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INFORME DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

PREPARACION
DE MEDIO DE
CULTIVO
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INTRODUCCION

El presente trabajo de laboratorio se refiere al tema de “PREPARCION DE


MEDIOS DE CULTIVOS” se puede definir como un conjunto de nutrientes, factores de
crecimiento y otros componentes que en concentraciones adecuadas y en condiciones
físicas optimas permiten el crecimiento adecuado de los microorganismos. Cabe
recalcar que una forma muy útil de poder aislar, identificar y conservar los
microorganismos es mediante el uso de medios de cultivo, inicialmente ideados por
Pasteur (que como ya sabemos se considera el padre de la microbiología), quien se dio
cuenta que los microorganismos podían crecer en soluciones que tuvieran azúcar y una
fuente de nitrógeno.

En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de


cultivo. Lo que comúnmente se utiliza es el MEDIO COMUN que pueden ser preparados
en forma líquida, sólida y semisólida. El medio común es aquel que posee los
componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no
necesiten requerimientos especiales. La forma más sencilla de clasificar los medios de
cultivo es por su consistencia, entonces aparecen los medios de cultivo sólidos y los
medios de cultivo líquidos o también llamados caldos que ya se mencionaron
anteriormente. En ambos medios debe haber una buena cantidad de nutrientes que
faciliten el crecimiento bacteriano y la diferencia radica en la presencia de una sustancia
que se llama Agar o “Agar-Agar” y que es la encargada de darle la solidez y consistencia
al medio. Esta sustancia proviene, principalmente, de un alga llamada Gelidium, aunque
muchos otros géneros pueden servir como fuente de este polisacárido (es decir, un
azúcar grande formado por la unión de azúcares pequeños).

La ventaja fundamental de usar un medio de cultivo líquido, que se utilizó en la


práctica de laboratorio nos permite que crezcan las bacterias que se encuentran en muy
poca cantidad, es decir, cuya concentración es muy baja en la muestra que estamos
analizando. También es llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto
de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención
de una suspensión bacteriana de una determinada concentración. Para el caso del
medio de cultivo sólido, la ventaja radica en que permite detectar los diferentes tipos de
bacterias que puedan encontrarse en una sola muestra, entonces el usar uno u otro
medio de cultivo dependerá de lo que busquemos o queramos: aislar una bacteria que
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se encuentre en cantidades muy pequeñas (medio líquido) o todas las bacterias que
puedan haber en una muestra (medio sólido).

Los medios de cultivo son uno de los sistemas más importantes para la
identificación de microorganismos, pues se trata de observar su crecimiento en
sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio
en el que crecen los microorganismos es el medio de cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el cultivo.

Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como


ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación
de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios
de cultivo y la utilización del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de
inflexión en su evolución. La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos
llega del micólogo Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios
sólidos realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para
las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó
un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.
Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata
como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido,
diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido
transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias
microbianas
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MARCO TEORICO

1. TEMA:
“Preparación de medios de cultivo”

2. PROPOSITO:

 Identifica los requerimientos nutricionales de los microorganismos y


prepara diferentes medios de cultivo.

3. OBJETIVOS:

 Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes.

4. FUNDAMENTO:

 La preparación adecuada de un medio de cultivo nos permite disponer de


los nutrientes y condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de
los microorganismos en el laboratorio.

5. FUNDAMENTO TEÓRICO:
a. MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios
de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura,
grado de humedad y presión de oxígenos adecuados, así como un grado
correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los
nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos
similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por

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eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de


carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de
medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones
no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por
aquellas que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante, pero se emplea mucho menos ya
que bastantes bacterias provocan su licuación.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales
de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa,
bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos
fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar
reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a
identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el
crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

b. TIPOS BÁSICOS DE MEDIOS DE CULTIVO


SEGÚN SU ESTADO FÍSICO:

 Líquido: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se


denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulación.
 Semisólido: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando
a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para
preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la
movilidad de las bacterias. Contienen 0.5% de agar en su
formulación.
 Sólido: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación

SEGÚN SU COMPOSICIÓN
Definidos: Es aquél medio de cultivo del cual se conoce su composición
exacta. Son muy utilizados en estudios fisiológicos. Los medios mínimos
son medios definidos que únicamente le proporcionan al microorganismo
los nutrientes necesarios para crecer, pero no para desarrollarse
óptimamente.

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Complejos: Es aquél del cual no se conoce la composición exacta del


medio. A menudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto
de levaduras, extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas, pero de
las cuales se desconoce la composición química exacta. Estos medios son
muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de
requerimientos nutricionales muy complejos.

SEGÚN LA NATURALEZA DE SUS CONTITUYENTES:


Medios naturales o complejos: Constituidos por sustancias complejas de
origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la
adición de minerales y otras sustancias. en ellos no se conocen todos los
componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Medios definidos o sintéticos: Son los medios que tienen una composición
química definida cualitativamente y cuantitativamente. Generalmente se
usan en trabajos de investigación.

SEGÚN EL USO DEL MEDIO DE CULTIVO:


 Medios de enriquecimiento: Son medios líquidos que favorecen el
crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten
aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente
contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los
microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.
 Medios selectivos: Son parecidos a los de enriquecimiento, se
diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el
aislamiento de microorganismos específicos.
 Medios diferenciales: Son medios que contienen indicadores de
productos derivados de la actividad microbiana de los
microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con
actividad antimicrobiana, permiten revelar características fisiológicas
de los microorganismos.

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c. CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE


MICROORGANISMOS
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se
ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en
algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS


Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de
contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales
inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las
sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de
electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Todas estas
sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de
carne, extractos de carne o extractos de levadura. Actualmente, la forma
más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona
que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y
carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar
directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los
aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en
la peptona.

CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO


Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia
añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que
obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios
solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas
inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la
capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso
universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad
de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

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PRESENCIA (O AUSENCIA) DE OXÍGENO Y OTROS GASES


Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión
de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de
variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se
desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En
un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en
condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno
muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo
capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

CONDICIONES ADECUADAS DE HUMEDAD


Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas
microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas
condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando
una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para
el crecimiento de los cultivos.

LUZ AMBIENTAL
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad
que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el
caso de los microorganismos fotosintéticos.

PH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el
crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan
mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios
más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o
bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin
embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

TEMPERATURA
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas
entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a
80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas

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generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura


mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprófitos tienen rangos más
amplios.
ESTERILIDAD DEL MEDIO
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para
evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o
incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes
inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios
de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente
esterilizante).

6. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

a. EQUIPO

CANT. EQUIPO CARACTERISTICA IMAGEN


01 Hornilla
eléctrica

01 Balanza De presión de 3 ejes.


eléctrica

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b. MATERIALES

CANT. EQUIPO CARACTERISTICA IMAGEN


01 Probeta 100mL
graduada

01 Varilla de Ayuda a homogenizar


vidrio

01 Vaso 600mL
precipitado

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C. REACTIVOS
CANT. EQUIPO CARACTERISTICA IMAGEN
01 Frasco de 100mL
Peptona

01 Frasco de Ayuda a homogenizar


extracto de
carne

01 Frasco de 600mL
NaCl

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01 Cintas de Se utilizó para saber el


pH pH del caldo nutritivo.

01 Frascos Se utilizó para alcanzar


NaOH 0.1N un pH 7

01 Agua Solución liquida


destilada

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7. PROCEDIMIENTO

a. Primero pesamos los ingredientes según la cantidad requerida por los


medios a preparar. A continuación se explica detalladamente:

Cloruro de sodio: 0,125g/mL Extracto de carne: 0,25g/mL

Peptona: 0,25g/mL

b. Colocar la cantidad pesada en el matraz Erlenmeyer (con excepción del


agar granulado que se adiciona en caliente), adicionar agua destilada en
la proporción requerida. Homogenizar la mezcla mediante la varilla de
vidrio.

Mezcla homogénea de peptona,


extracto de carne y cloruro de
sodio.

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c. Calentamos la muestra (mezcla), empleando la cocina eléctrica, hasta


lograr la total disolución de los ingredientes.

d. Después de la disolución total de los ingredientes, enfriar a 50-55°C y


luego ajustamos el pH a 7,0 – 7,2 con NaOH 0.1 N.

En la imagen se observa que a la


solución se incrementa NaOH 0.1 N
para ajustar el pH, al final se obtuvo un
pH igual a 7.

e. Esterilizar a la autoclave a 15 Ib de presión (121 ° C) por 15 minutos.


Terminado el tiempo de esterilización, esperar que la aguja del manómetro
descienda y extraer los medios.
f. Los medios sólidos sometidos al proceso de esterilización y enfriados a
50-55°C, deben de repartirse en alícuotas de 12 a 15 mL en 1-2 placas

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Petri en condiciones asépticas; para ello se tendrá que seguir las


siguientes indicaciones:

No destapar las cajas de petri, sino hasta el momento que vayan a ser
utilizadas. Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a
realizar el vaciado y evitar hablar en todo momento para no contaminar el
medio de cultivo.
 Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca
del área estéril al momento del vaciado en las cajas de petri.
Levantar la tapadera de la caja petri con la mano izquierda, sin
soltarla y sin retirarla demasiado de la base de la misma caja
mientras que con la mano derecha tomar el matraz que contiene el
medio de cultivo y realizar el vaciado de aproximadamente 15 ml a
20 ml de Agar por placa procurando que no se forman burbujas, se
procede a tapar la caja inmediatamente.
 Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de
cultivo sobre la superficie de la caja de petri y de manera rápida.
Se procede a tapar la caja. Esperar a que el medio solidifique.
 Se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha y con iniciales
el tipo de medio de cultivo. Si las placas no se van a utilizar el
mismo día se sujetan con cinta y se colocan en el refrigerador de
manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga sobre
el medio de cultivo y lo pueda contaminar.
 Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, será
necesario secar las placas invertidas en estufa a 37 °C por 24 h,
para control de esterilidad.

g. Si se desea añadir medio sólido en tubos, entonces se esterilizará el Agar


directamente en los tubos a 121·C durante 15 minutos tapados con
algodón, gasa y papel estraza. Si desea que solidifiquen inclinados,
colocarlos en una superficie lisa inclinándolos en un ángulo de 20° a 30°
sobre una varilla de vidrio.

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8. RESULTADOS

 En la práctica de laboratorio se realizó un medio de cultivo (CALDO


NUTRITIVO) en la cual se midió el pH con ayuda del papel tornasol,
enseguida se evidencio un pH resultante igual a 5, el cual no favorece al
crecimiento de microrganismos ya que el pH adecuado para un medio de
cultivo varía entre 7- 7,2.

En la imagen se observa que la


solución diluida tiene un pH
igual a 5.

 Después se agregó a la solución una base “NaOH 0.1 N” de tres a cuatro


gotas para ajustar el pH y luego se obtuvo un pH igual a 7, como bien
sabemos para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de
cultivo debe reunir una serie de condiciones entre ellas un pH adecuado o
un grado correcto de acidez o alcalinidad, cabe recalcar que la mayoría de
ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro.

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Se observa que el pH neutro.

 Al final se obtuvo un medio de cultivo óptimo para el crecimiento de las


bacterias.

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CONCLUSIONES

 El preparado del caldo nutritivo tiene que poseer un pH de 7 ó +- 0,2, si este no


llegara a ser el caso, existen dos posibles formas de solucionarlos. En el caso de
que tenga un pH acido se le tiene que agregar NaOH, y en el caso de que tenga
un pH básico se le debe de agregar HCl, y estas acciones se realizan para lograr
un pH apto para el crecimiento microbiano.

 En la práctica realizada en el laboratorio se logró identificar los requerimientos


nutricionales que necesitan los microorganismos, para su crecimiento o
asilamiento.

 En conclusión, la ventaja fundamental de un preparado de medio de cultivo liquido


es el crecimiento óptimo de microorganismos que se encuentran en poca
cantidad, es decir, cuya concentración es muy baja de la muestra que se quiere
analizar.
 El resultado obtenido se dio gracias al buen manejo de cantidades de
componentes del medio de cultivo. Ya que, si este no hubiese sido el caso, no se
hubiera llegado al resultado obtenido.

 El resultado del experimento fue un medio nutritivo para el crecimiento microbiano,


pero este no estuvo completo ya que no puede ser finalizado sin una esterilización
en el autocontrol.

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RECOMENDACIONES

 De acuerdo con lo realizado en laboratorio debemos tener en cuenta la etiqueta


que tienen los frascos de advertencia, para así tener más cuidado con lo que
manipulamos y así utilizar los adecuadas indumentarias como son: los guantes,
cofia, mascaría, guardapolvo y un lentes adaptable al rostro.

 Al preparar el CALDO NUTRITIVO debemos tener en cuenta las cantidades que


se debe de utilizar de peptona, cloruro de sodio (NaCl), extracto de carne y el agua
destilada.

 De acuerdo a la práctica realizada en el laboratorio si el CALDO NUTRITIVO tiene


un pH menor a 7 se le debe de agregar “hidróxido de sodio” (NaOH) para así
tener un pH adecuado, pero si tiene un pH mayor a 7 se le debe de agregar “ácido
clorhídrico” (HCl) para que llegue a un pH 7 ya que es recomendable que tenga
este pH para un buen medio de cultivo.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos


Generales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela
 Dugas Beverly Tratado de Enfermería Práctica Nueva Editorial Interamericana
México, 1999. http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-
de-Medios-de-Cultivo
 Sofía Gutiérrez de Gamboa, Octubre 2001.
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Pre
paraci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf
 http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm
 https://libroslaboratorio.files.wordpress.com/2012/09/medios-de-cultivo-en-un-
laboratorio-de- microbiologc3ada.pdf

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