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BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA MARIO CARO GALIANA | 1º LCB

ACTIVIDADES UD7

1. ¿Que es la clonación molecular? Enumera sus ventajas como técnica de amplificación


de ADN. ¿Que dos elementos son imprescindibles para clonar una molécula de ADN?

La clonación molecular es un proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o


de ADNc basada en la tecnología de ADN recombinante.
Las ventajas que presenta la clonación son las siguientes:
- Permite obtener prácticamente cantidades ilimitadas de la secuencia de interés.
- Se puede clonar secuencias de ADN de gran tamaño.
- En un único proceso se puede clonar el genoma entero de un organismo.
- Posibilita la expresión de genes o de secuencias de interés, de lo que derivan
aplicaciones industriales para la producción de proteínas, hormonas, etc.
Los elementos imprescindibles para clonar una molécula de ADN son el vector de clonación y
una célula hospedadora

2. Ordena los tipos de vectores que aparecen en la columna de la izquierda según el


tamaño del inserto que pueden transportar (de menor a mayor) y emparéjalos con las
correspondientes características que figuran en la columna de la derecha.

1-D 2-F 3-C 4-B 5-A 6-E

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3. Dibuja un esquema de un vector de clonación plasmídico con sus componentes


principales y explica la función de cada uno de ellos.

4. Haz un resumen de las células hospedadoras procariotas y eucariotas que se usan para
clonación.

- PROCARIOTAS​: se usan para clonar plásmidos, fagos y cósmidos; por su escasa


complicación técnica que supone su manipulación, su gran versatilidad y la rapidez con
que crecen. Se suelen usar cepas que carecen de algunas actividades enzimáticas como
por ejemplo la actividad exonucleasa.
- EUCARIOTAS​: podemos diferenciar entre levaduras; que son organismos unicelulares
que crecen de manera similar a las bacterias en medios de cultivo sólidos y líquidos, y
vegetales y animales; que son utilizadas en experimento de clonación encaminados a la
inserción de genes extraños en el genoma de la célula hospedadora y su posterior
expresión para obtener organismos transgénicos.

5. Enumera las fases del proceso de clonación y explica en dos frases lo que se hace.

- PREPARACIÓN DEL ADN QUE SE VA A CLONAR​: La forma más habitual de dotar a un


ADN bicatenario de extremos cohesivos es tratarlo con una enzima de restricción. Con
esto, partimos de un ADN genómico completo de un organismo purificado y digerido con
una enzima de restricción que sea compatible con el vector que se va a utilizar y que no
se tenga una diana de restricción en el interior de la secuencia que se quiere clonar. La
compatibilidad con el vector implica que se debe tener una diana de restricción para la
misma enzima. Para ahorrar gastos y tiempo se puede amplificar previamente el gen que
se quiere clonar.
- PREPARACIÓN DEL VECTOR DE CLONACIÓN
Consiste en digerir el vector con la misma enzima de restricción que se utilizó para
preparar el ADN que va a clonar. Hay varias situaciones: vectores circulares o lineales
con una o dos dianas de restricción. Al final de las digestiones generan fragmentos
lineales con extremos cohesivos que facilitarán la inserción del ADN extraño al vector.
- INSERCIÓN DEL ADN EXTRAÑO EN EL VECTOR

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6. Explica las diferentes maneras selección e identificación para la selección de los clones
recombinantes.

Este proceso de selección e identificación se puede realizar de varias maneras:


- GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS​: Se basa en el empleo de vectores con genes
de resistencia a antibióticos. Si las células están transformadas con el vector crecerán en
un medio con ese antibiótico.
- ESTRATEGIA CROMOGÉNICA​: Se combina unas bacterias hospedadoras lactosa negativa
y sensible a un antibiótico y el vector contiene el gen LacZ y un gen de resistencia a
antibiótico. Al transformarse la bacteria hospedadora será resistente al antibiótico.
- PROTEÍNAS FLUORESCENTES​: Se basa en el empleo de vectores con un gen de
resistencia para realizar la selección y un gen que codifica una proteína fluorescente
para la identificación.
- GENES LETALES​: Es una metodología reciente, que utiliza varios vectores con un gen de
resistencia a un antibiótico y un gen que codifica para una proteína letal para las
bacterias. En los vectores recombinantes la proteína letal no es funcional porque la
secuencia génica queda interrumpida por el inserto de ADN extraño. Solo crecerán las
bacterias que porten el vector recombinante.

7. Enumera las enzimas que hacen falta para poder crear un vector recombinante.

- La misma enzima de restricción que se utilizó para preparar el ADN que va a clonar.

8. Se ha transformado una cepa de E.coli sensible a la ampicilina con un plásmido


recombinante que tiene un gen de resistencia a la ampicilina. La transformación se
realizó añadiendo 20 microlitros de una solución de plásmido con una concentración de
0,03 microgramos/microlitro a 500 microlitros de suspensión bacteriana. A continuación
se sembraron 25 microlitros en una placa con ampicilina. A las 24 horas de incubación, a
37ºC, crecieron 120 UFC. Calcula: a) Tasa de transformación recombinante.

UFC= 120
C= 20 x 0,03= 0,6 µg de vector
Vs: 25µl
Vt: 25µl​ ​+ 500µl​ = ​525 µl​ t​ otales

UFC * V t
T asa transf ormación = C * Vs ;
120 * 525
T asa transf ormación = 0,6 * 25 = ​4200 células transformadas/µg de vector.

9. Explica las diferencias que hay entre una biblioteca genómica, una biblioteca
cromosómica y una biblioteca de ADNc.

- GENÓMICA: Son colecciones de vectores recombinantes clonados que incluyen el


genoma completo de un organismo. Dada su complejidad de los organismos superiores,
se suelen usar vectores de alta capacidad como vectores en fago, cósmidos, BAC o YAC.

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- CROMOSÓMICA: Están construidas a partir de un único cromosoma o fracción


cromosómica que se aísla por citometría de flujo.
- DE ADNc: Se obtienen a partir del ARNm de un tejido o una población celular
determinada, previa transcripción inversa con una retrotranscriptasa. Por tanto,
representan sólo el subconjunto de genes de un organismo que se están expresando en
un tipo celular y un estado metabólico concretos. Sólo porta el gen sin intrones, ni
promotores y secuencias reguladoras.

10. Haz un resumen de las aplicaciones de la clonación molecular tiene para la medicina.

- RATONES TRANSGÉNICOS: Donde se estudian las enfermedades genéticas como de


compresión de la enfermedad, como a nivel de tratamiento.
- TERAPIA GÉNICA: Consiste en transferir genes normales a células somáticas para
corregir una enfermedad genética. Con esto se consigue que las células tratadas
sinteticen el producto génico normal, evitando así un tratamiento farmacológico de por
vida.