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Faculdade de Odontologia
Bioquímica Aplicada
Roteiros de Aulas Práticas
CCV - 2011
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ÍNDICE/CRONOGRAMA
2) Método potenciométrico:
Figura 1 – Esboço de um eletrodo de pH, onde temos um eletrodo interno de referência (prata recoberto
com cloreto de prata) e uma membrana de vidro seletiva para íons H+. A diferença de
potencial estabelecida pelas diferentes atividades do íon H+ (interna constante) e externa –
variável, é detectada pelo potenciometro, comparando-se os valores a partir de uma
calibração com soluções padrão, convertendo o valor de milivolts em unidades de pH.
Adaptada a partir de (www.ufpa.br/ccen/quimica/potenciometria.htm, consultado em
14/08/09).
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Materiais e Reagentes: pHmetro, tampões de pH, agitador magnético, barras magnéticas,
suporte universal, garra para bureta, bureta de 25 ou 50 mL, béquer de 100 mL, béquer de 250
mL pisseta, pêra de borracha, pipeta volumétrica de 25, 50 e de 100 mL, proveta de 50 mL,
soluções de ácido clorídrico (HCl ou H2SO4) 0,1; 0,01; 0,001 e 0,0001 mol L-1.
Pipete uma alíquota da amostra com volume adequado (20 a 30 mL), transfira para um
béquer, introduza o eletrodo de pH na amostra e titule até pH 7,0. O volume da amostra e a
concentração da solução de ácido sulfúrico deverão ser escolhidos de modo a que o consumo
volumétrico de ácido na titulação, situe-se entre aproximadamente 20 e 90% da capacidade
volumétrica da bureta.
Tabela de Resultados
Volume de ácido pH Volume de ácido pH
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2- Determinação da faixa de tamponamento do tampão acetato
1.Fundamentos teóricos
2. o número de mols por litro de H+ ou OH- necessários para causar uma dada mudança no pH
(por exemplo, 1 unidade), ou
3. a mudança do pH que ocorre após a adição de uma dada quantidade de H+ ou OH- (por
exemplo, 1 mol/litro).
2. Parte experimental
Reagentes Materiais
-1
1. NaOH 0,1 mol L 1. medidor de pH (pHmetro)
2. Solução de ácido acético 0,1 M 2. 1 Erlenmeyer de 50 mL
3. Solução de Acetato de sódio 0,1 M 3. funil
4. padrões de pH= 4 e pH= 7 4. 1 bureta e respectivo suporte
5. provetas
6. 1copo de béquer
6
1. Preparar 100 mL de uma solução de tampão acetato 0,1M a partir das soluções aquosas de
ácido acético 0,1M e de acetato de sódio 0,1 M utilizando uma proveta.
2. Homogeneizar a solução.
3. Calibrar o peagâmetro.
4. Transferir 25 mL da solução para um copo de béquer de 50 mL e medir o pH da solução
utilizando o peagâmetro.
5. Preencher uma bureta com solução de NaOH 0,1mol L-1 e adicionar 1,0 mL desta solução ao
Erlenmeyer contendo o tampão acetato. Homogeneizar.
6. Verificar o pH e anotar na Tabela de resultados.
7. Repetir o procedimento, ou seja, adicionar 1,0 mLde NaOH 0,2 mol L-1, agitar e verificar o
pH, até que ocorra uma variação brusca no valor de pH.
Tabela de Resultados
Volume de NaOH pH Volume de NaOH pH
Questões:
Objetivo: preparar um sistema tampão a partir dos sais carbonato e bicarbonato de sódio e avaliar
a sua capacidade de tamponamento utilizando o pHmetro.
Introdução
Saliva é um fluido que protege a mucosa bucal de diversas formas. Trata-se de um líquido
límpido secretado na boca pela ação das glândulas salivares e mucosas, umedece a boca e dá
início à digestão de carboidratos. É através de uma suplementação adequada de saliva que nosso
organismo preserva e mantém o tecido oral saudável. Entre suas funções da saliva podemos citar:
(1) auxilia na degustação (sabor) dos alimentos; (2) protege e lubrifica a mucosa bucal; (3) dilui o
alimento ingerido (especialmente sais e açúcares); (4) pela diluição e pelo fluxo vem contribuir
também para a limpeza; (5) possui capacidade de tamponamento; (6) auxilia na manutenção da
integridade do esmalte, através da remineralização, devido à presença de quantidades saturantes
de cálcio e fósforo (PO43-), constituintes do esmalte; (7) contribui para a digestão, quebrando
inicialmente o amido até subunidades menores e auxiliando na formação do bolo alimentar; (8)
possui função de reparo de tecido – auxilia na coagulação; (9) possui propriedades
antimicrobianas – especialmente antibacterianas.
O tamponamento da saliva é feito por mais de um sistema tampão, entre eles temos
algumas proteínas como a sialina e a mucina. Entretanto, os principais são o tampão fosfato,
formado pelo ácido fosfórico e sais de fosfato, e o sistema carbonato/bicarbonato. Este último é o
mais importante para a saliva estimulada.
Procedimento experimental
Materiais
02 Copos de béquer de 100 mL () para soluções;
02 Copos de béquer de 50 mL para determinação do pH das soluções.
04 Balões volumétricos de 100 mL para soluções e diluições
04 Balões volumétricos de 50 mL para diluições
02 Provetas de 25 mL
02 pipetas graduadas de 10 mL
Pipetas Pasteur para completar o volume
pHmetro
Papel indicador de pH
H2SO4 0,1 mol L-1
NaOH 0,2 mol L-1
2 Buretas de 50 mL
A solução de carbonato 0,2 mol L-1 é preparada dissolvendo-se 2,12 g de carbonato (Na2CO3) em
80 mL de água. Para dissolver o sal completamente podemos utilizar agitação magnética ou o
bastão de vidro. Após a dissolução completa transferir a solução resultante para um balão de 100
mL e completar até a marca com água destilada.
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Solução de bicarbonato de sódio 0,2 mol L-1
Volume de Volume de pH da pH da
Na2CO3 NaHCO3 H2O Concentração solução solução
solução
0,2 mol L-1 0,2 mol L-1 (mL) (mol L-1) (pHmetro) (papel
(mL) (mL) indicacor)
1 8 17 25
2 17 8 25
3 8 17 100
4 17 8 100
Utilizando uma solução tampão concentrada e uma solução tampão diluida preparadas
acima determine a sua faixa de tamponamento (pequena variação de pH) quando são
adicionados um ácido ou uma base, registrando os valores de pH na Tabela abaixo.
1. Calibrar o peagâmetro.
2. transferir 25 mL da solução para um Erlenmeyer de 50 mL e medir o pH da solução
utilizando o pHmetro.
3. Preencher uma bureta com solução de H2SO4 0,1mol L-1 e adicionar 1,0 mL desta solução
ao Erlenmeyer contendo o tampão acetato. Homogeneizar.
4. Verificar o pH e anotar na Tabela de resultados.
5. Repetir o procedimento, ou seja, adicionar 1,0 mLde NaOH 0,2 mol L-1, agitar e verificar o
pH, até que ocorra uma variação brusca no valor de pH.
Questões:
A saliva colhida sem nenhum estímulo mastigatório ou gustativo, salivando passivamente dentro
de uma proveta, é um indicador mais confiável de fluxo de saliva reduzido e de hipossalivação do
que a saliva estimulada.
Instruções:
1. O paciente não deve comer ou beber (exceto água) 1 hora antes da coleta.
2. A saliva do mesmo indivíduo deve, se possível, ser coletada na mesma hora do dia.
3. O paciente não deve fumar ou sofrer grande estresse físico antes da coleta.
4. É recomendado um período de pré-amostragem (1 min)
5. Deve ser utilizado um tempo fixo de coleta (5 min – saliva estimulada; 10 – 15 min, saliva não
estimulada)
6. O paciente deve sentar-se em posição relaxada em uma cadeira comum, não na cadeira
odontológica.
7. As amostras contendo sangue visível devem ser descartadas se houver planejamento para
análise química da saliva.
Procedimento:
1. Mascar uma amostra de parafilme ou goma de mascar sem açúcar por 1 min.
2. Deglutir a saliva acumulada.
3. Tornar a mascar a mesma goma por 5 min, coletando a saliva produzida em um copo
descartável, previamente pesado na balança analítica.
(Observação: Não descartar a saliva coletada, esta será utilizada no experimento seguinte
“capacidade tamponante da saliva”)
Resultados
Tempo de coleta:
Interpretação:
Objetivo: Estudar a variação de pH da saliva pela adição de ácido lático, um ácido normalmente
produzido por bactérias da placa dental.
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1. Fundamentos Teóricos
A determinação da CTS se faz por titulometria, medindo-se o volume de ácido lático 0,1 mol L-1
necessário para baixar o pH salivar de 6,9 a 3,7 (ponto de viragem do alaranjado de metila). O
indicador é amarelo-laranja a 6,9 e róseo a 3,7.
Parte A
Dentro de certos limites, a CTS funciona como um índice relativo de atividade de cárie dental.
2. Parte Experimental
Reagentes Materiais
Ácido lático 0,1 mol L-1 100 mL Bureta de 25 mL
Indicador alaranjado de metila copo de bequer de 50 mL
Erlenmeyer de 125 mL
Proveta de 10 mL
copo de plástico descartável
pipetadores
gaze para filtrar a saliva
3. Procedimento
3. Titular a saliva diluida com o ácido lático, deixando verter gota a gota para o Erlenmeyer até o
ponto de viragem (de amarelo-laranja para rosa).
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Resultados:
Para exprimir a capacidade tamponante da saliva (CTS) – devemos multiplicar o volume de ácido
lático gasto por 10. Os pacientes podem ser classificados em três grupos:
Dentro de certos limites, a CTS funciona como um índice relativo de atividade de cárie dental.
Parte (B)
2.1 MATERIAL
2.2 MÉTODO
Pipetar 0,5 mL de saliva estimulada e acrescentar a um tubo contendo 1,5 mL de HCl 5 mM. Agitar
o tubo. Abrir para desprender o CO2 dissolvido na saliva e, após no mínimo 5 min, determinar o pH.
Se o pH final for MENOR que 4,5 a capacidade tampão da saliva estimulada é considerada BAIXA;
INTERMEDIÁRIA quando entre 4,6 - 5,5 e BOA quando superior a 5,5 (FROSTELL, 1980;
WIKNER & NEDLICH, 1985). Segundo ERICSSON (1959) NORMAL seria entre 5,75 - 6,50 e
MUITO BAIXO o menor que 4,0.
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5- Composição química da saliva: constituintes minerais
Objetivos: utilizando testes bioquímicos, identificar alguns dos componentes principais da saliva.
A saliva é o líquido que umedece a cavidade bucal, sendo segregada por todas as glândulas
salivares da mucosa bucal. Suas funções incluem:
1. Proteção da mucosa bucal e dos dentes, com uma lubrificação perfeita, evitando o
ressecamento.
2. Defesa através da lisozima, do tiocianato e das imunoglobulinas.
3. Aglutinação das partículas alimentares para a formação do bolo alimentar
4. Digestão inicial dos polissacarídeos como amido e glicogênio.
5. Regulação do pH do meio bucal a 6,9 através dos tampões salivares.
6. Autóclise ou autolimpeza da bica através dos movimentos mastigatórios.
Materiais e Métodos
4 tubos de ensaio
1 cápsula de porcelana
Copo de plástico descartável para coletar a saliva
HNO3 (5% v/v)
Solução de nitrato de prata AgNO3 2% (p/v)
Ácido acético (5% v/v)
Oxalato de amônio 4% (p/v)
HCl 5% (v/v)
FeCl3 5% (v/v)
Ácido sulfúrico 10% (v/v)
Iodeto de potássio 10%
Solução de amido 1% (p/v)
2 tubos de centrífuga
Procedimento:
Coletar cerca de 5 mL de saliva, centrifugar por cerca de 5 min e utilizar esta amostra nos
diversos testes conforme descrito abaixo.
OBS.: Nos testes abaixo utilizar sempre como controle um segundo tubo de ensaio contendo água
destilada.
1. Presença de cloretos: Adicionar 1,0 mL de saliva em um tubo de ensaio, juntar uma gota
de ácido nítrico 5%. Adicionar 2 gotas de nitrato de prata a 2%. Observar, anotar e
concluir.
Explicação: O ácido nitroso proveniente dos nitritos decompõe o iodeto de potássio, liberando
iodo, o qual irá corar a solução de amido.
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6- Determinação de constituintes orgânicos na saliva
1. Presença de proteínas:
As proteínas podem ser dosadas em diversos materiais biológicos por várias metodologias. A
reação do Biureto, que é utilizada para a caracterização de proteínas pode ser empregada para a
quantificação das mesmas mediante a colorimetria.
Material e Métodos
Reação de biureto:
2. Presença de mucina
A saliva deve sua alta viscosidade à presença de mucina, uma glicoproteína, insolúvel em meio
ácido e em álcool.
2.1 Precipitação por ácido: colocar eu um tubo de ensaio 2,0 mL de saliva e acidificar com
algumas gotas de ácido acético (5%). Observe o aparecimento de um precipitado (acetato de
mucina).
2.2. Precipitação por álcool: em um tubo de ensaio adicionar 2,0 mL de saliva e 4,0 mL de álcool
etílico (95%). Observar a formação de um precipitado de mucina.
Prova controle:
RELATÓRIO
Deverá ser feito um relatório sobre os resultados obtidos na caracterização da saliva contendo
envolvendo os experimentos de fluxo e capacidade de tamponamento, contendo:
Referências
1. Edgar, WM, O’Mullane, DM. Saliva and oral health. Segunda edição. Londres: British Dental
Association, 1996. 140p.
2. Ericsson Y, Hardwick L. Individual diagnosis, prognosis and counselling for caries
prevention. Caries Res 1978;12:94-102.
3. Frostell G. A colourimetric screening test for evaluation of the buffer capacity of saliva.
Swed Dent J 1980;4:81-86.
4. Kedjarune U, Migasena P, Changbumrung S, Pongpaew P, Tungtrongchitr R. Flow rate and
composition of whole saliva in children from rural and urban Thailand with different
caries prevalence and dietary intake. Caries Res 1997;31:148-154.
5. Kivelä J, Parkkila S, Parkkila AK, Rajaniemi H. A low concentration of carbonic anhydrase
isoenzyme VI in whole saliva is associated with caries prevalence. Caries Res
1999;33:178-184.
6. Levine, M J. Development of Artificial Salivas. Crit Rev Oral Biol Med 1993;4:279-286.
7. Mandel I D. The role of saliva in maintaining oral homeostasis. JADA 1989:119:298-304.
8. Sreebny L, Banoczy J, Baum B, Edgar W, Epstein J, Fox P, Larmas M. Saliva: its role in
health and disease. Int Dent J 1992;42:291-304.
9. Wikner S, Nedlich U. A clinical evaluation of the ability of the Dentobuff method to
estimate buffer capacity of saliva. Swed Dent J 1985;9:45-47.
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7- Determinação quantitativa de tiocianato (SCN-) na saliva
Objetivos: Verificar as diferenças dos teores deste anion na saliva de fumantes e não-fumantes.
Fundamentos teóricos:
Soluções estoque:
Procedimento:
4. Coletar cerca de 1 mL de saliva e transferir para um tubo de ensaio que deverá ser equilibrado
com outro tubo contendo água para centrifugar.
5. Centrifugar a saliva coletada a 3.000 rpm por 5 min.
6. Após centrifugação, coletar 200 L de saliva e diluir com nitrato de ferro até 10 mL.
(observação: esta diluição faz com que todo o SCN- presente na saliva seja transformado em
FeSCN2+ para que possa ser estimado a partir de uma curva de calibração).
7. Fazer a leitura de absorbância da amostra de saliva diluída em nitrato de ferro e interpolar e
determinar o valor de concentração de tiocianato.
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8- Verificação da atividade da amilase salivar
Objetivo: Verificar a atividade da amilase salivar por dois métodos: (1) Identificação da estrutura
do polissacarídio com o reativo de lugol (na presença de polissacarídio produz uma coloração azul
escura); (2) Identificação de carboidrato redutor utilizando a reação de Fehling.
A amilase salivar é uma enzima presente na saliva capaz de quebrar moléculas de polissacarídios
como amido e glicogênio conforme esquema abaixo:
(2) Ao ser hidrolisado, o amido é quebrado em fragmentos menores que podem ter uma
extremidade redutora como a maltose (Figuras 1 e 2), o que permite sua identificação avaliando-
se a redução de cobre presente no reativo de Fehling.
Cu2+ + e- Cu+
Ag+ + e- Ag0
Para evitar que esta reação mascare o teste que indica a presença de carboidrato redutor, o íon
Cu2+ é mantido em solução alcalina sob a forma de complexo. Há então vários reagentes à
base de Cu2+, que diferem em relação ao solubilizador ou ao alcalinizante.
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Procedimento Experimental
Materiais Reagentes
3) Diluir a saliva com a solução salina (NaCl 0,9%) na proporção de 1:10 (1mL saliva + 9 mL
solução salina).
6) Após a incubação, retirar duas alíquotas de 2 mL de cada tubo, deste modo você tem 6 (seis)
novos tubos (num total de 6 alíquotas – 2 para cada tubo).
8) Acrescentar à alíquota número 1 de cada tubo uma gota do reagente de lugol e observar.
10) Aquecer somente os tubos que contém os reativos de Fehling em banho maria fervente.
Fazer um relatório
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9- Determinação colorimétrica de cálcio
Objetivos: Detecção de íons cálcio (Ca2+) liberados da hidroxiapaptita pelo tratamento com ácido
clorídrico.
Fundamentos teóricos:
Após tratamento com ácido clorídrico (20%) o esmalte das estruturas dentárias foi
desmineralizado liberando cálcio e fosfato da matriz de hidroxiapatita. Parte da estrutura mais
interna do dente também foi atacada, liberando carbonato de cálcio. Na aula anterior verificamos
que o ataque ácido do dente libera CO2, a partir do carbonato de cálcio.
Na aula de hoje vamos verificar a quantidade de cálcio liberada pelo tratamento com ácido
clorídrico empregando um método colorimétrico. Empregando um “Kit” fornecido pela Laborlab,
podemos estimar a concentração de íons Ca2+.
O teste normalmente é feito para determinar os níveis de cálcio no soro ou urina. Além de
sua importância na contração muscular, transmissão nervosa e coagulação sangüínea, o cálcio é
importante constituinte da substância mineral dos ossos e dos dentes. Cálcio e fósforo são
particularmente importantes na formação dos cristais de hidroxiapaptita – Ca10(PO4)6.(OH)2 – que
se precipitam nas matrizes protéicas, produzindo o esmalte e a dentina perfeitamente calcificados
e endurecidos.
Procedimento:
Antes da adição da amostra, devemos obter os valores de absorbância dados apenas pelos
reagentes. Estes valores são considerados absorbância do “branco ou controle” e deverao ser
descontados do valor de absorbância da amostra.
O material a ser utilizado, tubos de ensaio, ponteiras utilizadas nos pipetadores automáticos,
pipetas, etc. devem estar rigorosamente limpos, livres de cálcio e de traços de anticoagulantes.
Aconselha-se lavar a vidraria com detergente não iônico ou com solução diluida de ácido mineral,
lavando após, várias vezes com água deionizada.
A técnica se caracteriza por valores de absorbância de amostras controle (branco) muito baixas.
No caso em que valores de absorbância do controle (antes da adição da amostra) forem
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superiores a 0,2 unidades de absorbância, devemos desprezar os reagentes ou selecionar outro
tubo para análise pois os valores podem indicar contaminação prévia com íons cálcio.
Técnica:
5. Adicionar 10 microlitros (10 L) de padrão no tubo (P) e 10 microlitros (10 L) de amostra no
tubo (A), incubar na bancada por 10 minutos (Tabela 2).
Cálculos:
10mgdL1
Onde f
A( amostrapadrão570nm) A(brancopadrão570nm)
Valores de referência:
Paralelamente ao teste de Fosdick, incubar amostras de esmalte, dentina e/ou cemento com
soluções de pH 3,0; 5,0; 5,5; 6,0 e 7,0.
Verificar o pH mínimo para a dissolução da hidroxiapatita pela liberação de cálcio (próxima aula).
Material e métodos
1. fotômetro (570 nm)
2. Estante com 12 tubos de ensaio
3. pipeta graduada de 5 mL
4. pipetador automático (10 e 20 L)
5. 2 tubos para o fotômetro
Reagentes
1. corante (CFX)
2. Solução tampão
3. Reativo padrão de cálcio
Procedimento:
1. Identificar os tubos conforme descrito na Tabela 1, onde a solução padrão de cálcio (10 mg dL-
1
) é identificada como (P) e as amostras correspondem a “controle” (concentração de cálcio
presente na saliva - até 110 mg dL-1); amostra (teste Fosdick) e amostras em diversos pHs (A1 –
A5).
2. Adicionar o corante (CFX) – 20 L, com o auxílio de um pipetador automático.
3. Adicionar 1,5 mL do tampão, misturar e fazer as leituras no espectrofotômetro utilizando o
comprimento de onda de 570 nm, zerando o aparelho com água destilada.
4. Anotar os valores de leitura de absorbância do branco (inicial) e da amostra na Tabela 1.
5. Adicionar 10 L de padrão no tubo P e 10 L de cada amostra no respectivo tubo.
Fundamentação teórica:
A cárie dental ocorre devido ao contato de bactérias da placa dental com a superfície do esmalte.
Neste processo ocorre a fermentação anaeróbica de açucares por estes microrganismos e a
conseqüente liberação de ácido lático, capaz de dissolver o esmalte.
Materiais e Métodos
Procedimento:
Após separação das estruturas dentárias utilizando soluções com densidade diferente. O material
obtido foi então incubado com saliva na presença de sacarose, onde se verifica um abaixamento
de pH com liberação de íons cálcio.
10mgdL1
Onde f
A( amostrapadrão570nm) A(brancopadrão570nm)
Conforme verificamos anteriormente, a saliva contém certa massa de cálcio dissolvido com
valores de referência entre 88 a 110 mg dL-1. Portanto, devemos subtrair o valor de cálcio total
(após dissolução da hidroxiapatita) do valor inicial determinado na saliva a pH 7,0 ou na amostra
incubada na ausência de esmalte.
Assim sendo, a massa de cálcio solubilizada é dada pela diferença entre a massa de cálcio na
saliva original e na amostra previamente incubada. A diferença entre a última e a primeira
representa a massa solubilizada de cálcio e exprime o grau de suceptibilidade à cárie dental.
Resultados:
Concentração de
cálcio solubilizado Símbolos Significado
(mg dL-1)
<1 - Imune
1a2 +/- Quase imune
2a4 + Levemente susceptível
4 a 10 ++ Susceptível
10 a 20 +++ Muito susceptível
acima de 20 ++++ Altamente susceptível
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12- Teste de Snyder
Fundamentação teórica:
O amarelo indica teste positivo; a leitura e interpretação dos resultados é feita conforme a Tabela
1.
Materiais e métodos
Preparo: dissolver os sais a quente e ajustar o pH a 4,7. Se, após a dissolução dos reagentes o
pH do meio estiver acima de 4,7, adicionar gotas de HCl 1mol L-1. Caso contrário, ou seja, se o
pH estiver abaixo de 4,7, adicionar gotas de NaOH 0,1 mol L-1 até ajustar.
Procedimento:
Inoculo
OBS.: o inoculo deverá ser feito próximo à chama do bico de Bunsen com pipeta estéril. Após a
inoculação, agitar e colocar em estufa a 37ºC durante 72 horas, sendo observados a cada 24
horas, anotando o resultado quanto à mudança de pH e coloração.
Interpretação:
Observar o tubo ao fim de 24, 48 e 72 horas. O resultado é positivo (+) quando a cor muda de
verde azulado para amarelo. A leitura e interpretação dos resultados são feitas conforme a Tabela
1.
Fundamentos teóricos:
Esmalte é o tecido que reveste a coroa do dente, sendo produzido por células de origem
ectodérmica chamadas ameloblastos, ou adamantoblastos. Representa o tecido mais duro do
organismo, sendo formado pelos prismas de esmalte, especialmente construídos pelos
ameloblastos. Os prismas de esmalte apresentam-se formados por 96 % de minerais, na forma de
cristais de hidroxiapatita, Ca10(PO4)6.(OH)2, o que lhe confere elevada dureza. Possui apenas
0,5% de substâncias orgânicas e 3,5% de água. O elevado teor de sólidos faz do esmalte um
tecido muito compacto, pouco permeável e de densidade da ordem de 3,0 g cm-3.
Como acontece no osso, a maior parte dos minerais dentários se encontra na forma de
cristalitos de hidroxiapatita, Ca10(PO4)6.(OH)2, e o restante encontra-se no estado amorfo em volta
dos cristalitos.
A fração mineral de cristalitos de hidroxiapatita é fixa, ao passo que a fração amorfa é lábil,
renovando-se continuamente. A quantidade de fósforo é a metade da quantidade de cálcio,
enquanto o carbonato aparece em maior quantidade no cemento. A presença de flúor é
importante na profilaxia da cárie dental, que envolve dissolução de cálcio dos cristais de
hidroxiapatita. O flúor substitui o radical hidroxila da hidroxiapatita, formando fluorapatita, que é
apresenta menor solubilidade que a hidroxiapatita, sendo, portanto, mais resistente ao ataque do
ácido lático produzido pelas bactérias. Além disso, o íon fluoreto inibe a enolase, uma enzima
bacteriana envolvida nas etapas de síntese de ácido lático a partir da glicose.
Todo o tecido duro apresenta uma matriz protéica que serve de base para a precipitação
dos sais de cálcio e posterior endurecimento da estrutura. Má formação da matriz implicará em
uma estrutura malformada, da mesma forma que deficiente mineralização provocará o
aparecimento de regiões hipo-calcificadas ou mesmo não calcificadas. No esmalte a quantidade
de proteínas é muito pequena (aproximadamente 0,3%). Por este motivo, o esmalte apresenta
uma elasticidade reduzida e cliva-se com facilidade. Na dentina os teores de substâncias
orgânicas é superior, porém menor que a do cemento. A matriz protéica da dentina é elevada
(aproximadamente 20%) e a do cemento (cerca de 32%).
1. Colágeno, uma escleroproteína que tem altos teores dos aminoácidos glicina (19%),
hidroxiprolina (13%), contendo também em menores proporções os aminoácidos lisina e
hidroxilisina. O colágeno é o principal componente protéico das matrizes da dentina e do cemento.
2. Glicoproteínas ácidas sulfatadas – aparecem ao lado das escleroproteínas e têm altos níveis
de ácidos condroitinossulfúricos, que são macromoléculas importantes das matrizes da dentina e
do cemento.
Materiais e Métodos
6 tubos de ensaio, mangueira adaptada em tubo de vidro e rolha de borracha para coletar CO2.
1 Cápsula de porcelana.
1 amostra de dente humano obtido na Clínica Odontológica.
Extrato ácido de dentes humanos (dentes obtidos na clínica odontológica)
Ácido clorídrico 20% v/v (20 mL de HCl concentrado em 100 mL de água)
Solução de Oxalato de amônio 4%
Reativo molíbidico (Molibidato de amônio)
Reativo de Millon
Solução de tiocianato de potássio (10% peso/volume - p/v)
Banho de gelo
30
Procedimento:
1. Pesquisa de carbonatos:
2. Presença de proteínas:
3. Prova do colágeno:
2. Presença de cálcio:
Transferir 1,0 mL de extrato ácido do dente para um tubo de ensaio. Adicionar 5 gotas de
solução de oxalato de amônia (4%). Deverá se formar um precipitado branco. Em que consiste?
3. Presença de fosfatos:
4. Presença de ferro:
Objetivos: obter separadamente esmalte, dentina e cemento para tratamento com ácido e
dissolução da hidroxiapatita.
Materiais
2 Tubos de centrífuga
Pérolas de vidro – para equilibrar o tubo em diagonal na centrífuga
Balança com um copo de béquer para pesar e equilibrar os tubos
Soluções de densidade 2,7 g cm-3, 2,42 g cm-3 e 2,07 g cm-3
Procedimento:
A dentina (com densidade 2,14 g cm-3) e o cemento (densidade 2,03 g cm-3) flutuam, ao passo
que o esmalte (densidade 2,89 g cm-3) irá sedimentar.
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3. Separar a mistura dentina e cemento por filtração em funil com papel filtro e secar na estufa
para posterior tratamento.
O esmalte assim obtido ainda não está puro. Para purificá-lo devemos juntar ao esmalte 3,0 mL
de bromofórmio puro (densidade 2,85 g cm-3). Agitar a mistura e centrifugar novamente. O
restante da dentina e cemento ficam no sobrenadante, enquanto o esmalte precipita. Guardar o
esmalte obtido.
Observação:
Não desprezar a solução após filtração, voltar as soluções para os frascos correspondentes.
3. Obtendo dentina:
1. Após filtração da mistura de cemento e dentina, secar o papel de filtro e transferir para um tubo
de centrífuga.
2. Adicionar 3 mL da solução de densidade 2,42. Centrifugar como anteriormente.
1. Após secar o material em papel de filtro, transferir para o tubo de centrífuga a mistura
dentina-cemento.
3. Filtrar o sobrenadante para separar o cemento. Secar na estufa. Secar a dentina no próprio
tubo.
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