Você está na página 1de 32

Centro de Ciências da Vida

Faculdade de Odontologia

Bioquímica Aplicada
Roteiros de Aulas Práticas

Prof. Augusto Etchegaray Júnior

CCV - 2011
2
ÍNDICE/CRONOGRAMA

Data Página Experimento


20/08 3 Determinação potenciométrica de pH
27/08 5 Determinação da faixa de tamponamento do tampão acetato
03/09 7 Preparo do sistema tampão carbonato/bicarbonato
10/09 8 Avaliação da faixa de tamponamento de sistemas tampão
carbonato/bicarbonato
17/09 10 Determinação do fluxo salivar e da Capacidade tamponante da
saliva
24/09 13 Composição química da saliva: constituintes minerais
01/10 14 Composição química da saliva: constituintes orgänicos
08/10 17 Determinação quantitativa de tiocianato (SCN-) na saliva/Relatório
22/10 1a avaliação teórico - prática
29/10 18 Verificação da atividade da amilase salivar
12/11 22 Determinação colorimétrica de cálcio
19/11 24 Determinação do pH de dissolução da hidroxiapaptita
26/11 25 Teste de Fosdick
03/12 26 Teste de Fosdick/relatório
10/12 28 Separação das estruturas dentárias/Composição química do dente
17/12 2a avaliação prática
3
1- Determinação potenciométrica de pH

pHmetro: equipamento utilizado para medidas potenciométricas de pH.

O valor de pH de uma solução está relacionado com a concentração de íons H+ a partir da


relação: pH = -log [H+].
O valor de pH pode ser medido utilizando-se:

1) Método colorimétrico. Este método é baseado no uso de indicadores de pH na forma de


solução (indicadores internos), como exemplo temos a solução de fenolftaleína, ou ainda
impregnados em papel (indicadores externos) ; exemplo (fita de pH). Normalmente, junto à fita de
pH é fornecida uma escala de onde se deduz o valor de pH da solução comparando-se a variação
de uma ou mais cores, de acordo com a escala. Fitas de pH são muito utilizadas pois facilitam os
trabalhos em que é necessário uma precisão em torno de 0,2 a 0,5 unidades de pH. Para se obter
maior precisão é necessário o uso de um pHmetro.

2) Método potenciométrico. Outra forma de determinar o pH de uma solução é empregando-se o


método potenciométrico (pHmetro), descrito a seguir.

1) Método colorimétrico: Uso de indicadores universais e de papel de pH

O método colorimétrico baseia-se no conhecimento dos pKs dos indicadores.


Relembrando, o pK de um ácido ou de uma base é o valor de pH em que a solução de ácido ou
base contém 50% da espécie na forma de um ácido e 50% na forma da base conjugada. A
espécie protonada e desprotonada de um indicador apresenta colorações diferentes, sendo a
mudança de cor característica para uma faixa de pH.

2) Método potenciométrico:

Objetivo : Entender o procedimento de calibração de um potenciômetro para medidas de pH

Na determinação potenciométrica de pH utiliza-se um potenciometro que determina a


concentração de íons H+ presentes na solução por padronização com soluções tampão de
concentração conhecida, um eletrodo interno (referência) e um eletrodo de vidro com membrana
seletiva para H+.

Figura 1 – Esboço de um eletrodo de pH, onde temos um eletrodo interno de referência (prata recoberto
com cloreto de prata) e uma membrana de vidro seletiva para íons H+. A diferença de
potencial estabelecida pelas diferentes atividades do íon H+ (interna constante) e externa –
variável, é detectada pelo potenciometro, comparando-se os valores a partir de uma
calibração com soluções padrão, convertendo o valor de milivolts em unidades de pH.
Adaptada a partir de (www.ufpa.br/ccen/quimica/potenciometria.htm, consultado em
14/08/09).
4
Materiais e Reagentes: pHmetro, tampões de pH, agitador magnético, barras magnéticas,
suporte universal, garra para bureta, bureta de 25 ou 50 mL, béquer de 100 mL, béquer de 250
mL pisseta, pêra de borracha, pipeta volumétrica de 25, 50 e de 100 mL, proveta de 50 mL,
soluções de ácido clorídrico (HCl ou H2SO4) 0,1; 0,01; 0,001 e 0,0001 mol L-1.

Indicador de pH (fenolftaleina, alaranjado de metila)

Procedimento: Calibre o potenciômetro conforme instruções do professor, lembrando-se que o


primeiro tampão a ser utilizado será o de pH = 7,00 (ou pH 6,86 em alguns aparelhos) e depois o
tampão de pH = 4,00 (ou 4,01)

Pipete uma alíquota da amostra com volume adequado (20 a 30 mL), transfira para um
béquer, introduza o eletrodo de pH na amostra e titule até pH 7,0. O volume da amostra e a
concentração da solução de ácido sulfúrico deverão ser escolhidos de modo a que o consumo
volumétrico de ácido na titulação, situe-se entre aproximadamente 20 e 90% da capacidade
volumétrica da bureta.

Cálculos: A partir de uma das reações abaixo:

NaOH + H2SO4 + H2O

NaOH + HCl + H2O

Determine o valor da concentração da solução desconhecida de NaOH

1. Calibrar o peagâmetro com os padrões de pH 6,86 e 4,01, seguindo as instruções do


professor.
2. Transferir 25 mL da solução para um copo de béquer de 50 mL e medir o pH da solução de
NaOH de concentração desconhecida, utilizando o peagâmetro.
3. Preencher uma bureta com a solução de H2SO4 de conou HCl de concentração escolhida e
adicionar 1,0 mL desta solução ao Erlenmeyer contendo a amostra. Homogeneizar.
4. Verificar o pH e anotar na Tabela de resultados.
5. Repetir o procedimento, ou seja, adicionar + 1,0 mL de ácido, agitar e verificar o pH, até que
ocorra uma variação brusca no valor de pH (pH ~ 7,0) ou mudança de coloração do
indicador.

Tabela de Resultados
Volume de ácido pH Volume de ácido pH
5
2- Determinação da faixa de tamponamento do tampão acetato

Objetivo : Estudar a variação de pH de uma solução tampão utilizando o peagâmetro.

1.Fundamentos teóricos

Objetivos: Entender o que é um sistema tampão e como ele funciona.

Um tampão de pH é uma substância, ou mistura de substâncias, que permite às soluções


resistirem a grandes mudanças no pH quando são adicionadas pequenas quantidades de íons H+
ou OH-.

Os tampões comuns contêm duas substâncias, um ácido conjugado e uma base


conjugada. Um tampão “ácido” contém um ácido fraco e um sal do ácido fraco (base conjugada).
Um tampão “básico” contém uma base fraca e um sal da base fraca (ácido conjugado). As duas
espécies juntas (ácido conjugado + base conjugada) resistem a grandes mudanças no pH,
absorvendo “parcialmente” as adições de íons H+ ou OH- ao sistema. Se íons H+ são adicionados
à solução tamponada, eles reagem parcialmente com a base conjugada presente, para formar o
ácido conjugado, logo, alguns íons H+ que abaixariam o pH são eliminados. Da mesma forma, se
íons OH- são adicionados, eles reagem parcialmente com o ácido conjugado presente, para
formar água e a base conjugada. Logo, alguns íons OH- são eliminados e o pH da solução
permanece praticamente inalterado.

Os tampões, na verdade, mudam seu pH quando se adicionam íons H+ ou OH-. Contudo, a


mudança é muito menor do que aquela que ocorreria se a solução não fosse tamponada. O grau
de mudança depende da força do tampão e da razão [A- ]/[HA].

Em geral, um tampão é usado para manter o pH relativamente constante durante o curso


de uma reação que produz ou utiliza íons H+. A capacidade de um tampão manter um pH quase
constante aumenta à medida que a concentração do tampão aumenta.

A propriedade de um tampão de resistir a mudanças no pH é chamada de “capacidade de


tamponamento”. A capacidade de tamponamento pode ser definida de duas maneiras:

2. o número de mols por litro de H+ ou OH- necessários para causar uma dada mudança no pH
(por exemplo, 1 unidade), ou
3. a mudança do pH que ocorre após a adição de uma dada quantidade de H+ ou OH- (por
exemplo, 1 mol/litro).

2. Parte experimental
Reagentes Materiais
-1
1. NaOH 0,1 mol L 1. medidor de pH (pHmetro)
2. Solução de ácido acético 0,1 M 2. 1 Erlenmeyer de 50 mL
3. Solução de Acetato de sódio 0,1 M 3. funil
4. padrões de pH= 4 e pH= 7 4. 1 bureta e respectivo suporte
5. provetas
6. 1copo de béquer
6

Preparação de uma solução Tampão Ácido acético-Acetato de Sódio.

1. Preparar 100 mL de uma solução de tampão acetato 0,1M a partir das soluções aquosas de
ácido acético 0,1M e de acetato de sódio 0,1 M utilizando uma proveta.
2. Homogeneizar a solução.
3. Calibrar o peagâmetro.
4. Transferir 25 mL da solução para um copo de béquer de 50 mL e medir o pH da solução
utilizando o peagâmetro.
5. Preencher uma bureta com solução de NaOH 0,1mol L-1 e adicionar 1,0 mL desta solução ao
Erlenmeyer contendo o tampão acetato. Homogeneizar.
6. Verificar o pH e anotar na Tabela de resultados.
7. Repetir o procedimento, ou seja, adicionar 1,0 mLde NaOH 0,2 mol L-1, agitar e verificar o
pH, até que ocorra uma variação brusca no valor de pH.

Tabela de Resultados
Volume de NaOH pH Volume de NaOH pH

Questões:

1. Trace a curva de titulação para a solução tampão.


2. Comente os resultados obtidos evidenciando a capacidade de tamponamento do tampão
acetato.
7
3- Preparo do sistema tampão carbonato/bicarbonato

Objetivo: preparar um sistema tampão a partir dos sais carbonato e bicarbonato de sódio e avaliar
a sua capacidade de tamponamento utilizando o pHmetro.

Introdução

Saliva é um fluido que protege a mucosa bucal de diversas formas. Trata-se de um líquido
límpido secretado na boca pela ação das glândulas salivares e mucosas, umedece a boca e dá
início à digestão de carboidratos. É através de uma suplementação adequada de saliva que nosso
organismo preserva e mantém o tecido oral saudável. Entre suas funções da saliva podemos citar:
(1) auxilia na degustação (sabor) dos alimentos; (2) protege e lubrifica a mucosa bucal; (3) dilui o
alimento ingerido (especialmente sais e açúcares); (4) pela diluição e pelo fluxo vem contribuir
também para a limpeza; (5) possui capacidade de tamponamento; (6) auxilia na manutenção da
integridade do esmalte, através da remineralização, devido à presença de quantidades saturantes
de cálcio e fósforo (PO43-), constituintes do esmalte; (7) contribui para a digestão, quebrando
inicialmente o amido até subunidades menores e auxiliando na formação do bolo alimentar; (8)
possui função de reparo de tecido – auxilia na coagulação; (9) possui propriedades
antimicrobianas – especialmente antibacterianas.

O tamponamento da saliva é feito por mais de um sistema tampão, entre eles temos
algumas proteínas como a sialina e a mucina. Entretanto, os principais são o tampão fosfato,
formado pelo ácido fosfórico e sais de fosfato, e o sistema carbonato/bicarbonato. Este último é o
mais importante para a saliva estimulada.

Neste experimento vamos preparar soluções tampão de carbonato/bicarbonato de


sódio para se ter uma idéia de como funciona um sistema tampão e como deve funcionar
no meio bucal.

Procedimento experimental

Materiais
02 Copos de béquer de 100 mL () para soluções;
02 Copos de béquer de 50 mL para determinação do pH das soluções.
04 Balões volumétricos de 100 mL para soluções e diluições
04 Balões volumétricos de 50 mL para diluições
02 Provetas de 25 mL
02 pipetas graduadas de 10 mL
Pipetas Pasteur para completar o volume
pHmetro
Papel indicador de pH
H2SO4 0,1 mol L-1
NaOH 0,2 mol L-1
2 Buretas de 50 mL

Preparo das soluções de carbonato e bicarbonato


Solução de carbonato de sódio 0,2 mol L-1

A solução de carbonato 0,2 mol L-1 é preparada dissolvendo-se 2,12 g de carbonato (Na2CO3) em
80 mL de água. Para dissolver o sal completamente podemos utilizar agitação magnética ou o
bastão de vidro. Após a dissolução completa transferir a solução resultante para um balão de 100
mL e completar até a marca com água destilada.
8
Solução de bicarbonato de sódio 0,2 mol L-1

A solução de bicarbonato 0,2 mol L-1 é preparada dissolvendo-se 1,68 g de


hidrogenocarbonato (NaHCO3) em 80 mL de água. Para dissolver o sal completamente podemos
utilizar agitação magnética ou o bastão de vidro. Após a dissolução completa transferir a solução
resultante para um balão de 100 mL e completar até a marca com água destilada.

Preparo e medida de pH para o sistema tampão carbonato/bicarbonato

Preparar o tampão carbonato/bicarbonato em diferentes proporções e verificar o pH do


sistema tampão obtido com o pHmetro. Seguir as proporções indicadas na Tabela 1.

Tabela 1. Preparo de soluções tampão carbonato/bicarbonato em diferentes proporções e


determinação do valor de pH das soluções.

Volume de Volume de pH da pH da
Na2CO3 NaHCO3 H2O Concentração solução solução
solução
0,2 mol L-1 0,2 mol L-1 (mL) (mol L-1) (pHmetro) (papel
(mL) (mL) indicacor)
1 8 17 25
2 17 8 25
3 8 17 100
4 17 8 100

Avaliação da faixa de tamponamento de um sistema tampão carbonato/bicarbonato

Utilizando uma solução tampão concentrada e uma solução tampão diluida preparadas
acima determine a sua faixa de tamponamento (pequena variação de pH) quando são
adicionados um ácido ou uma base, registrando os valores de pH na Tabela abaixo.

1. Calibrar o peagâmetro.
2. transferir 25 mL da solução para um Erlenmeyer de 50 mL e medir o pH da solução
utilizando o pHmetro.
3. Preencher uma bureta com solução de H2SO4 0,1mol L-1 e adicionar 1,0 mL desta solução
ao Erlenmeyer contendo o tampão acetato. Homogeneizar.
4. Verificar o pH e anotar na Tabela de resultados.
5. Repetir o procedimento, ou seja, adicionar 1,0 mLde NaOH 0,2 mol L-1, agitar e verificar o
pH, até que ocorra uma variação brusca no valor de pH.

Tabela de Resultados – Titulação com um ácido – solução concentrada


Volume de H2SO4 pH Volume de H2SO4 pH
9

Tabela de Resultados – titulação com uma base - solução concentrada


Volume de NaOH pH Volume de NaOH pH

Tabela de Resultados – Titulação com um ácido – solução tampão diluida


Volume de H2SO4 pH Volume de H2SO4 pH

Questões:

1. Trace a curva de titulação para a solução tampão.


2. Comente os resultados obtidos evidenciando a capacidade de tamponamento do tampão
acetato.
10

4- Determinação do fluxo salivar e da Capacidade tamponante da saliva

1- Medida do fluxo salivar sem estímulo:

A saliva colhida sem nenhum estímulo mastigatório ou gustativo, salivando passivamente dentro
de uma proveta, é um indicador mais confiável de fluxo de saliva reduzido e de hipossalivação do
que a saliva estimulada.

Instruções:

1. O paciente não deve comer ou beber (exceto água) 1 hora antes da coleta.
2. A saliva do mesmo indivíduo deve, se possível, ser coletada na mesma hora do dia.
3. O paciente não deve fumar ou sofrer grande estresse físico antes da coleta.
4. É recomendado um período de pré-amostragem (1 min)
5. Deve ser utilizado um tempo fixo de coleta (5 min – saliva estimulada; 10 – 15 min, saliva não
estimulada)
6. O paciente deve sentar-se em posição relaxada em uma cadeira comum, não na cadeira
odontológica.
7. As amostras contendo sangue visível devem ser descartadas se houver planejamento para
análise química da saliva.

2- Medida de fluxo salivar com estímulo.

Procedimento:

1. Mascar uma amostra de parafilme ou goma de mascar sem açúcar por 1 min.
2. Deglutir a saliva acumulada.
3. Tornar a mascar a mesma goma por 5 min, coletando a saliva produzida em um copo
descartável, previamente pesado na balança analítica.

(Observação: Não descartar a saliva coletada, esta será utilizada no experimento seguinte
“capacidade tamponante da saliva”)

4. Calcular o volume de saliva pesando novamente o copo e considerando o valor da densidade da


saliva igual a 1 (um).
5. Calcule o índice de fluxo salivar dividindo o volume de saliva coletado pelo tempo de coleta.

Resultados

Volume de saliva coletado:

Tempo de coleta:

Índice de fluxo salivar:

Interpretação:

O índice de fluxo salivar esperado varia de 1 a 3 mL de saliva estimulada por minuto.

Determinação da capacidade de tamponamento da saliva

Objetivo: Estudar a variação de pH da saliva pela adição de ácido lático, um ácido normalmente
produzido por bactérias da placa dental.
11

1. Fundamentos Teóricos

A capacidade tampão da saliva (CTS) é a propriedade de a saliva manter o seu pH constante a


6,9-7,0, graças aos seus tampões, mucinato/mucina, HCO3-/H2CO3 e HPO42-/H2PO4-, que
bloqueiam o excesso de ácidos e de bases conforme os mecanismos:

a) Excesso de ácidos (H+): H+ + HCO3- H2CO3 H2O + CO2

b) Excesso de bases (HO-): HO- + H2CO3 HCO3- + H2O

Os tampões mucinato/mucina e monofosfato/bifosfato agem da mesma forma e, assim, o elevado


poder tamponante da saliva mantêm a higidez da mucosa bucal e dos dentes.

A determinação da CTS se faz por titulometria, medindo-se o volume de ácido lático 0,1 mol L-1
necessário para baixar o pH salivar de 6,9 a 3,7 (ponto de viragem do alaranjado de metila). O
indicador é amarelo-laranja a 6,9 e róseo a 3,7.

Parte A

Colocam-se 10 mL de saliva ( 5 mL de saliva + 5 mL de água) num erlenmeyer, juntamente com o


alaranjado de metila, e verte-se na saliva, gota a gota, o ácido lático 0,1 mol L-1 colocado numa
bureta, até ser atingida a cor rósea (viragem do alaranjado de metila). Fecha-se então a bureta,
anotando o volume de ácido lático 0,1 mol L-1 que foi gasto.

Para exprimir a CTS multiplica-se por 10 o volume de ácido lático gasto.

Pacientes medianamente susceptíveis à cárie dental: CTS = 40


Pacientes resistentes à cárie dental: CTS > 40
Pacientes susceptíveis à cárie dental: CTS < 40

Dentro de certos limites, a CTS funciona como um índice relativo de atividade de cárie dental.

2. Parte Experimental

Reagentes Materiais
Ácido lático 0,1 mol L-1 100 mL Bureta de 25 mL
Indicador alaranjado de metila copo de bequer de 50 mL
Erlenmeyer de 125 mL
Proveta de 10 mL
copo de plástico descartável
pipetadores
gaze para filtrar a saliva

3. Procedimento

1. Transferir a saliva coletada no experimento anterior (determinação do fluxo salivar) filtrando


sobre gaze para o Erlenmeyer lavando com 5 mL de água (medir com a proveta). Adicionar de
3 a 5 gotas do indicador alaranjado de metila.

2. Completar e zerar o volume da bureta com 25 mL de ácido lático.

3. Titular a saliva diluida com o ácido lático, deixando verter gota a gota para o Erlenmeyer até o
ponto de viragem (de amarelo-laranja para rosa).
12

4. Anotar o volume gasto e calcular a capacidade tamponante multiplicando por 10.

Resultados:

Para exprimir a capacidade tamponante da saliva (CTS) – devemos multiplicar o volume de ácido
lático gasto por 10. Os pacientes podem ser classificados em três grupos:

1. Pacientes medianamente suscetíveis à cárie dental: CTS = 40.


2. Pacientes resistentes à cárie dental: CTS > 40.
3. Pacientes muito suscetíveis à cárie dental: CTS < 40.

Dentro de certos limites, a CTS funciona como um índice relativo de atividade de cárie dental.

Parte (B)

Determinação da capacidade de tamponamento da saliva pela avaliação do pH final com


HCl 5mM

Este experimento foi adaptado a partir de um roteiro da disciplina de pré-clínica II (DP-102)


da Faculdade de Odontologia de Piracicaba.

2.1 MATERIAL

2.1.1. Os utilizados para determinação do fluxo salivar e,


2.1.2. Tubo de ensaio
2.1.3. Ácido clorídrico 5 mM (Titulado)
2.1.4. pHmetro ou papel indicador de pH

2.2 MÉTODO
Pipetar 0,5 mL de saliva estimulada e acrescentar a um tubo contendo 1,5 mL de HCl 5 mM. Agitar
o tubo. Abrir para desprender o CO2 dissolvido na saliva e, após no mínimo 5 min, determinar o pH.
Se o pH final for MENOR que 4,5 a capacidade tampão da saliva estimulada é considerada BAIXA;
INTERMEDIÁRIA quando entre 4,6 - 5,5 e BOA quando superior a 5,5 (FROSTELL, 1980;
WIKNER & NEDLICH, 1985). Segundo ERICSSON (1959) NORMAL seria entre 5,75 - 6,50 e
MUITO BAIXO o menor que 4,0.
13
5- Composição química da saliva: constituintes minerais

Objetivos: utilizando testes bioquímicos, identificar alguns dos componentes principais da saliva.

A saliva é o líquido que umedece a cavidade bucal, sendo segregada por todas as glândulas
salivares da mucosa bucal. Suas funções incluem:

1. Proteção da mucosa bucal e dos dentes, com uma lubrificação perfeita, evitando o
ressecamento.
2. Defesa através da lisozima, do tiocianato e das imunoglobulinas.
3. Aglutinação das partículas alimentares para a formação do bolo alimentar
4. Digestão inicial dos polissacarídeos como amido e glicogênio.
5. Regulação do pH do meio bucal a 6,9 através dos tampões salivares.
6. Autóclise ou autolimpeza da bica através dos movimentos mastigatórios.

Propriedades Físicas e Físico-químicas da saliva

1. Aspecto: opalescente, às vezes, límpido e incolor.


2. Viscosidade: elevada devido à presença em grande quantidade da proteína mucina.
3. volume: 1.000 a 1.500 mL por dia
4. Densidade: 1.000 a 1.020 g/mL.
5. Osmolaridade: a saliva é hipotônica em relação ao plasma, isto é, a sua osmolaridade é
menor que 294 mosm L-1.

Materiais e Métodos

4 tubos de ensaio
1 cápsula de porcelana
Copo de plástico descartável para coletar a saliva
HNO3 (5% v/v)
Solução de nitrato de prata AgNO3 2% (p/v)
Ácido acético (5% v/v)
Oxalato de amônio 4% (p/v)
HCl 5% (v/v)
FeCl3 5% (v/v)
Ácido sulfúrico 10% (v/v)
Iodeto de potássio 10%
Solução de amido 1% (p/v)
2 tubos de centrífuga

Procedimento:

Coletar cerca de 5 mL de saliva, centrifugar por cerca de 5 min e utilizar esta amostra nos
diversos testes conforme descrito abaixo.

Determinação de substâncias minerais

OBS.: Nos testes abaixo utilizar sempre como controle um segundo tubo de ensaio contendo água
destilada.

1. Presença de cloretos: Adicionar 1,0 mL de saliva em um tubo de ensaio, juntar uma gota
de ácido nítrico 5%. Adicionar 2 gotas de nitrato de prata a 2%. Observar, anotar e
concluir.

2. Presença de cálcio: Colocar em um tubo de ensaio 1,0 mL de saliva e juntar 2 gotas de


ácido acético 5%. Adicionar 5 gotas de oxalato de amônio 4%. Observar, anotar e concluir.
14

3. Presença de tiocianato: Colocar em uma cápsula de porcelana 1,0 mL de saliva e juntar 2


gotas de ácido clorídrico 4% e 2 gotas de cloreto férrico 5%. Observar, anotar e concluir.

4. Presença de nitrito: Colocar 1,0 mL de saliva em um tubo de ensaio e acidificar com 2


gotas de ácido sulfúrico 10%. Juntar 2 gotas de solução de iodeto de potássio 10% e uma
gota de solução de amido 1%. Misturar. Se houver nitrito na saliva, o que não é constante,
o amido ficará azul.

Explicação: O ácido nitroso proveniente dos nitritos decompõe o iodeto de potássio, liberando
iodo, o qual irá corar a solução de amido.
15
6- Determinação de constituintes orgânicos na saliva

1. Presença de proteínas:

As proteínas podem ser dosadas em diversos materiais biológicos por várias metodologias. A
reação do Biureto, que é utilizada para a caracterização de proteínas pode ser empregada para a
quantificação das mesmas mediante a colorimetria.

O fundamento da metodologia se baseia no fato de que as proteínas formam um complexo com o


íon cúprico (cu2+) em meio alcalino. Tal complexo apresenta um pico de absorção no comprimento
de onda de 540 nm. A reação é positiva para peptídeos constituídos de no mínimo três
aminoácidos. Tal complexação também ocorre com o biureto (H2N-CO-NH-CO-NH2), daí o nome
da reação.

Material e Métodos

Espectrofotômetro (540 nm)


Estante com 7 tubos de ensaio
1 pipeta graduada de 5 mL
2 pipetas graduadas de 10 mL.

Reação de biureto:

Colocar em um tubo de ensaio 2,0 mL de saliva e adicionar 1,0 mL do reativo de biureto.


Agitar e observar o aparecimento da coloração violácea que indica a presença de proteína.

2. Presença de mucina

A saliva deve sua alta viscosidade à presença de mucina, uma glicoproteína, insolúvel em meio
ácido e em álcool.

2.1 Precipitação por ácido: colocar eu um tubo de ensaio 2,0 mL de saliva e acidificar com
algumas gotas de ácido acético (5%). Observe o aparecimento de um precipitado (acetato de
mucina).

2.2. Precipitação por álcool: em um tubo de ensaio adicionar 2,0 mL de saliva e 4,0 mL de álcool
etílico (95%). Observar a formação de um precipitado de mucina.

3. comprovação da presença de amilase salivar (ptialina)

 Transferir para um tubo de ensaio 5,0 mL de solução de amido 1% e adicionar 5,0 mL de


saliva.
 Incubar a 37°C durante 10 min.
 Após a incubação dividir a solução em 2 tubos de ensaio numerados (1 e 2).
 No tubo 1 adicionar 3 gotas de lugol, agitar e reservar.
 No tubo 2, adicionar 1,0 mL de reagente de Fehling A e 1,0 mL de Fehling B, levando ao
aquecimento por cerca de 2 min diretamente na chama.
 Observar, anotar e concluir, comparando os resultados com o controle, conforme descrito
abaixo.

Prova controle:

Em 2 tubos de ensaio identificados (A e B), colocar 2,5 mL de solução de amido. No tubo A


adicionar 3 gotas de lugol e, no tubo B adicionar 1,0 mL de Fehling A + 1,0 mL de Fehling B,
aquecer em banho maria fervente por 5 min.
16
4. presença de carboidratos

 Reação de Molish: Colocar 2,0 mL de saliva em um tubo de ensaio, adicionar 5 gotas de


reativo de Molish (alfa-naftol em meio alcoólico) e homogeneizar.
 Adicionar lentamente pela parede do tubo de ensaio 2,0 mL de ácido sulfúrico concentrado
(COM CUIDADO). Não agitar.
 Verificar o aparecimento de um anel roxo entre as duas camadas denunciando a presença
de carboidrato.

RELATÓRIO

Deverá ser feito um relatório sobre os resultados obtidos na caracterização da saliva contendo
envolvendo os experimentos de fluxo e capacidade de tamponamento, contendo:

a) Introdução (Conhecimento sobre o assunto fundamentado na literatura)


b) Materiais e Métodos (O que e como foi feito)
c) Resultados (Tabelas, Gráficos)
d) Discussão (Comparar seu resultado com o da classe; o da classe com a literatura)
e) Conclusão

Referências

1. Edgar, WM, O’Mullane, DM. Saliva and oral health. Segunda edição. Londres: British Dental
Association, 1996. 140p.
2. Ericsson Y, Hardwick L. Individual diagnosis, prognosis and counselling for caries
prevention. Caries Res 1978;12:94-102.
3. Frostell G. A colourimetric screening test for evaluation of the buffer capacity of saliva.
Swed Dent J 1980;4:81-86.
4. Kedjarune U, Migasena P, Changbumrung S, Pongpaew P, Tungtrongchitr R. Flow rate and
composition of whole saliva in children from rural and urban Thailand with different
caries prevalence and dietary intake. Caries Res 1997;31:148-154.
5. Kivelä J, Parkkila S, Parkkila AK, Rajaniemi H. A low concentration of carbonic anhydrase
isoenzyme VI in whole saliva is associated with caries prevalence. Caries Res
1999;33:178-184.
6. Levine, M J. Development of Artificial Salivas. Crit Rev Oral Biol Med 1993;4:279-286.
7. Mandel I D. The role of saliva in maintaining oral homeostasis. JADA 1989:119:298-304.
8. Sreebny L, Banoczy J, Baum B, Edgar W, Epstein J, Fox P, Larmas M. Saliva: its role in
health and disease. Int Dent J 1992;42:291-304.
9. Wikner S, Nedlich U. A clinical evaluation of the ability of the Dentobuff method to
estimate buffer capacity of saliva. Swed Dent J 1985;9:45-47.
17
7- Determinação quantitativa de tiocianato (SCN-) na saliva

Objetivos: Verificar as diferenças dos teores deste anion na saliva de fumantes e não-fumantes.

Fundamentos teóricos:

O íon tiocianato (SCN-)é gerado endogenamente como um produto de detoxificação a


partir da reação entre cianeto e tiossulfatos que ocorre no fígado. Além de ser um produto final de
detoxificação, este íon exerce importante papel dentro do sistema antimicrobiano da saliva por ser
um substrato para peroxidases. Sendo também interessante o seu papel na detoxificação de
compostos cancerígenos. A concentração de tiocianato é bastante alta no sangue e
especialmente na saliva. Os valores variam grandemente em função da dieta alimentar, sendo
que altos teores são comuns entre os fumantes. Enquanto não fumantes podem ter concentrações
que variam entre 0.5 e 2 mM, alguns fumantes podem apresentar [SCN-] com valores acima de 6
mM. Portanto, uma alta concentração de tiocianato pode ser utilizada quantitativamente como um
indicador de exposição à fumaça de cigarro. Entretanto, o metabolismo da vitamina B12 e certos
alimentos contendo cianeto ou açúcares cianogênicos (nozes, castanha, etc) também aumentam
a concentração de SCN- na saliva.

Soluções estoque:

Preparar as seguintes soluções em balões volumétricos de 100 mL:

Fe(NO3)3 0,2 mol L-1 em HNO3 1 mol L-1


KSCN 2x10-4 mol L-1 em água

Procedimento:

1. Em tubos de ensaio, enumerados de 1 a 6, pipetar os componentes conforme a Tabela


abaixo.
2. Fazer a leitura da absorbância em 447 nm no fotômetro.
3. Com os dados obtidos para os tubos de 1 a 6, fazer um gráfico em papel milimetrado
colocando no eixo Y os valores de absorbância obtidos e no eixo dos X as concentrações de
FeSCN2+ em mmol L-1.

Tubo nitrato de tiocianato H2O Absorbância


ferro (mL) (mL) 447 nm
(mL)
1 5 0 5
2 5 1 4
3 5 2 3
4 5 3 2
5 5 4 1
6 5 5 0

4. Coletar cerca de 1 mL de saliva e transferir para um tubo de ensaio que deverá ser equilibrado
com outro tubo contendo água para centrifugar.
5. Centrifugar a saliva coletada a 3.000 rpm por 5 min.
6. Após centrifugação, coletar 200 L de saliva e diluir com nitrato de ferro até 10 mL.
(observação: esta diluição faz com que todo o SCN- presente na saliva seja transformado em
FeSCN2+ para que possa ser estimado a partir de uma curva de calibração).
7. Fazer a leitura de absorbância da amostra de saliva diluída em nitrato de ferro e interpolar e
determinar o valor de concentração de tiocianato.
18
8- Verificação da atividade da amilase salivar

Objetivo: Verificar a atividade da amilase salivar por dois métodos: (1) Identificação da estrutura
do polissacarídio com o reativo de lugol (na presença de polissacarídio produz uma coloração azul
escura); (2) Identificação de carboidrato redutor utilizando a reação de Fehling.

A amilase salivar é uma enzima presente na saliva capaz de quebrar moléculas de polissacarídios
como amido e glicogênio conforme esquema abaixo:

Amido e glicogênio dextrinas maltose

O ponto final desta reação pode ser determinado de duas formas

(1) Utilizando lugol e analisando a mudança de coloração da solução. Na presença de amido o


reagente assume uma coloração azul escura. A medida que o amido é quebrado, a coloração
muda para castanho.

(2) Ao ser hidrolisado, o amido é quebrado em fragmentos menores que podem ter uma
extremidade redutora como a maltose (Figuras 1 e 2), o que permite sua identificação avaliando-
se a redução de cobre presente no reativo de Fehling.

Figura 1- Representação parcial da estrutura do amido solúvel (amilose) e do amido ramificado


(amilopectina) – menos solúvel. Na presença da enzima amilase salivar e/ou na presença de
ácido, o amido é quebrado (hidrolisado) em fragmentos menores liberando maltose, um açúcar
redutor.
A capacidade de redução de um carboidrato está associada à presença na molécula de um
grupo aldeido ou cetona livres. Todos os monossacarídios possuem uma cetona ou aldeido livres.
Portanto são açúcares redutores. Maltose e sacarose são dissacarídios, ou seja, são constituidos
19
de dois monossacarídios. Entretanto, a maltose é um açúcar redutor, mas a sacarose não (Figura
2).

Figura 2- estrutura dos dissacarídios maltose e sacarose, indicando a extremidade redutora da


maltose.

Carbono anomérico é aquele que possui dois átomos de oxigênio ligados em


conseqüência da ciclização da molécula. Em solução alcalina, o carbono anomérico é convertido
em aldeído ou cetona que pode ser oxidado a álcool ou ácido carboxílico na presença de um
metal (agente oxidante). Neste caso, o açúcar será um agente redutor. Alguns metais podem
sofrer redução nestas condições, entre eles temos o cobre (Cu2+) e a prata (Ag+). Cujas reações
de redução estão representadas abaixo.

Cu2+ + e- Cu+
Ag+ + e- Ag0

A detecção é feita utilizando os reagentes Fehling A e B, de acordo com as reações apresentadas


a seguir.

A redução do cobre é conseguida em meio alcalino a quente:

quente meio alcalino


Carboidrato redutor/meio alcalino
Cu2+ aquecimento Cu2O + H2O (precipitado marrom/vermelho)

Ions cobre Cu2+ também reagem com o meio alcalino:

meio alcalino - H2O


Cu2+ Cu(OH)2 CuO(s) (preto)

Para evitar que esta reação mascare o teste que indica a presença de carboidrato redutor, o íon
Cu2+ é mantido em solução alcalina sob a forma de complexo. Há então vários reagentes à
base de Cu2+, que diferem em relação ao solubilizador ou ao alcalinizante.
20
Procedimento Experimental

Materiais Reagentes

2 Copos de plástico para coletar a saliva Solução de amido solúvel (1%)


Gaze para filtrar a saliva Solução salina de NaCl (0,9%)
12 Tubos de ensaio e estante para tubos. Solução de maltose 5%
10 Pipetas graduadas de 5 mL Solução de sacarose 5%
Solução de glicose 5%
Reativo de Fehling A
Reativo de Fehling B
Reagente de lugol
Banho maria a 37ºC

Hidrólise enzimática do amido:


Esta reação ocorre na presença da amilase salivar, para tanto será necessário coletar
saliva como descrito abaixo.

1) Coletar aproximadamente 3 mL (cerca de 4 g – considerando o peso do copo).

2) filtrar sobre gaze para um tubo de ensaio.

3) Diluir a saliva com a solução salina (NaCl 0,9%) na proporção de 1:10 (1mL saliva + 9 mL
solução salina).

4) Colocar em 3 tubos numerados 1, 2 e 3, os reagentes de acordo com a Tabela 1.

Tabela 1 – Distribuição dos reagentes para o teste de atividade da amilase salivar.

tubo reagente Solução de amido 1%


1 2,5 mL de água destilada 5 mL
2 2,5 mL de amilase salivar (saliva 1:10) in natura 5 mL
2,5 mL de amilase salivar (saliva 1:10) fervida 10 min
3 5 mL
e resfriada

5) incubar a 37ºC durante 10 minutos.

6) Após a incubação, retirar duas alíquotas de 2 mL de cada tubo, deste modo você tem 6 (seis)
novos tubos (num total de 6 alíquotas – 2 para cada tubo).

7) Resfriar a temperatura ambiente.

Acompanhe o esquema do procedimento nas Tabelas 2 e 3

8) Acrescentar à alíquota número 1 de cada tubo uma gota do reagente de lugol e observar.

9) Acrescentar à alíquota número 2 de cada tubo, 1 mL do reativo Fehling A e 1 mL do reativo


Fehling B.

10) Aquecer somente os tubos que contém os reativos de Fehling em banho maria fervente.

11) Repetir o procedimento após decorridos mais 20 minutos de incubação, comparar os


resultados e explicar.
21
Tabela 2 – Esquema do procedimento e resultados para a incubação a 37ºC (10 min)

tubo alíquota Fehling A Fehling B lugol Ferver??? Resultados/comentários


1 ------------- -------------- 1 gota NÃO
1
2 1mL 1mL -------- SIM

1 ------------- -------------- 1 gota NÃO


2
2 1mL 1mL -------- SIM

1 ------------- -------------- 1 gota NÃO


3
2 1mL 1mL -------- SIM

Tabela 3 – Esquema do procedimento e resultados para a incubação a 37ºC (30 min)

tubo alíquota Fehling A Fehling B lugol Ferver??? Resultados/comentários


1 ------------- -------------- 1 gota NÃO
1
2 1mL 1mL -------- SIM

1 ------------- -------------- 1 gota NÃO


2
2 1mL 1mL -------- SIM

1 ------------- -------------- 1 gota NÃO


3
2 1mL 1mL -------- SIM

Analisar os resultados, discutir e concluir.

Fazer um relatório
22
9- Determinação colorimétrica de cálcio

Objetivos: Detecção de íons cálcio (Ca2+) liberados da hidroxiapaptita pelo tratamento com ácido
clorídrico.

Fundamentos teóricos:

Após tratamento com ácido clorídrico (20%) o esmalte das estruturas dentárias foi
desmineralizado liberando cálcio e fosfato da matriz de hidroxiapatita. Parte da estrutura mais
interna do dente também foi atacada, liberando carbonato de cálcio. Na aula anterior verificamos
que o ataque ácido do dente libera CO2, a partir do carbonato de cálcio.

Na aula de hoje vamos verificar a quantidade de cálcio liberada pelo tratamento com ácido
clorídrico empregando um método colorimétrico. Empregando um “Kit” fornecido pela Laborlab,
podemos estimar a concentração de íons Ca2+.

O teste normalmente é feito para determinar os níveis de cálcio no soro ou urina. Além de
sua importância na contração muscular, transmissão nervosa e coagulação sangüínea, o cálcio é
importante constituinte da substância mineral dos ossos e dos dentes. Cálcio e fósforo são
particularmente importantes na formação dos cristais de hidroxiapaptita – Ca10(PO4)6.(OH)2 – que
se precipitam nas matrizes protéicas, produzindo o esmalte e a dentina perfeitamente calcificados
e endurecidos.

Procedimento:

Material e Métodos Reagentes do Kit Laborlab

1. Fotômetro (570 nm) 1. Corante (CFX).


2. Estante com 3 tubos de ensaio. 2. Tampão.
3. Pipeta graduada de 5 mL. 3. Extrato ácido de dente contendo cálcio.
4. Pipetador automático (20 e 10 L)
5. Tubo para o fotômetro
6. Relógio ou cronômetro
Componentes do Kit Laborlab

1. Solução estabilizada de cálcio (10 mg dL-1)


2. Reativo CFX = Solução estabilizada de cresoftaleina complexona (3,7 mmol L-1)
3. Reativo tampão = Solução de AMP (0,2 mmol L-1), pH 11,0

O método utilizado é um método colorimétrico de ponto final, ou seja após o interva-lo de


aproximadamente 10 minutos atinge-se a coloração máxima, que permanece estável por até 3
horas.

Antes da adição da amostra, devemos obter os valores de absorbância dados apenas pelos
reagentes. Estes valores são considerados absorbância do “branco ou controle” e deverao ser
descontados do valor de absorbância da amostra.

O material a ser utilizado, tubos de ensaio, ponteiras utilizadas nos pipetadores automáticos,
pipetas, etc. devem estar rigorosamente limpos, livres de cálcio e de traços de anticoagulantes.
Aconselha-se lavar a vidraria com detergente não iônico ou com solução diluida de ácido mineral,
lavando após, várias vezes com água deionizada.

A técnica se caracteriza por valores de absorbância de amostras controle (branco) muito baixas.
No caso em que valores de absorbância do controle (antes da adição da amostra) forem
23
superiores a 0,2 unidades de absorbância, devemos desprezar os reagentes ou selecionar outro
tubo para análise pois os valores podem indicar contaminação prévia com íons cálcio.

Técnica:

1. Identificar os tubos conforme descrito na Tabela 1 Padrão (P) e amostra (A).


2. Adicionar o corante (CFX) – 20 microlitros - com o auxílio de um pipetador automático
(conforme descrito na Tabela 1).
3. Adicionar 1,5 mL do Tampão – misturar e fazer as leituras no espectrofotômetro em 570 nm,
zerando o aparelho com água destilada.

4. Anotar os valores de absorbância antes da adição da amostra na Tabela 1.

5. Adicionar 10 microlitros (10 L) de padrão no tubo (P) e 10 microlitros (10 L) de amostra no
tubo (A), incubar na bancada por 10 minutos (Tabela 2).

Tabela 1 – Determinação de cálcio – 1a etapa, medidas de absorbância do branco (controle).

Tubo CFX (L) Tampão (mL) Absorbância do


BRANCO
570 nm
Padrão (P) 20 1,5
Amostra (A) 20 1,5

Tabela 2 – Determinação de cálcio – 2ª etapa, medidas de absorbância da amostra.

Tubo Amostra (L) Absorbância das


AMOSTRAS
570 nm
Padrão (P) 10
Amostra (A) 10

Cálculos:

Cálcio mg dL-1 = [A(amostra 570nm) – A(branco 570nm)] x f

10mgdL1
Onde f 
A( amostrapadrão570nm)  A(brancopadrão570nm)

Valores de referência:

Concentração de cálcio no soro: 8,5 a 10,5 mg dL-1


Concentração de cálcio na saliva: 88 a 110 mg dL-1
Concentração de cálcio na urina: 60 a 200 mg 24 hs-1
24
10- Determinação do pH de dissolução da hidroxiapaptita

Paralelamente ao teste de Fosdick, incubar amostras de esmalte, dentina e/ou cemento com
soluções de pH 3,0; 5,0; 5,5; 6,0 e 7,0.

Verificar o pH mínimo para a dissolução da hidroxiapatita pela liberação de cálcio (próxima aula).

Determinação colorimétrica de íons cálcio

Material e métodos
1. fotômetro (570 nm)
2. Estante com 12 tubos de ensaio
3. pipeta graduada de 5 mL
4. pipetador automático (10 e 20 L)
5. 2 tubos para o fotômetro
Reagentes
1. corante (CFX)
2. Solução tampão
3. Reativo padrão de cálcio

Procedimento:

1. Identificar os tubos conforme descrito na Tabela 1, onde a solução padrão de cálcio (10 mg dL-
1
) é identificada como (P) e as amostras correspondem a “controle” (concentração de cálcio
presente na saliva - até 110 mg dL-1); amostra (teste Fosdick) e amostras em diversos pHs (A1 –
A5).
2. Adicionar o corante (CFX) – 20 L, com o auxílio de um pipetador automático.
3. Adicionar 1,5 mL do tampão, misturar e fazer as leituras no espectrofotômetro utilizando o
comprimento de onda de 570 nm, zerando o aparelho com água destilada.
4. Anotar os valores de leitura de absorbância do branco (inicial) e da amostra na Tabela 1.
5. Adicionar 10 L de padrão no tubo P e 10 L de cada amostra no respectivo tubo.

Tabela 1 – determinação de cálcio


A 570 nm A 570 nm
Tampão Amostra
Tubo CFX (L) Inicial Final
(mL) (L)
(branco) (amostra)
Padrão (P) 20 1,5 10
Controle
20 1,5 10
(cálcio na saliva)
Amostra
20 1,5 10
(cálcio solubilizado)
A1 (pH 3,0) 20 1,5 10
A2 (pH 4,7) 20 1,5 10
A3 (pH 5,5) 20 1,5 10
A4 (pH 6,0) 20 1,5 10
A5 (pH 7,0) 20 1,5 10
25
11- Testes de susceptibilidade à cárie dentária: Teste de Fosdick

Objetivos: Verificar a mudança do pH da saliva e a conseqüente liberação de cálcio a partir do


esmalte quando em contato com uma amostra de saliva e substrato (sacarose) por um período
de
24 hs.

Fundamentação teórica:

A cárie dental ocorre devido ao contato de bactérias da placa dental com a superfície do esmalte.
Neste processo ocorre a fermentação anaeróbica de açucares por estes microrganismos e a
conseqüente liberação de ácido lático, capaz de dissolver o esmalte.

Segundo a teoria acidogênica, os microrganismos acidogênicos da placa dental primeiramente


decompõem os açúcares, produzindo ácidos, entre eles o ácido lático, que inicia a dissolução do
esmalte dentário. Posteriormente, os microrganismos proteolíticos se instalam na lesão inicial,
atacando a matriz orgânico-protéica do esmalte, resultando em novo contingente ácido que
prossegue descalcificando e destruindo o esmalte, propiciando a invasão de toda a estrutura
dentária pelos demais microrganismos do meio bucal.

A hidroxiapatita, em meio ácido, fragmenta-se em unidades de ortofosfato de cálcio, insolúvel, que


posteriormente é degradado a ortofostato monoácido de cálcio (solúvel), conforme as reações:

1. Ca10(PO4)6.(OH)2 + 2H+ 3 Ca3(PO4)2


Hidroxiapatita insolúvel - 2H2O / - Ca2+ Ortofosfato de cálcio insolúvel

2. 3Ca3(PO4)2 + 6H+ 6CaHPO4


Ortofosfato de cálcio - 3Ca2+ Ortofosfato monoácido de
insolúvel calico solúvel

Materiais e Métodos

2 Tubos de ensaio com rolha de borracha


Estante para tubos
Banho-maria a 37ºC
Esmalte, dentina ou cemento, obtidos pelo método de separação de estruturas dentárias.
Sacarose
Amostra de saliva centrifugada

Procedimento:

6. Coletar uma amostra de cerca de 3 mL de saliva e centrifugar (3.000 rpm 5 min).


7. Dividir a amostra em duas alíquotas de 1,5 mL, uma amostra será o controle.
8. Na amostra controle colocar 0,5g de sacarose e incubar em banho-maria a 37ºC.
9. Na amostra real, além da sacarose, colocar 0,5 g de esmalte moído.
10. Homogeneizar as amostras e incubar ambos os tubos a 37ºC por 4 horas.
11. Ao término da incubação retirar os tubos do banho a 37ºC e centrifugá-los por 10 min a 3,000
rpm.
12. Deixar as amostras incubando incialmente por 1 hora e medindo o pH com o auxílio de um
papel indicador.
13. Estimar a quantidade de íons Ca2+ liberados na próxima aula.
26
Dissolução da hidroxiapatita

Após separação das estruturas dentárias utilizando soluções com densidade diferente. O material
obtido foi então incubado com saliva na presença de sacarose, onde se verifica um abaixamento
de pH com liberação de íons cálcio.

Massa de cálcio solubilizada:

A massa de cálcio solubilizada é calculada segundo o protocolo do fabricante do Kit Laborlab.

Cálcio mg dL-1 = [A(amostra 570nm) – A(branco 570nm)] x f

10mgdL1
Onde f 
A( amostrapadrão570nm)  A(brancopadrão570nm)

Conforme verificamos anteriormente, a saliva contém certa massa de cálcio dissolvido com
valores de referência entre 88 a 110 mg dL-1. Portanto, devemos subtrair o valor de cálcio total
(após dissolução da hidroxiapatita) do valor inicial determinado na saliva a pH 7,0 ou na amostra
incubada na ausência de esmalte.

Assim sendo, a massa de cálcio solubilizada é dada pela diferença entre a massa de cálcio na
saliva original e na amostra previamente incubada. A diferença entre a última e a primeira
representa a massa solubilizada de cálcio e exprime o grau de suceptibilidade à cárie dental.

Resultados:

Grau de susceptibilidade à cárie

Concentração de
cálcio solubilizado Símbolos Significado
(mg dL-1)
<1 - Imune
1a2 +/- Quase imune
2a4 + Levemente susceptível
4 a 10 ++ Susceptível
10 a 20 +++ Muito susceptível
acima de 20 ++++ Altamente susceptível
27
12- Teste de Snyder

Objetivo: Verificar a capacidade de produção de ácidos por bactérias presentes na saliva.

Fundamentação teórica:

É um teste colorimétrico simples para o diagnóstico da atividade de cárie. O método é baseado no


ritmo de produção de ácido, num meio contendo glicose, por microrganismos acidogênicos do
meio bucal. Estes microrganismos, especialmente Lactobacillus acidophilus crescem em valores
de pH entre 4,7 e 5,0.

O meio de cultura de Snyder contém glicose e o indicador verde de bromocresol, sendo o pH


regulado entre 4,7 e 5,0. Nesta faixa de pH o indicador é verde-azulado.

Incubam-se cerca de 0,1 mL de saliva em 10 mL do meio de cultura de Snyder (verde-azulado) a


37ºC. Os lactobacillus crescem e, através da via glicolítica produzem ácidos que mudam a cor do
indicador, inicialmente para verde (pH entre 4,1 e 4,6); e, por último, para amarelo (pH ≤ 4).

O amarelo indica teste positivo; a leitura e interpretação dos resultados é feita conforme a Tabela
1.

Materiais e métodos

Meio de Snyder modificado


Triptona ...............................................................................10g
Dextrose ...............................................................................05g
Verde de bromocresol ..........................................................04mg
Água q.s.p. ...........................................................................1.000 mL

Preparo: dissolver os sais a quente e ajustar o pH a 4,7. Se, após a dissolução dos reagentes o
pH do meio estiver acima de 4,7, adicionar gotas de HCl 1mol L-1. Caso contrário, ou seja, se o
pH estiver abaixo de 4,7, adicionar gotas de NaOH 0,1 mol L-1 até ajustar.

Procedimento:
Inoculo

Inocular 0,1 mL de saliva em um tubo contendo 5 mL de meio de Snyder modificado estéril,


tomando o cuidado para não contaminar o meio.

OBS.: o inoculo deverá ser feito próximo à chama do bico de Bunsen com pipeta estéril. Após a
inoculação, agitar e colocar em estufa a 37ºC durante 72 horas, sendo observados a cada 24
horas, anotando o resultado quanto à mudança de pH e coloração.

Interpretação:

Observar o tubo ao fim de 24, 48 e 72 horas. O resultado é positivo (+) quando a cor muda de
verde azulado para amarelo. A leitura e interpretação dos resultados são feitas conforme a Tabela
1.

Tabela 1 – Teste de Snyder, leitura e interpretação dos resultados.

Resultado após incubação durante


Atividade de cárie
24 horas 48 horas 72 horas
positivo - - acentuada
negativo positivo moderada
negativo negativo positivo pequena
negativo negativo negativo nula
28
13- Composição química do dente

Objetivo: Identificar alguns componentes minerais e orgânicos do dente através de testes


bioquímicos.

Fundamentos teóricos:

O dente adulto, completamente desenvolvido, apresenta-se constituído, anatomicamente,


por duas partes distintas: a coroa, externamente visível, e a raiz, implantada numa cavidade do
osso alveolar, chamada alvéolo.

Histologicamente, o dente apresenta-se constituído pelos seguintes tecidos: esmalte,


dentina, cemento e polpa.

Esmalte é o tecido que reveste a coroa do dente, sendo produzido por células de origem
ectodérmica chamadas ameloblastos, ou adamantoblastos. Representa o tecido mais duro do
organismo, sendo formado pelos prismas de esmalte, especialmente construídos pelos
ameloblastos. Os prismas de esmalte apresentam-se formados por 96 % de minerais, na forma de
cristais de hidroxiapatita, Ca10(PO4)6.(OH)2, o que lhe confere elevada dureza. Possui apenas
0,5% de substâncias orgânicas e 3,5% de água. O elevado teor de sólidos faz do esmalte um
tecido muito compacto, pouco permeável e de densidade da ordem de 3,0 g cm-3.

Dentina é o tecido elaborado por células especiais, de origem mesenquimal, chamadas


odontoblastos. Aparece logo abaixo do esmalte na região coronária e logo abaixo do cemento na
região radicular. Esta em contato com a câmara pulpar (no centro do dente). Os odontoblastos
são células cilíndricas colocadas em toda a periferia da polpa. Produzem a dentina da região
coronária em direção à polpa. Diferentemente do esmalte, a dentina é menos mineralizada que o
esmalte, contendo 65% de minerais, principalmente na forma de cristais de hidroxiapatita,
Ca10(PO4)6.(OH)2; 21,5% de substâncias orgânicas e 13,5% de água. A maior taxa de substâncias
orgânicas e de água dá à dentina uma maior plasticidade. Por outro lado, a dentina está repleta de
canalículos dentinários radiais que partem da câmara pulpar ao esmalte e ao cemento. A estrutura
canicular da dentina dá ao tecido alta permeabilidade e permite entender bem a circulação de
substâncias através deles. A menor taxa de minerais explica o valor da densidade 2,14 g cm-3,
menor que a do esmalte.

Cemento é um tecido produzido por células especiais, de origem mesnquimal, chamadas


cementoblastos, que se alojam em cavidades chamadas cementoplastos. É um tecido duro de
estrutura muito parecida com a do osso, embora mais compacto e, portanto, menos permeável
que o tecido ósseo. Possui 45% de minerais, 35% de substâncias orgânicas e 20% de água. A
sua permeabilidade é maior que a do esmalte e da dentina, porém, a sua densidade é menor, ou
seja, da ordem de 2,0 g cm-3.

Polpa dental é um tecido conjuntivo frouxo, oridinado do mesênquima da papila dental.


Histológicamente, a polpa apresenta-se formada por quatro camadas, a pré-dentina (matriz
organo-protéica elaborada pelos odontoblastos, que vem a calcificar-se formando a dentina);
camada odontoblástica; camada subodontoblástica, ou zona basal de Weil e camada central,
constituída pela substância fundamental. Contém uma taxa de água da ordem de 90%, 1% de
minerais e 9% de substâncias orgânicas.

Substâncias minerais do dente

O principal composto mineral do dente é o ortofosfato de cálcio Ca3(PO4)2, que se acha


associado a outros componentes, assumindo a estrutura cristalina da apatita natural. A fórmula
molecular geral das apatitas é: Ca10(PO4)6.Xn, onde “n” pode assumir os valores 1 (X = CO32-) ou 2
(OH- e F-). A forma mais comum da apatita encontrada nos dentes é a hidroxiapatita:
Ca10(PO4)6.(OH)2, podendo se encontrar também a fluoroapatita: Ca10(PO4)6.F2 e a carbonato
29
apatita: Ca10(PO4)6.CO3. Nas apatitas, são ainda admitidas outras permutas como a substituição
do Ca2+, por Mg2+, Na+, ou K+.

Como acontece no osso, a maior parte dos minerais dentários se encontra na forma de
cristalitos de hidroxiapatita, Ca10(PO4)6.(OH)2, e o restante encontra-se no estado amorfo em volta
dos cristalitos.

A fração mineral de cristalitos de hidroxiapatita é fixa, ao passo que a fração amorfa é lábil,
renovando-se continuamente. A quantidade de fósforo é a metade da quantidade de cálcio,
enquanto o carbonato aparece em maior quantidade no cemento. A presença de flúor é
importante na profilaxia da cárie dental, que envolve dissolução de cálcio dos cristais de
hidroxiapatita. O flúor substitui o radical hidroxila da hidroxiapatita, formando fluorapatita, que é
apresenta menor solubilidade que a hidroxiapatita, sendo, portanto, mais resistente ao ataque do
ácido lático produzido pelas bactérias. Além disso, o íon fluoreto inibe a enolase, uma enzima
bacteriana envolvida nas etapas de síntese de ácido lático a partir da glicose.

As taxas de flúor no dente crescem do esmalte ao cemento, apresentando uma média de


10% no esmalte, 20% na dentina e 50% no cemento.

Substâncias orgânicas do dente

Entre os componentes orgânicos do dente, os mais importantes são as proteínas, as quais


constituem as matrizes dos tecidos duros dos dentes.

Todo o tecido duro apresenta uma matriz protéica que serve de base para a precipitação
dos sais de cálcio e posterior endurecimento da estrutura. Má formação da matriz implicará em
uma estrutura malformada, da mesma forma que deficiente mineralização provocará o
aparecimento de regiões hipo-calcificadas ou mesmo não calcificadas. No esmalte a quantidade
de proteínas é muito pequena (aproximadamente 0,3%). Por este motivo, o esmalte apresenta
uma elasticidade reduzida e cliva-se com facilidade. Na dentina os teores de substâncias
orgânicas é superior, porém menor que a do cemento. A matriz protéica da dentina é elevada
(aproximadamente 20%) e a do cemento (cerca de 32%).

Proteínas do esmalte são constituídas de escleroproteínas, ou proteínas fibrosas como a


queratina, as quais são ricas em aminoácidos como a cisteina e a hdroxiprolina.

Proteínas da dentina e do cemento são de dois tipos:

1. Colágeno, uma escleroproteína que tem altos teores dos aminoácidos glicina (19%),
hidroxiprolina (13%), contendo também em menores proporções os aminoácidos lisina e
hidroxilisina. O colágeno é o principal componente protéico das matrizes da dentina e do cemento.
2. Glicoproteínas ácidas sulfatadas – aparecem ao lado das escleroproteínas e têm altos níveis
de ácidos condroitinossulfúricos, que são macromoléculas importantes das matrizes da dentina e
do cemento.

Materiais e Métodos
6 tubos de ensaio, mangueira adaptada em tubo de vidro e rolha de borracha para coletar CO2.
1 Cápsula de porcelana.
1 amostra de dente humano obtido na Clínica Odontológica.
Extrato ácido de dentes humanos (dentes obtidos na clínica odontológica)
Ácido clorídrico 20% v/v (20 mL de HCl concentrado em 100 mL de água)
Solução de Oxalato de amônio 4%
Reativo molíbidico (Molibidato de amônio)
Reativo de Millon
Solução de tiocianato de potássio (10% peso/volume - p/v)
Banho de gelo
30
Procedimento:

Amostras de dentes humanos praticamente sadios deverão ser obtidas na Clínica


Odontológica. Estes deverão ser cuidadosamente limpos, removendo-se tecidos moles e
incrustações de tártaro aderentes.

1. Lavam-se à seguir com água e sabão, e depois com água destilada.


2. Coloca-se em água oxigenada por 48 horas,
3. Retira-se os dentes, lava-se em água corrente e, posteriormente com água destilada.
4. Após este tratamento, os dentes podem ser utlizados para tratamento ácido, em HCl 20% ou
para moagem e separação de estruturas dentárias.

1. Pesquisa de carbonatos:

Colocar uma amostra de dente em um tubo de ensaio e adicionar 10 mL de ácido clorídrico


20%. Fechar o tubo de ensaio com a borracha contendo o tubo coletor para CO2. O gás formado
pelo ataque ácido deve ser coletado em outro tubo de ensaio contendo cerca de 5,0 mL de
hidróxido de bário. Deverá se formar um precipitado branco. Identifique sua origem.

2. Presença de proteínas:

Transferir um fragmento de dente descalcificado para um tubo de ensaio contendo 2,0 mL


de água destilada. Juntar 2 gotas do reativo de Millon (mercúrio metálico em meio ácido) e
aquecer em chama direta por 3 minutos. O aparecimento de uma cor avermelhada corresponde
ao estroma dentário.

3. Prova do colágeno:

Transferir para um tubo de ensaio um fragmento do estroma dentário e adicionar 5,0 mL de


água destilada. Colocar em banho fervente por 10 min e então resfriar, colocando o tubo em
banho de gelo. Observar a formação de uma massa gelatinosa. O dente contém colágeno, que
são escleroproteínas, que após aquecimento e resfriamento se gelificam.

2. Presença de cálcio:

Transferir 1,0 mL de extrato ácido do dente para um tubo de ensaio. Adicionar 5 gotas de
solução de oxalato de amônia (4%). Deverá se formar um precipitado branco. Em que consiste?

3. Presença de fosfatos:

Colocar 1,0 mL do extrato ácido do dente em um tubo de ensaio e adicionar 3,0 mL de


reativo molibdico. Deverá ser formado um precipitado amarelo de fosfomolibdato de amônio. Caso
necessário, dar uma leve aquecida na solução diretamente na chama do bico de bunsen.

4. Presença de ferro:

Colocar em um tubo de ensaio 1,0 mL de extrato ácido de dente e juntar 5 gotas de


tiocianato de potássio (10%). Se houver ferro, poderá aparecer uma coloração vermelha
característica do ferricianato férrico. A coloração depende da presença de resíduos de sangue na
câmara pulpar do dente.
31
14- Separação das Estruturas dentárias

Objetivos: obter separadamente esmalte, dentina e cemento para tratamento com ácido e
dissolução da hidroxiapatita.

A separação das estruturas dentárias se faz por fracionamento em líquidos de densidade


adequada.
Após pulverização de amostras dentárias por processos de moagem, vamos empregar a
propriedade física das estruturas (alta densidade) para separá-las em meio líquido apropriado.

Materiais

2 Tubos de centrífuga
Pérolas de vidro – para equilibrar o tubo em diagonal na centrífuga
Balança com um copo de béquer para pesar e equilibrar os tubos
Soluções de densidade 2,7 g cm-3, 2,42 g cm-3 e 2,07 g cm-3

1. Solução de densidade 2,7:


Bromofórmio .....................................92 mL
Acetona ................................................8 mL

2. Solução de densidade 2,42


Bromofórmio ......................................79 mL
Acetona ...............................................21 mL

3. Solução de densidade 2,07


Bromofórmio ......................................62 mL
Acetona ...............................................38 mL

Procedimento:

1. Pulverização dos dentes:

Dentes humanos, praticamente sadios, obtidos na clínica odontológica, são cuidadosamente


limpos, removendo-se tecidos moles e incrustações de tártaros aderentes. Lavam-se à seguir com
água e sabão e, posteriormente, com água destilada.

Secar em estufa a aproximadamente 80ºC.


Triturar em almofariz, passando o pó em peneira de malha 100. As partículas maiores são
novamente trituradas e peneiradas.

2. Obtendo esmalte dentário:

1. Pesar 0,5g de dente pulverizado em um tubo de centrífuga e acrescentar 3,0 mL de solução de


densidade 2,7. Agitar para misturar a suspensão. Levar à centrífuga e colocar dois tubos
equilibrados em diagonal.

Aguardar instruções do professor.

2. Centrifugar a 3.000 rpm por cerca de 10 minutos.

A dentina (com densidade 2,14 g cm-3) e o cemento (densidade 2,03 g cm-3) flutuam, ao passo
que o esmalte (densidade 2,89 g cm-3) irá sedimentar.
32
3. Separar a mistura dentina e cemento por filtração em funil com papel filtro e secar na estufa
para posterior tratamento.

O esmalte assim obtido ainda não está puro. Para purificá-lo devemos juntar ao esmalte 3,0 mL
de bromofórmio puro (densidade 2,85 g cm-3). Agitar a mistura e centrifugar novamente. O
restante da dentina e cemento ficam no sobrenadante, enquanto o esmalte precipita. Guardar o
esmalte obtido.

Observação:
Não desprezar a solução após filtração, voltar as soluções para os frascos correspondentes.

3. Obtendo dentina:

1. Após filtração da mistura de cemento e dentina, secar o papel de filtro e transferir para um tubo
de centrífuga.
2. Adicionar 3 mL da solução de densidade 2,42. Centrifugar como anteriormente.

A dentina e o cemento, tendo densidade inferior à do líquido ficam no sobrenadante, enquanto o


esmalte residual sedimenta.

3. Filtrar o sobrenadante e secar para obter a mistura dentina-cemento purificada.

4. Obtendo dentina e cemento purificados:

1. Após secar o material em papel de filtro, transferir para o tubo de centrífuga a mistura
dentina-cemento.

2. Adicionar 3,0 mL de solução de densidade 2,07. Centrifugar como anteriormente.

O cemento flutuara, enquanto a dentina permanecerá no fundo do tubo.

3. Filtrar o sobrenadante para separar o cemento. Secar na estufa. Secar a dentina no próprio
tubo.

Referências Bibliográficas

ARANHA, F.L. Bioquímica Odontológica, Ed. Sarvier, 1.ª ed., Campinas, SP, 1996.
ARANHA, F.L. Bioquímica Odontológica Prática, 5.ª ed., Particular, SP, 1997.
LAZZARI, E..P. Bioquímica Dental, Nueva Ed. Interamericana, México, 1980.
LEHNINGER, A.L.;NELSON, D.L. Príncipios de Bioquímica, Ed. Sarvier, 1995.
NICOLAS, A. Cario logia clínica. Ed. Interamericana, México, 1990.
BURNETT, G.W. Microbiologia Oral e Doenças Infecciosas, Ed. Guanabara Koogan, RJ, 1980.
CONN, E.E.; STU MFT, K. Manual de Bioquímica, Edgard Blücher Ltda, 1985.
DATTA, O. Bioquímica, Ed. Guanabara Koogan, RJ, 1980.
HARPER, H.A. Manual de Química Fisiológica, Ed. Atheneu, SP, 1990.
KARLSON, P.K.; GEROK, W. Patobioquímica, Ed. Guanabara Koogan S.A.,RJ, 1980.
LEACH, S.A. Dextranase e dental caries. BR DENT J. 127,325. 1969.
MURRAY, J.J. História da fluoretação das águas. BR DENT J 134 – 347, 1973.
TASTALDI, H. Bioquímica, Ed. Guanabara Koogan, RJ, Brasil, 1983.
LAHTI, M., VILPO, J., HOVINEN, J. Spedtrophotometric determination of thiocyanate in Human
Saliva. Journal of Chemical Education, 76m 1281-1282, 1999.
TOLEDO, W. A. Roteiro de Aulas Práticas de Bioquímica Aplicada, ICBQ, Puc-Campinas, 1996.

Você também pode gostar