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RIESGOS QUIMICOS

Y BIOLÓGICOS
UNIDAD 4: Medición, Exposición, Manejo
y Protección al Riesgo Biológico

SEMANA 7
Técnicas de Detec-
ción y Análisis / Con-
diciones de Exposi-
ción
Técnicas de Detección y Análisis / Condiciones de Exposición

EVALUACIÓN DE CONTAMINANTES BIOLÓGICOS

(INSTITUTO NACIONAL DE SEGURIDAD E HIGIENE EN EL


TRABAJO, 2014, págs. 76-77).

Los agentes biológicos se encuentran formando La medición ambiental persigue evaluar la


mezclas complejas, fundamentalmente en tres exposición o determinar la composición biológica
soportes: superficies, líquidos y aire. Los dos de un ambiente en diferentes puntos, momentos
primeros constituyen, a su vez, sustratos en los del día o periodos de tiempo (estaciones) y es la
que se reproducen y desde los que los agentes que se ha desarrollado con más amplitud.
biológicos se pueden dispersar, mayoritariamente
a través del aire en forma de bioaerosol.

La medición de agentes biológicos en superficies y


en líquidos suele responder a uno de los objetivos
de la medición, como es la identificación y
caracterización de las fuentes de contaminación;
en general este tipo de muestreo es apropiado
para confirmar la presencia de agentes biológicos
en caso de sospecha, y puede ser empleado
para determinar la eficacia de la limpieza. Sin
embargo, su utilidad en la evaluación de riesgos por
exposición a agentes biológicos, debido a su escasa
correlación con los resultados obtenidos a partir
de las mediciones ambientales o con los efectos
para la salud, es menor, pudiéndose emplear como
complemento a la determinación ambiental.

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RIESGO QUIMICOS Y BIOLÓGICO

Procedimientos de Medición (FUNDACIÓN MAFPRE, 1991, pág. 843).

La metodología aplicada para la medición de El recuento de microorganismos se realiza


los contaminantes biológicos dependerá de la a partir de la siembra de alícuotas de esta
naturaleza de los mismos y del medio en el cual muestra, pudiendo utilizar a continuación
se desean cuantificar o identificar. las distintas técnicas de análisis cuantitativo
(NMP, inclusión en agar, filtración).
Se centrará este apartado en la exposición de los
métodos de medición de organismos vivos por c. Filtración: Se hace pasar un volumen
considerar que la metodología a utilizar, para la determinado de aire a través de un filtro
evaluación ambiental de la mayoría de agentes en el cual quedan retenidas las partículas
incluidos en la categoría de derivados animales portadoras de microorganismos.
o vegetales, se corresponde con la aplicada en la
evaluación de los contaminantes químicos. Se pueden utilizar distintos tipos de filtros
siendo los más comunes los de membrana
El aislamiento y cuantificación de microorganismos de celulosa, o los de gelatina, los cuales
a partir de medios como el agua y los alimentos, así se llevan directamente sobre un medio de
como los criterios de valoración correspondientes, cultivo sólido o bien se lavan, realizando
están perfectamente establecidos desde el posteriormente siembras en un medio
enfoque de la prevención de la salud pública. sólido a partir del líquido de lavado.

Por tanto, a continuación se exponen los d. Impactación: Un volumen determinado de aire


distintos métodos existentes para el muestreo se impacta sobre un medio de cultivo sólido.
de los microorganismos (Bacterias, hongos) en
aire y superficies, los cuales se encuadran en el
contexto de los métodos de trabajo propios de la
Higiene Industrial.

Técnicas de muestreo ambiental


de microorganismos

a. Sedimentación: Representa el método


más rudimentario de medición de los
microorganismos en el ambiente. Consiste
en la exposición de placas de Petri al
ambiente durante un cierto tiempo.

b. Recogida en medio Líquido: Consiste en


hacer pasar un volumen determinado de aire
en forma de burbujas a través de un caldo
de cultivo o solución isotónica, en los cuales
quedan retenidos los microorganismos.

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Técnicas de Detección y Análisis / Condiciones de Exposición

Existen varios equipos basados en éste método: ▶▶ Recolector de RCS (Reuter Centrifugal
Sistem): Una hélice impulsa un determinado
▶▶ Recolector de Andersen 6 niveles: Las volumen de aire sobre una cinta que contiene
placas son medio de cultivo sólido se el medio de cultivo adecuado, distribuido
colocan en 6 niveles de forma que el aire, al en una serie de alveolos yuxtapuestos.
pasar de un nivel a otro, atraviese unos filtros
con orificios de diámetros progresivamente Las partículas portadoras de microorganismos son
decrecientes. Esto provoca una aceleración, impactadas, por acción de la fuerza centrífuga,
con lo cual se produce la impactación de sobre el medio de cultivo.
partículas en función de su tamaño sobre
las placas de medio de cultivo situadas en
los distintos niveles (Figura 1).

▶▶ Muestreador SAS (Surface Air System): Un


volumen de aire preestablecido es aspirado a
través de una superficie perforada e impactado
doble una placa de Petri que contiene un
medio de cultivo adecuado (Figura 3).

▶▶ Recolector de Andersen 1 nivel: Es una


modificación del anterior y en el cual existe
un solo nivel, habiéndose demostrado la
eficacia del mismo para la determinación de
concentraciones de hongos en el ambiente.

▶▶ Recolector de hendidura CASELLA: El


aire atraviesa una estrecha hendidura
impactándose en una placa de Petri dotada
de un movimiento uniforme de rotación,
que se ajusta en función de la densidad de
la población microbiana.

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En la Tabla II se relacionan las principales ventajas e inconvenientes de los diferentes métodos expuestos.

TÉCNICA DE MUESTREO VENTAJAS INCONVENIENTES

No se recogen partículas > 3 µm. El


resultado ha de expresarse como :
u.f.c./cm2/hora (no puede referirse a un
volumen de aire)
SEDIMENTACIÓN Simplicidad.
No permite realizar análisis cuantitativos
Se produce la muerte de
microorganismos por desecación
después de 20 minutos de exposición.

Una posible proliferación bacteriana en


No existe peligro de desecación
RECOGIDA EN MEDIO LÍQUIDO el líquido puede conducir a errores en la
Exactitud en el recuento.
cuantificación.

Se produce la muerte de
microorganismos por desecación con
FILTRO Exactitud en el recuento.
volúmenes de muestreo superiores a
250 l

No es aplicable a zonas de muy baja


Exactitud en el recuento
contaminación (sensibilidad 7 u.f.c./m3
RECOLECTOR ANDERSEN Obtención de datos en función del
aire)
(6 niveles) tamaño de la partícula.
Costoso en cuanto a material y tiempo
IMPACTACIÓN

requerido.

Desecación del medio de cultivo en


RECOLECTOR ANDERSEN Disminuye la inversión requerida en
muestreos prolongados en condiciones
(1 nivel) material y tiempo.
de sequedad y altas

Alta eficacia de captación


Desecación del medio de cultivo en
RECOLECTOR DE Diseminación uniforme de
muestreos prolongados en condiciones
HENDIDURA CASELLA microorganismos sobre la superficie del
de sequedad y altas temperaturas
agar.

Posibilidad de apreciar cambios en el


lapso de tiempo que dura la rotación
Desecación del medio de cultivo en
completa
muestreos prolongados en condiciones
Amplio margen de selección de caudales
de sequedad y altas temperaturas
(30 a 700 lpm)
RECOLECTOR R.C.S. Dificultad en apreciar exactamente el
Amplio margen de selección de
volumen de aire que se impacta sobre
IMPLANTACIÓN

volúmenes (20 a 340 l)


la cinta ya que el aire entra y sale por el
Simplicidad de manejo
mismo punto.
Reproductibilidad de los valores
obtenidos.

Amplio margen de preselección de


volúmenes de aire:
60 a 900 l Desecación del medio de cultivo en
RECOLECTOR S.A.S. 30 a 450 l muestreos prolongados en condiciones
En función del caudal al que se ha de sequedad o altas temperaturas.
ajustado el equipo
Simplicidad de manejo.

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Técnicas de Detección y Análisis / Condiciones de Exposición

Técnicas de muestreo de microor-


ganismos en superficies

Los instrumentos de trabajo, ropas, mobiliario u


otro tipo de superficies, debido a las condiciones
habituales de uso o bien a causa de una deficiente
desinfección, pueden actuar como reservorios de
los contaminantes biológicos.

Los procedimientos básicos para el muestreo de


superficies son:

a. Placa de contacto: Se añade a una placa


RODAC en un medio de cultivo sólido, en
ligero exceso y seleccionado en función de
los microorganismos buscados. La placa
así preparada se coloca sobre la superficie
a muestrear, manteniéndola inmóvil y
presionando (figura 4).

b. Frotis: En este método se utilizan torundas


estériles de algodón que permiten muestrear
en zonas de difícil acceso para las placas
de contacto.

Con estas torundas de algodón se realizará una


siembra por extensión en una placa con medio
sólido o bien, se introduce una solución isotónica
estéril con agitación, realizando posteriormente
siembras en medio sólido a partir de esta solución.

Una vez establecidos, el método de muestreo que


se va a utilizar y los microorganismos que se desean
aislar y cuantificar, y previamente al muestreo habrá
de determinarse los lugares de muestreo, la posición
del muestreador, número de muestras en cada punto,
así como la frecuencia de los muestreos. Todo ello
en función de las características específicas del
ambiente que se pretende evaluar.

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RIESGO QUIMICOS Y BIOLÓGICO

Técnicas analíticas

Las placas con el medio de cultivo, muestreadas Las mediciones que se realizan, normalmente
según los procedimientos expuestos anteriormente, incluyen muestras para la evaluación de “bacterias
se incuban a una temperatura y durante un tiempo, totales” y de “mohos y levaduras”, en cada zona
que estará en función de los microorganismos que de muestreo. Posteriormente, estas muestras se
se van a evaluar. cultivan en las siguientes condiciones:

Tiempo de
Medio de Cultivo T a C°
incubación
Bacterias totales
Mohos y Levaduras Agar TSA
37 ° 48 horas
Agar Saboraud con
25 ° 3 – 5 días
cloranfenicol

Finalizado el periodo de incubación, se realiza el consecuencia de las características que confiere


recuento de las colonias que se han desarrollado a estos agentes el hecho de ser organismos vivos,
en las distintas placas. Dado que se conoce el es decir:
volumen del aire que se ha impactado en cada
muestra, el resultado se expresa como unidades ▶▶ Son capaces de reproducirse en un medio y
formadoras de colonias / m3 aire (u.f.c. /m3 aire. unas condiciones adecuadas.

Por otra parte, a partir de estas placas y siguiendo ▶▶ Pueden adquirir formas de resistencia
las técnicas microbiológicas habituales, es (Esporas) que les permiten la supervivencia
conveniente, en determinados casos, realizar un en medios adversos, durante largos
análisis cualitativo identificando así las distintas periodos de tiempo.
colonias que hayan podido desarrollarse.
▶▶ Diferencias en el grado de virulencia de
Criterios de valoración las distintas cepas, teniendo en cuenta
además, la diferencia en la capacidad
Cuando se realiza la valoración de los resultados de respuesta del sistema inmune de los
obtenidos en la medición de agentes físicos o de organismos afectados.
contaminantes químicos, nos apoyamos en la
existencia de unos límites de referencia o criterios
de valoración. Actualmente, se están realizando estudios
encaminados a establecer relaciones entre la
Sin embargo, al realizar la valoración de los incidencia que tienen, en un determinado ambiente,
resultados obtenidos a partir de la medición ciertas patologías de naturaleza alérgica y los
de microorganismos en el ambiente, aparece valores de concentración de microorganismos
el problema que se deriva en la o existencia de hallados en ese ambiente, teniendo en cuenta
criterios de valoración. además, la composición cualitativa.

La dificultad en el establecimiento de límites En algunos de estos estudios se citan valores


fiables para este parámetro aparece como de concentración a partir de los cuales se
recomienda la aplicación de medidas de control

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Técnicas de Detección y Análisis / Condiciones de Exposición

(ejemplo: MOOREY y cols: 10.000 u.f.c./m3 aire, que hayan transcurrido 24 horas desde el
de bacterias y hongos en el ambiente de oficinas), muestreo. La temperatura de transporte debe
o bien que definen una situación “aceptable” ser suficientemente baja como para limitar el
(ejemplo: Manual de utilización del muestreador desarrollo de los microorganismos viables.
S.A.S.: 300-500 u.f.c./m3 aire). Salvo indicación en contra, es recomendable su
transporte en un sistema que lo proteja de la luz y
En este sentido cabe decir que cualquier refrigerado a 4ºC.
comparación de resultados ha de tener en cuenta
los procedimientos de muestreo utilizados, ya
que, existen diferencias importantes en la eficacia
de captación de los distintos métodos.

En cuanto a los agentes causante de enfermedades


infeccionas, ha de tenerse en cuenta el hecho
de que dichos agentes pueden ser infectivos
dentro de un amplio margen de concentraciones
ambientales, en función del distinto grado de
virulencia de las cepas y de la respuesta de un
determinado sistema inmune.

En estos casos, deberían aplicarse directamente


las medidas de control oportunas con el fin de
evitar o reducir el contacto del trabajador con el
agente biológico.

TRANSPORTE DE LAS
MUESTRAS (INSTITUTO
NACIONAL DE SEGURIDAD
E HIGIENE EN EL TRABAJO,
2014, págs. 78-81).
El transporte de las muestras es una etapa muy
importante en el proceso de medición. Las
condiciones en que se realiza el trasporte deben
permitir preservar las propiedades de las muestras
que serán analizadas. Estas condiciones dependen
del parámetro a analizar y del tipo de muestra.

Las muestras destinadas al cultivo y posterior


análisis (recuento de colonias e identificación
de especies) se deben llevar al laboratorio
lo antes posible, preferiblemente antes de

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RIESGO QUIMICOS Y BIOLÓGICO

ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS específico, incubada de nuevo y sometida a


pruebas microbiológicas que conducirán a su
identificación. En el caso de las bacterias esta
Existen numerosos métodos de análisis de
identificación se realiza principalmente mediante
los microorganismos que forman parte de los
pruebas bioquímicas, mientras que en el caso de los
bioaerosoles o de sus productos.
hongos la identificación se realiza por la morfología
de las colonias y de sus formas reproductoras.
Métodos basados en medios de
cultivo Aunque en la aplicación de estas metodologías hay
distintos factores que pueden tener significación
Se trata de una metodología muy empleada para la sobre la representatividad y fiabilidad de los
evaluación de microorganismos vivos. El método resultados obtenidos, y que deben tenerse en
permite el recuento de los microorganismos viables cuenta en el diseño y realización de la toma de
y cultivables, es decir, capaces de crecer en un muestras y análisis, se trata de unos métodos
medio de cultivo. La toma de muestras ambiental apropiados siempre y cuando su uso sea correcto
de los bioaerosoles se puede realizar tanto por y riguroso.
impacto como por borboteo o por filtrado.
Métodos no basados en medios de
El ensayo analítico consiste en el recuento
de las colonias formadas tras el cultivo de las
cultivo
muestras tomadas directamente sobre un medio
El análisis consiste en el recuento de todas
de cultivo, formadas tras la siembra y cultivo a
las partículas biológicas sin tener en cuenta si
partir de las muestras de lí¬quido de los frascos
son cultivables o son viables. Los equipos de
borboteadores (siembra directa o siembra de
muestreo más utilizados en este caso son los
diluciones) o formadas tras el cultivo del material
frascos borboteadores (impinger) o la captación
captado en los filtros. El ensayo requiere un
en filtros.
periodo de incubación a una temperatura concreta
y por un tiempo definido que depende del tipo
Los ensayos empleados habitualmente para
de microorganismo que se va a determinar. Este
el recuento de partículas biológicas son la
recuento indica la cantidad de microorganismos
microscopía (óptica o de epifluorescencia) y la
presentes en un lugar y momento determinados
citometría de flujo.
y que han formado colonias. Los resultados se
expresan en “ufc” (unidades formadoras de
La principal ventaja de estas metodologías es que
colonias) por metro cúbico de aire para mediciones
permiten cuantificar el total de microorganismos
ambientales, en centímetros cuadrados para
(viables o no) y que el tiempo de muestreo
muestreos de superficies, en mililitros o litros,
puede ser mayor que en el caso de los métodos
cuando se ha realizado un muestreo de líquidos,
basados en su cultivo. Por lo tanto, normalmente
y en gramos en el caso de muestras sólidas.
el número de microorganismos que se obtienen
por estos métodos es superior a los obtenidos en
Una de las principales ventajas de estos métodos
los métodos basados en medios de cultivo.
es que, además de proporcionar la concentración
de microorganismos tras el recuento de las colonias
obtenidas, permite realizar la identificación (género
y especie) de los microorganismos captados.
Para ello, cada una de las diferentes colonias
obtenidas debe ser aislada en un medio de agar

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Técnicas de Detección y Análisis / Condiciones de Exposición

Métodos basados en componentes la PCR (reacción en cadena de la polimerasa)


de los microorganismos cuantitativa, y que se presentan como ensayos
rápidos, sensibles y específicos.
El estudio de la exposición a bioaerosoles se puede
realizar también determinando los componentes Ahora bien, toda la información recopilada de
o metabolitos de los microorganismos, como las diferentes fuentes muestra la identificación
una estimación de la exposición a los agentes y recolección de agentes biológicos de
biológicos. De esta forma, se puede evaluar la microorganismos presentes en agua, aire o
concentración ambiental de micotoxinas, en superficie, pero también se ha visto en anteriores
el caso de los hongos, y de endotoxinas, en el contenidos que el riesgo biológico está presente
caso de las bacterias Gram negativo, como de otras formas diferentes transmitido desde
indicadores tanto de la exposición a grupos de macroorganismos como artrópodos, reptiles,
microorganismos como a géneros o especies insectos y otros. En estos casos, la toma de
concretas de los mismos. muestra y análisis de la misma en el laboratorio
no es efectiva, razón por la cual se enuncian a
La cromatografía de gases acoplada a la continuación algunos Parámetros Técnicos para
espectrometría de masas (GC-MS) es una Agentes Biológicos, retomando la recomendación
metodología que per¬mite analizar distintos de la Guía Técnica para el Análisis de Exposición a
componentes de la membrana celular (ergosterol, Factores de Riesgo Ocupacional (MINISTERIO DE
ácidos grasos, ácido muránico) así como LA PROTECCIÓN SOCIAL, 2011, págs. 120-121):
compuestos orgánicos volátiles. La cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) es una de las La determinación de la exposición a un agente
técnicas que pueden emplearse para cuantificar biológico tiene unas diferencias a lo descrito ya
micotoxinas, y el método LAL (Lisado de para agentes físicos y químicos. El levantamiento
Amebocitos de Limulus) cromogénico para la de la información en terreno implica además de lo
determinación de endotoxinas. relacionado directamente con el ámbito laboral,
el relacionar las actividades extra ocupacionales
Asimismo, se dispone de métodos inmunológicos por encuesta de hábitos y estilos de vida. El
para la detección de anticuerpos específicos realizar una descripción de la percepción del
de alérgenos fúngicos y en los últimos años se trabajador del riesgo biológico en su actividad
vienen desarrollando metodologías que emplean de trabajo, muchas veces permite objetivizar lo
técnicas de biología molecular, como, por ejemplo, no observable a través de una visita en terreno
(cuestionario higiénico).

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RIESGO QUIMICOS Y BIOLÓGICO

A este respecto vale la pena consultar le Tabla de Exposición de la metodología Biogaval.

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Técnicas de Detección y Análisis / Condiciones de Exposición

Además de lo ya expresado se recomienda ▶▶ Identificar la vía de transmisión del agente


complementar la siguiente información al valorar el biológico: agua, aire, suelo, animales, derivados
riesgo biológico y consta de los siguientes pasos: humanos (sangre, orina, fluidos, secreciones).

▶▶ Identificación de la actividad económica ▶▶ Identificar la vía de entrada al organismo:


de trabajo, la industria, las operaciones dérmica, parenteral y/o autoinoculación,
y procedimientos relacionados con la inhalatoria o por ingestión.
exposición al riesgo biológico.
▶▶ Verificar estado de inmunidad del trabajador
▶▶ Determinación del o los puestos a evaluar, las (a).
materias primas utilizadas, equipos de trabajo.
▶▶ Verificar las medidas higiénicas adoptadas.
▶▶ Identificación del agente biológico
implicado definiendo: las características ▶▶ Cálculo del nivel de riesgo biológico (R).
específicas del agente, las características
del puesto de trabajo que favorecen la ▶▶ Interpretación de los niveles de riesgo biológico.
replicación microbiana, las características
propias e individuales del agente.

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