Vectores lentivirales

Lic. Saumel Pérez Rodríguez

Centro de Inmunología Molecular
Septiembre 2010
Virus como parásitos intracelulares obligados han desarrollado en su
evolución mecanismos muy eficientes para la entrada de su material
genético (DNA/RNA) a una célula blanco

Virus recombinantes

Lentivirus

Adenovirus
Retrovirus
 Ventajas de los vectores lentivirales

Capacidad de infectar una amplia variedad de tipos celulares, en

proliferación o no, altamente diferenciadas o no.

Integración al genoma

Expresión estable y a largo plazo

Muy baja frecuencia de inducción de mutagénesis insercional

No exacerban tumorigénesis in vitro y no existen observaciones de

oncogénesis en animales tratados con vectores lentivirales in vivo o por
lentitransgénesis
Ventajas de los vectores lentivirales

Physiol Genomics 31: 159–173, 2007.

 Eficiencia de lentitransgénesis
Mice Cows
Pigs

80% efficiency 100% efficiency

Science. 2002 Feb 1;295(5556):868-72. 70% efficiency Biol Reprod. 2004 Aug;71(2):405-9
EMBO Rep. 2003 Nov;4(11):1054-60

Chickens Monkeys
Rats

4 to 45 % germ line transmission

46 % efficiency 100 % efficiency
EMBO Rep. 2004 Jul ;5 (7):728-33 .
Genesis. 2004 Jun;39(2):94-9. Nature. 2008 Jun 12;453(7197):921-4
Estructura partícula viral

Arch. Immunol. Ther. Exp. 2010

 Ciclo de vida viral

1. Unión cubierta viral al receptor celular

2. Fusión membranas

3. Pérdida cubierta viral y liberación del núcleo viral al citoplasma

4. Síntesis DNA viral y transporte activo del núcleo viral al núcleo de la

célula

5. Integración al genoma celular del DNA viral

6. Expresión genes virales, empaquetamiento RNA viral full lenght y

ensamblaje partícula viral

7. Maduración viriones

Arch. Immunol. Ther. Exp. 2010

 Genoma viral

Deleción 80% genoma viral

Solo se mantienen los genes que codifican para las proteínas
estructurales y reguladoras y elementos cis imprescindibles para la
generación de los viriones recombinantes

Genes
Gag: proteínas estructurales
Pol: enzimas con ssRNA
Env: proteínas cubierta viral
 Elementos cis

1. LTR: elementos flanqueantes con varias funciones.

- 3´LTR actúa como terminador de la transcripción y señal de polyA.
- Permiten la integración al genoma.
- Deleción en el 3´LTR impide que el 5´LTR actúe como promotor de la
RNA pol II para evitar silenciamiento génico por metilación.
2. RRE: secuencia que interactúa con Rev facilitando la exportación nuclear
del RNA viral full lenght.
3. WPRE: aumenta la estabilidad del transcripto y por tanto la expresión del
gen de interés.
3. cPPT: es necesario para el importe nuclear del complejo de
preintegración.
4. Ψ: señal para el empaquetamiento del RNA viral específico en los
viriones formados.

Physiol Genomics 31: 159–173, 2007. Curr Gene Ther. 8(6): 483–488, 2008;.
 5´ LTR
ori
RRE

rAmp ppt
BamHI (2109)

pbla potenciador mCD4

pLWenhproC D6
XmaI (2337)
9890 bp
SmaI (2339)

NcoI (6919) NcoI (2344)

3´ LTR promotor hCD4

BamHI (6335) EcoRV (3556)

wpre BamHI (3560)

BamHI (5740) BamHI (4155)

hCD6
NcoI (4739)
 Producción de los vectores virales

CaPO4 method PEI method

87-95% of green cells

 Promotores usados en vectores lentivirales

1. Promotores ubicuos:
- Human ubiquitin C (UbC)
- Fosfoglicerolquinasa (PKG)
>69% ratón, rata, cerdo, ganado F0, >92% ratón F1
Science 295: 868–872, 2002; Genesis 39: 94–99, 2004; Genesis 45: 177–183, 2007; Transgenic
Res 16:661–664, 2007.

- CMV
- Chicken β actina con un enhancer de CMV (CAG)
- Factor de elongación 1-α
>94% cerdo y 100 % F0 ratón, >50% F1 ratón

Blood 103: 580–582, 2004; FEBS Lett 571: 233–236, 2004; Physiol Genomics 31: 159–173, 2007
2. Promotores tejido específico:

-K14 específico de keratinocitos basales en cerdos (13% F0)

-miogenina
-lck de linfocitos T
Science 295: 868–872, 2002 ;EMBO Rep 4: 1054–1060, 2003.

-Sinapsina 1
-Pigmento rojo (RG)
-Rodopsina (Rho)
-K12 específico del epitelio de la córnea

Mol Ther 8: 666–673, 2003; J Neurosci Methods 152: 1–9, 2006.

 RNA interferencia

1. Utilización de promotores de la RNA pol III: H1 y U6.

-Ubicuos
-Expresión eficiente de shRNA
-Promotor U6 más fuerte que H1
2. Eficiencia 13-23% en ratones fundadores
3. Posible letalidad embrionaria debido al knockdown de un gen esencial

Curr Gene Ther. 8(6): 483–488, 2008

Utilización vectores lentivirales en transgénesis

1. Microinyección en el espacio perivitelino

2. Remoción de zona pelúcida

3. Transferencia nuclear usando células somáticas o embrionarias

modificadas

4. Modificación de espermatozoides

5. Modificación de spermatogonial stem cells (SSC)

30-50% eficiencia transducción en SSC murinas con establecimiento de

colonias espermatogénicas en 100% ratones

50% progenie transgénica en ratas

 Desventajas

1. Nivel de seguridad BSL2

2. Límites de tamaño del vector viral

- Backbone vector viral 2.2 kb, promotor-gen <10 kb

1. Mosaicismo genético

- Proceso de integración dura aproximadamente 48 h o más

- T1/2 largo de los viriones en el espacio perivitelino

- Persistencia del complejo de preintegración en el citoplasma

4. Modificaciones epigenéticas:
Presencia de KRAB en sistema tet inducible provoca silenciamiento
total si no hay doxycyclina en los primeros días de desarrollo del
embrión.
Metilación promotores y genes en islas CpG internas (PKG)
Metilación del promotor por efecto de posición
5. Toxicidad vector
-VSVG tiene propiedad fusogénica
-Determinar dosis viral
 Bioseguridad

1. Deleción 3´LTR garantiza

partículas virales deficientes
de replicación.

2. Separación de elementos cis y

trans.

3. Deleción 80% genoma viral

4. Eliminación vectores con

detergentes suaves, bleach o
hipoclorito, seguido de lavado
con etanol
 Lentivectores en terapia génica

1. Células hepatocarcinoma humano transducidas con lentivectores con

un gen de suicidio bajo el promotor de alfa feto proteína resultó en una
destrucción específica de estas células malignas.
Cancer Gene Ther 10:689–695, 2003

2. Erradicación específica de células cancerosas in vitro y en un modelo

tumoral murino con lentivectores conteniendo el gen de la toxina A
diftérica bajo el promotor de PSA
Science 314:126–129, 2006
 Seudotipaje de los lentivectores

1. VSVG: amplio rango de tipos celulares

2. Uso glicoproteínas virales tejido específicas

3. Ingeniería genética de los dominios de unión al receptor de

proteínas de cubierta existentes para restringir, ampliar o cambiar la
especificidad viral.

4. Fusión de proteínas virales de cubierta a ligandos naturales.

5. Sistema de proteínas virales de cubierta del virus del sarampión:

-F: fusión de membranas

-H: mutación de residuos de unión y unión covalente a ligandos

naturales (EGF) o single chain antibody (anti CD20)

Mol Ther 16:1427–1436, 2008

 Objetivo
Obtener un BALB/c GFP transgénico como prueba de concepto de
lentitransgénesis en este background genético

Resultados

Baja toxicidad de la preparación viral:

- 60% embriones BALB/c y 66% FVB/n

Eficiencia transgénesis:

- total: 58% BALB/c y 48% FVB/n

- Activa: 20% BALB/c y 22% FVB/n

No interferencia GFP en el desarrollo y reproducción

Expresión de GFP por 6 generaciones

 B

A. Identificación macroscópica de una cría BALB/ GFP+ entre crías controles bajo luz ultravioleta. B. Análisis de
Southern Blott para determinar número de copias integradas. Carriles 1 y 2: ratones BALB/c GFP positivos.
Carriles 3, 4 y 5: ratones BALB/c no transgénicos. Carriles 6 y 7: DNA no añadido. Carril 8: vector de transferencia
LTRcPPT- EF1a-GFP-WPRELTR. ** Fragmentos mayores de 7 Kb. * Fragmento de 7 Kb.
c-f: Expresión de GFP en secciones de músculo (c), intestino (d), bazo (e), y nodos linfáticos (f) contrateñido con
DAPI. Intensidad alta de fluorescencia GFP está asociada con el esqueleto fibroblástico-estromal de la pulpa blanca
(*), y elementos vasculares incluyendo la arteriola central esplénica(**), y las vénulas de endotelio alto en el nodo
linfático (***).
 Caracterización de un ratón BALB/c GFP+

Perfil de distribución celular de la intensidad de fluorescencia de GFP en sangre periférica. Izquierda: Dot plot que
identifica poblaciones celulares por morfología. Centro: Distribución de la intensidad de fluorescencia GFP. Se
definen 3 grupos celulares por su intensidad de fluorescencia R1 (baja), R2 (media) y R3 (alta). Derecha: Dot plot
donde se muestran las poblaciones R1 (gris claro), R2 (gris oscuro) y R3 (negro).
Caracterización de un ratón BALB/c GFP+
Caracterización deRatones
un ratón BALB/c
BALB/c quimérico de médula
quimeras
ósea
Caracterización de un ratón BALB/c quimérico de médula
ósea
 Aplicaciones de este modelo BALB/c GFP+

Formación de tumores

Diseminación células tumorales

Homing y recirculación de linfocitos

Estudios de poblaciones celulares ex vivo

Vectores lentivirales

Lic. Saumel Pérez Rodríguez

Centro de Inmunología Molecular
Septiembre 2010