstrado nos resultados de validação,
os quais estão de acordo com as diretrizes requisitadas, para validação de
métodos analíticos, pelos principais órgãos nacionais e internacionais
regulamentadores e normativos.
O diferencial deste método é o baixo limite de quantificação que se
conseguiu em relação aos outros métodos descritos na literatura.
A ausência de resíduos de piretróides nas amostras analisadas sugere a
boa qualidade do feijão consumido na cidade de São Paulo, o que atende à
legislação brasileira neste setor, como ainda, indica que as normas de Boas
Práticas Agrícolas estão sendo obedecidas e seguidas. Entretanto, para que esta
conclusão seja confirmada, a presença de outras classes de inseticidas,
especialmente os organofosforados, precisa ser investigada.
72 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AMARANTE Jr. O. P.; CALDAS, E.P.A.; BRITO, N.M.; SANTOS, T.C.R dos;
72
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AMARANTE Jr.
O.
P.;
CALDAS,
E.P.A.;
BRITO,
N.M.;
SANTOS, T.C.R
dos;
VALE, M.L.B.F. Validação de métodos analíticos: uma breve revisão. Caderno
de Pesquisa. 12, 116-131, 2001.
AOAC/FAO/IAEA/IUPAC - Expert Consultation. Guidelines for Single-Iaboratory
Validation of Analytical Methods for Trace-levei Cone. Of Organic
Chemicals. Miskolc. Hungary. 1999. 73p.
BENGSTON, M.; DAVIES, R.A.H.; DESMARCHELlER, J.M.; HENNING, R;
MURRAY, W.; SIMPSON, B.W.; SNELSON, J.T.; STICKA, R.; WALLBANK,
B.E. Organophosphorothioates and synergised synthetic pyrethroids as grain
protectants on bulk wheat. Pesticide Science. 14, 373-384, 1983.
BISSACOT,
D.Z.
&
VASSILlEFF,
I.
HPLC
determination
of
flumethrin,
deltamethrin, cypermethrin and cyhalothrin residues in the milk and blood of
lactating dairy cows. Journal of Analytical Toxicology. 21, 397-402, 1997.
BOTTOMLEY, P. & BAKER, P.G. Multi-residue determination of organoclorine,
organophosphorus and synthetic pyrethroid pesticides in grain by gás-liquid
ande high-performance liquid chromatography. Analyst. 109, 85-90, 1984.
Brasil. ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Monografia de Produtos
Agrotóxicos. Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/toxicologia/monografias/monografias.pdf>.
Acesso em 17 de março de 2004.
BRADBURY,
S.P.
&
COATS,
J.R
Comparative
toxicology
of
the
pyrethroid
insecticides. Environmental Contamination Toxicology. 108, 133-77, 1989.
73 BRITO, N. M., AMARANTE; J. O. P. ,POLESE, L.; RIBEIRO, M. L Validação de
73
BRITO, N. M., AMARANTE; J. O. P. ,POLESE, L.; RIBEIRO, M. L Validação de
métodos analítíco: Estratégia e Discussão. Pesticidas: Resíduos
Ecotoxicologia e Meio Ambiente. 13, 129-146,2003.
CHEN, Z.M. & WANG, Y.H., Chromatografic methods for the determinatíon of
pyretrín and pírethroíd pesticides residues in crops, foods and enviromental
samples. Journal Chromatography, A. 754, 367-395, 1995.
CODEX
ALlMENTARIUS.
Guide
to
Codex
Maximum
Residue
Limits
of
Pesticides and Extraneous Maximum Residue Limits adopted by the
Codex Alimentarius Commission 22 nd Session. Food and Agrículture of the
Uníted Natíons. 1997.
CODEX ALlMENTARIUS. Pesticide Residues in Food -
Methods of analysis
and sampling. Food and Agriculture of the United Natíons. 2A, Part 1, 2000.
COLLlNS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Introdução a métodos
cromatográficos. 5 Ed, Campinas, Edítora UNICAMP, 1993, p. 95-115 e
p.143-81.
DARWISH, A. Determination of deltamethrín leveis in wool by reversed-phase hígh
performance líquid chromatography. Journal of Chromatography, A. 17,
4215-4228,1994.
DEBON, A. & SEGALEN, J.L. Trace analysis of pyretrins and piperonyl butoxide in
water by high performance liquíd chromatography. Pyrethrum Post. 17, 43-46,
1989.
DFG, Dt Forscherngsgemeinschaf, Pesticide Commission. Manual of Pesticide
Residue Analysis/DFG. Ed. By Hans Peter Thíer. v. 1. 1997. 432 p.
74 OFG, Ot Forscherngsgemeinschaf, Pesticide Commission. Manual of Pesticide Residue Analysis/DFG. Ed. By Hans Peter
74
OFG, Ot Forscherngsgemeinschaf, Pesticide Commission. Manual of Pesticide
Residue Analysis/DFG. Ed. By Hans Peter Their and Jochen Kirchhoff. v. 2.
1992. 481p.
Environmental Protection Agency. Residue Chemistry lest Guidelines. Office of
Presention, Pesticides and Toxic Substances 860.1340: Residue Analytical
Method, Washington:EPA, 1996 12p.
EURACHEM Working Group. EURACHEM Guide - lhe Fitness for Purpose of
Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related
Topics
1998, 61 p.
FERREIRA, C.R.R.P.T.& TSUNECHIRO, A . Evolução das vendas de defensivos
agrícolas e uso de métodos alternativos e complementares de proteção de
culturas no Brasil. Biológico. 60 (1), 35-49, 1998.
GALERA, M.M.; VIOAL, J.L.M.; FRENICH, AG.; GARCIA, M.O.G. Oetermination
of cypermethrin, fenvalerate, and cis- and trans-permetrin in soil and
groundwater by high-performance liquid chromatography using partial least-
squares regression. Journal of Chromatography, A. 727, 39-46, 1996.
GALERA, M.M.; GARCIA, M.D.G.; LALLENA, J.AR; LOPEZ, T.L.; VIDAL, J.L.M.
Dissipation of pyrethroids residues in pepper, zuchinis and green beans
exposed to field treatments in greenhouses: Evaluation by decline curves.
Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51,5745-5751,2003.
GEBARA, AB. Eficácia de inseticidas piretróídes no controle de Musca domestica
(Linnaeus, 1758). 1998. Tese (Doutorado em Saúde Publica) -Faculdade de
Saúde Pública, Universidade de São Paulo, São Paulo.
75 GREEN, J.M. A Praticai Guide to Analytical Method Validation. Analytical Chemistry News & Features.
75
GREEN,
J.M.
A
Praticai
Guide
to
Analytical
Method
Validation.
Analytical
Chemistry News & Features. 305A-309A, 1996.
HADDAD, P.R.; BRAYAN, J.G.; SHARP,G.J.; DILU, S. Determination of pyrethroid
residues on paddy rice by reversed-phase high-performance liquid
chromatography. Journal of Chromatography, A. 461, 337-346,1989.
HEIGER, D. N. High Performance Capillary Electrophoresis. Hewlett Packard
Company, Publication. n. 12 p. S091-6199E. 1997.
HUBER,
L.
Validation
of
analytical
methods:
review
and
strategy.
LC/GC
International. 96-105, 1998.
ICH - Harmonised Trapartite Guideline. VAUDATION of analytcal procedures:
methodology. CPMP/ICH/281/95. London ICH, 1996. 9p
JORGENSON, J. W. e LUKACS K. D. Zone Electrophoresis in Open-tubular Glass
Cappilaries. Analytical Chemistry. 53. 1298, 1981.
KAZAKEIRCH Y. & McNAIR H. Basic Liquid Chromatography. 2000. Disponível
em: < http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/>. Acesso em: 03 de
novembro de 200S.
KUSELMAN, 1., SHENHAR, A. Design of esperiment for the determination of the
detection limit in chemical analysis. Analytica Chimica Acta. 306, 301-305.
1995.
LEITE, F. Validação em análise química. Campinas,SP: Editora Átomo, 1996.
124p.
76 LHOSTE, J. La lutte chimique contre les insectes nuisibles. Les Presses Faculte Médecine Pharmacie
76
LHOSTE, J. La lutte chimique contre les insectes nuisibles. Les Presses Faculte
Médecine Pharmacie de Marseille. 1966. 6Sp.
LOPES, W.G., DÓRES, H. G., Determinação de pesticidas em feijão por dispersão
da matriz em fase sólida (DMFS). Pesticidas: Resíduos Ecotoxicologia e
Meio Ambiente. 13, 13-73, 2003.
MAGALHÃES H. Feijoeiro comum tem boa receptividade no mercado nacional.
Banco de Notícias, EMBRAPA - Arroz e feijão. Santo Antonio de Goiás/GO.
Disponível
em:
<http://www21.sede.embrapa.br/noticias/banco de noticias/200S/janeiro/notici
a.200S-01-19.67379023S0/mostra noticia>. Acesso em: OS de fevereiro de
2006.
McMASTER, MARVIN, C. HPLC a Praticai User's Guide. John Willey & Sons.
Inc
1994. 211p.
MUSZAT, L.; AHARONSON, N.; ZWEIG, G.; SHERMA, J. Modern Analytical
Techniques. v. 14, p.9S-131. 1986.
NAKAMURA, Y.; TONOGAI, Y.;TSUMURA, Y.; ITO, Y. Determination of pyrethroid
residues
in
vegetables,
fruits,
grains,
beans,
and
green
tea
leaves
-
Applications to pyrethroid residues monitoring studies. Journal of AOAC
International. 76,1348-1361,1993.
NAKAMURA, y.; TONOGAI, Y.; SEKIGUCHI, Y.; TSUMURA, Y.; NISHIDA,N.;
TAKAKURA, K.; ISECHI, M.; YUASA, K.; NAKAMURA, M.; KIFUNE, N.;
YAMAMOTO, K.; TERASAWA, S.; OSHIMA, T.; MIYATA, M.; KAMAKURA, K.
Multiresideu Ana/ysis of 48 Pesticides in Agricultural Products by Capillary Gás
Chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 42, 2508-
2518.1994.
77 SEBRAE. Cultivo de Feijão. Disponível em: < http://www.sebraemg.com.br/Geral/arquivo get.aspx?cod
77
SEBRAE.
Cultivo
de
Feijão.
Disponível
em:
<
http://www.sebraemg.com.br/Geral/arquivo get.aspx?cod areasuperior=2&cod
areaconteudo=231 &cod
pasta=234&cod conteudo=1509&cod documento=1
11>· Acesso em: 18 de maço 2006.
SPECHT, W.; PELZ, S.; GILSBACH, W. Gas-chromatographic determination of
pesiticide residues after clean-up by gel-permeation chromatography and mini-
silica-gel chromatography. Fresenius Journal Analytical Chemistry. 353,
183-190.1995.
SWARTZ,
M.
E.
&
KRULL,
I.
S.
Validação
de
métodos
cromatográficos.
Pharmaceutical Technology. p. 12-20. 1998.
TAVARES, M. F. M. Mecanismos de Separação em Eletroforese Capilar. Química
Nova. 20,493-511,1997.
TESSIER,
J.
Hacia
el
deltametrin.
In
ROSSEL-UCLAF:
Deltametrin.
Paris,
Roussel-Uclaf. 25-36. 1983.
TISELlUS, A. The Moving-Boundary Method of Studying the Electrophoresis of
Proteins. Tese de Doutorado, University of Uppsala, Suécia, 1930.
WANDER, A. E. Cultivo do feijão irrigado na região noroeste de Minas Gerais.
Embrapa Arroz e Feijão - Sistemas de Produção. n. 5. Disponivel em:
<http://sistemasdeproducao.cnptia.ernbrapa.br/FontesHTM LíF eijao/Feijaol rriga
doNoroesteMG/index.htm>. Acesso em: 15 de fevereiro de 2006.
78 ZANELLA, R.; MARTINS, AF.; PAVAN, F. A; DALLAGO, R.M. Determinação da distribuição da deltametrina
78
ZANELLA, R.; MARTINS, AF.; PAVAN, F. A; DALLAGO, R.M. Determinação da
distribuição da deltametrina nas caldas de banhos de imersão para bovinos.
Pesticidas: Resíduos Ecotoxicologia e Meio Ambiente. 8, 27-32. 1998.
ZUPPI, M.; MENTEM, J. O. M.; FERREIRA-LIMA; RABALHO, A A; FRARE, V. C.
Pesticidas utilizados no feijoeiro no Brasil : Evolução e situação atual.
Disponível em: < http://www.cnpafembrapa.br/conafe/pdf/palestra17pdf>.
Acessado em 11 de abril de 2006.