3B-2

GUIA DE PRÁCTICAS

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

EAP DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

MICROBIOLOGIA GENERAL
INTRODUCCION:

La Microbiología es una ciencia que estudia a los organismos microscópicos denominados

microorganismos los cuales se definen como aquellos seres vivos unicelulares o
pluricelulares carentes de organización tisular y que no pueden ser visualizados al ojo
humano necesitando para ello el microscopio
Para el estudio de este tipo de seres vivos se necesita el conocimiento de técnicas únicas
denominadas Técnicas microbiológicas
Estas Técnicas han permitido el conocimiento de las diferentes estructuras y composición
bacteriana pudiendo comprenderse como muchas bacterias se relacionan con el hombre ya
sea como integrantes de la flora normal o como agresoras para el mismo
El estudio de la composición bioquímica de la estructura bacteriana junto al conocimiento
de su metabolismo permite hoy la comprensión del mecanismo de acción de los diferentes
antibióticos
Hoy en día los avances de la genética bacteriana hacen posible el desarrollo de técnicas de
Biología molecular con aplicaciones a nivel de la investigación científica y el diagnóstico
donde los microorganismos cumplen un rol protagónico
El conocimiento, ,manejo y utilización de los principales equipos, instrumentos y
materiales utilizados en el laboratorio de microbiología es indispensable para la ejecución y
desarrollo de las prácticas durante el curso de microbiología general que permitirán al
alumno, futuro profesional de la salud aplicar estos conocimientos en el estudio de
diferentes especialidades en el campo de la microbiología

F-CV3-3B-2 1 Rev. Junio 2007

 PRACTICA Nº 1
MANEJO DE LOS PRINCIPALES EQUIPOS E INSTRUMENTOS,
PREPARACIÓN DE MATERIAL DE VIDRIO, MATERIAL AUXILIAR
Y SU FORMA DE ESTERILIZACIÓN
1.1 Marco teórico
En el laboratorio de Microbiología es necesario utilizar material limpio, sin trazas de
detergente y estériles para el aislamiento y posterior identificación de los gérmenes que se
está investigando, se entiende por
Limpieza al proceso físico utilizado en los objetos en uso del laboratorio para eliminar
materia orgánica y residuos, mediante el lavado con agua con o sin detergente.
Desinfección Es un proceso en el que se utilizan principalmente agentes químicos.
Esterilización que viene a ser la destrucción de toda forma de vida, ésta puede ser por
vapor saturado (autoclave) o por calor seco (horno)

1.2 Competencias
1.2.1 Maneja y usa equipos y materiales en el Laboratorio.
1.2.2 Estudia in Vitro a los microorganismos.
1.2.3 Prepara e identifica el material de vidrio
1.2.4 Los métodos de esterilización

1. 3 Materiales y equipos
 Equipos e instrumentos tales como: Autoclave, horno, incubadora, baño María,
refrigeradora,, equipo para luz ultravioleta , equipo de esterilización por filtración,
cámara de flujo laminar, centrifuga y microscopio compuesto,
 Portaobjetos y cubreobjetos
 Papel para lente
 Aceite de inmersión
 Torundas de algodón
 Gasa
 Asa de Kolle
 Cultivo bacteriano
 Papel kraft
 Tubos de prueba
 Placas Petri
 Balones, vaso de precipitados, pipetas y matraz de vidrio
 Cinta indicadora de esterilización (para autoclave)

1. 4 Procedimiento
1.4.1 Examina cada uno de los siguientes equipos e instrumentos del laboratorio:
autoclave, horno, incubadora, cámara de flujo laminar, baño maría, equipo de

F-CV3-3B-2 2 REV. JUNIO 2007

 esterilización por filtración, centrifuga y microscopio e identifica sus componentes,
su aplicación y utilización en el laboratorio.
1.4.2 Observa al microscopio las muestras que a continuación se indican:
Cultivo bacteriano:
 Coloca sobre la lámina portaobjeto una gota de cultivo bacteriano y deja caer la
lámina cubreobjeto.

1.4.3 .Preparación de material de vidrio y material auxiliar:

 Confecciona tapones de algodón para el material de vidrio proporcionado, estos
deben ser consistentes y de un tamaño apropiado que permita su manipulación.
 Empaqueta este material con papel kraft, en igual forma también se procede con
todo el material auxiliar que se use en el laboratorio para someterlo a un proceso
de esterilización y luego conservar su esterilidad .un tiempo adecuado
 Las placas Petri y los tubos de prueba (previamente taponados) se envuelven
formando paquetes de tres y seis unidades respectivamente. Debe tenerse especial
cuidado en que el papel utilizado se encuentre íntegro y sin orificios. Para las
torundas e hisopos se procede de igual forma.
 En el caso de las pipetas, se cortan bandas largas (tiras) de papel kraft y se las
envuelve en forma diagonal y empezando por la punta, colocando un refuerzo de
papel en esta sección, de esta forma la pipeta quedará íntegramente cubierta por el
papel. Al final de la envoltura se dejará una porción en la que se escribirá en
números la capacidad de volumen de la pipeta.
1. 5 Resultados
Se registra detalladamente cada una de las observaciones hechas y se realiza los esquemas
y dibujos necesarios: Equipo de laboratorio (indicando sus componentes). Procede de igual
forma con el material de laboratorio empleado
1. 6 Cuestionario.

1.- ¿Con qué propósito se envuelve totalmente el material a esterilizar?

2.- ¿En un cuadro comparativo explicar las diferentes formas y condiciones del proceso de
esterilización que emplea según el tipo de material a esterilizar?

1. 7 Fuentes de información
 Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. Microbiology: An Introduction, Books a
la Carte Edition. 13va edición. Editorial Pearson. 2018

F-CV3-3B-2 3 REV. JUNIO 2007

 PRACTICA Nº 2
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SU FORMA DE
ESTERILIZACIÓN MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS,
SEMISÓLIDOS Y LÍQUIDOS
2.1 Marco teórico
Es importante aislar y observar el crecimiento de un microorganismo para su identificación,
por lo que se utilizan materiales alimenticios artificiales preparados en el laboratorio
llamados medios de cultivo y su desarrollo es el cultivo
Sus requerimientos varían considerablemente algunos sólo requieren sustancias simples
(bacterias no exigentes) y otros requieren de sustancias complejas (bacterias exigentes)
2.1.1.- Medios de Cultivo
Son sustancias o compuestos nutritivos estériles que permiten el crecimiento y
multiplicación de los microorganismos en el laboratorio, este medio debe cumplir una
serie de condiciones como son temperatura, grado de humedad, y presión de oxígeno
adecuados, además de nutrientes y factores de crecimiento y estar exento de todo
microorganismo contaminante con el objeto de aislar las diferentes especies bacterianas y
proceder a su identificación mediante estudios complementarios.
2.1.2.- Clasificación de los medios de cultivo:
1) Según su consistencia
a. Medios líquidos: en estado líquido
b. Medios sólidos: con concentraciones de 0.5% a 2% de agar
c. Medios semi-sólido:: con concentraciones de 0.3% a 0.5% de agar
2) Según su composición
a. Medios no selectivos: son componentes mínimos para que pueda producirse
el crecimiento de bacterias no exigentes.
b. Medios enriquecidos: preparados para reunir los requerimientos
nutricionales de bacterias más exigentes, compuestos de medio basal
ordinario y suplementado con factores de crecimiento (ejemplo: sangre,
suero sanguíneo, vitaminas, etc.).
c. Medios selectivos: favorecen el crecimiento de ciertas bacterias.
d. Medios inhibidores: inhiben el crecimiento de ciertas bacterias.
3) Según su origen
a. Medios naturales: preparados a partir de sustancias naturales de origen
animal o vegetal.
b. Medios sintéticos: contienen una composición química definida cuali y
cuantitativamente. Pueden ser sintético simples o sintéticos complejos.
c. Medios semisintéticos: poseen compuestos naturales y químicos.

2.1.3.-Preparación de medios de cultivo:

Es preciso ejercer un cuidado meticuloso en su preparación los que deberán ser
esterilizados inmediatamente una vez preparados

F-CV3-3B-2 4 REV. JUNIO 2007

Los tubos de ensayo que contienen los medios se tapan con tapones de algodón o tapas
metálicas o plásticas con el fin de evitar la penetración de microorganismos extraños, luego
se esterilizan
Las placas Petri se esterilizan por separado y luego los medios se vierten asépticamente en
ellas.

2.2 Competencias
Realiza un listado de los principales medios de cultivo y su aplicación, así como los
indicadores más usados
Prepara y esteriliza diversos medios de cultivo

2.3 Materiales y equipos:

- Probetas de 1000 mL y frascos de 250, 500, 1000 mL
- Solución de: NaOH 1N y HCl 1N
- Trípodes con rejilla metálica
- Tubos estériles y placas Petri estériles ,baguetas ,beakers
- Papel indicador de pH y/o potenciometro
- Agar: Tripticase de Soya (TSA), SIM (Azufre – Indol – Motilidad), EMB, gelatina
- Caldo: Tripticase de Soya (TSB), caldo peptonado
- Cloruro de sodio y agua destilada

2.4 Procedimiento
- Disuelve en agua destilada los medios comerciales proporcionados, según la
indicación del envase, a los que contengan agar será necesario someterlos a la
acción del calor hasta su completa disolución.
- Enfría este preparado hasta aproximadamente 50ºC.
- Mide el pH del medio, con la cinta indicadora.
- Si es necesario, ajusta el pH empleando NaOH 1N o HCL 1N.
- Envasa, rotula, señalando el tipo de medio y la fecha de preparación.
- Esteriliza por autoclave a 15 lb de presión por 15 a 20 minutos.
- Controla la esterilidad del medio, por incubación del mismo a 37ºC por 24 horas.
- Para el caso del caldo peptonado, se procederá a la disolución de los siguientes
componentes: peptona 10 g y cloruro de sodio 10 g, luego se completa con agua
destilada hasta 1000 mL; y se llevará a pH de 8.8 +/- 0,1.

2. 5 Resultados
Se describirá su composición y el fundamento de las diferentes clases de medios de
cultivo utilizados

2.6 Cuestionario:
1. ¿Que importancia tiene el uso de los medios sólidos?
2. ¿Qué sustancia es la encargada de solidificar los medios de cultivo sólido? ¿De dónde
se extrae?
3.

F-CV3-3B-2 5 REV. JUNIO 2007

2.7 Fuentes de información
 De la Garza, J. J. P., & Prieto, J. P. Compendio de microbiología. Elsevier España.
2016 Struthers, J. K. Clinical microbiology. 2da edición. CRC Press. 2018

F-CV3-3B-2 6 REV. JUNIO 2007

 PRACTICA Nº 3
TÉCNICAS DE SIEMBRA Y DESARROLLO MICROBIANO
3.1.-Marco teórico
3.1.1.- Técnicas de siembra:
Las muestras a analizar pueden presentar poblaciones microbianas mixtas, por esta razón se
utilizan diversas técnicas para separar un microorganismo de otro y obtener así un
cultivo puro que permita identificar al microorganismo aislado.
El diagnóstico bacteriológico se basa en el aislamiento de microorganismos a partir de una
muestra, por lo que es indispensable tener en cuenta las máximas condiciones de asepsia,
desde la toma de muestra hasta la siembra, la cual debe efectuarse lo más rápido posible.
Términos importantes:
 Siembra
 Inóculo
 Cultivo puro
 Cepa
Se denomina “técnica de siembra” al procedimiento mediante el cual se pone en contacto a
los microorganismos con un medio de cultivo y después de un período de incubación se
produce el desarrollo de colonias bacterianas. Existen varios tipos de siembra, entre los
cuales están los siguientes:
- Siembra por dispersión y agotamiento
- Siembra por puntura
- Siembra por estría
- Siembra por inoculación
- Siembra por incorporación, en placa vertida, en masa o en todo el medio
- Siembra por diseminación o en superficie o con cayado
3.1.2.- Desarrollo bacteriano
Algunas veces las especies bacterianas se pueden identificar basándose en el aspecto que
tienen sobre o dentro de los distintos medios de cultivo , es así que la observación de las
características de crecimiento de las colonias de microorganismos en medio sólido (agar) y
líquido (caldo), puede ser de gran utilidad.
Estudio bacteriano en medio líquido:
-Velocidad de desarrollo (crecimiento): lento, moderado, rápido.
-Aspecto: turbio, claro o transparente, difuso, granulado. Se registran las observaciones
como: presencia o ausencia de: turbidez, sedimento y “película”.
-Producción de gas: formación de burbujas.
Estudio bacteriano en medio semisólido:
-Movilidad
-Cambios metabólicos
Estudio bacteriano en medio sólido:
- Características morfológicas de las colonias en cuanto a: elevación, forma, borde,
superficie, tamaño, consistencia y color de pigmentación.

3.2.- Competencias
F-CV3-3B-2 7 REV. JUNIO 2007
 - Realizará diversas técnicas de siembra para su cultivo y aislamiento
- Aplica las técnicas de aislamiento hasta la obtención de cultivos puros
- Describe sus observaciones usando la terminología técnica apropiada

3.3.- Materiales y equipos

- Placas Petri con agar TSA
- Tubos con agar SIM y TSA en agar inclinado
- Tubos con caldo TSB
- Cultivos de: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y
Pseudomonas aeruginosa
- Asas de siembra en aro, asa en punta
- Incubadoras
- Gradillas para los tubos

3.4.- Procedimiento:
3.4.1 Técnicas de Siembra en Medios Líquidos, Semisólidos y Sólidos:
Siguiendo la metodología descrita según los esquemas anexos, proceder tal como
sigue:
- Con el asa en aro previamente esterilizada, tomar una asada del cultivo de
microorganismos, y sembrar por el método de dispersión y agotamiento en las
placas de TSA.
- Con el asa en punta previamente esterilizada, tomar el inóculo del cultivo de
bacterias y sembrar en agar SIM, por el método de puntura.
- Con el asa en aro, toma el inóculo del cultivo bacteriano y siembra en el tubo con
agar en pico de flauta o plano inclinado, por el método de estría.
- Con el asa en aro previamente esterilizada tomar una asada del cultivo, y sembrar
por el método de inoculación en el tubo con TSB.
3.4.2 Desarrollo bacteriano:
- Efectuará la lectura de los cultivos proporcionados por la profesora y observa. Tener
sumo cuidado de no sacudir los cultivos en caldo ya que esto puede trastornar los
crecimientos superficiales; describir. Hacer los esquemas de todas las
observaciones.

3.5.- Resultados:
Reporta y describe

3.6 Cuestionario:
1. ¿Con qué propósito se emplean cada una de las diferentes técnicas de siembra?
2. Describe las características del crecimiento de cada uno de los cultivos bacterianos
proporcionados en la práctica.
3. Describe el método de siembra por incorporación y señala en que casos se emplea

3.7 Fuentes de información

F-CV3-3B-2 8 REV. JUNIO 2007

  Murray, P. R. Basic medical microbiology. Elsevier. 2018
 Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. Microbiology: An Introduction, Books a
la Carte Edition. 13va edición. Editorial Pearson. 2018

F-CV3-3B-2 9 REV. JUNIO 2007

 PRACTICA Nº 4
MÉTODOS DE COLORACIÓN

4.1 Marco teórico

1. Coloración Simple:
Aquella coloración en la que se utiliza sólo un colorante, el cual va a permitir visualizar la
morfología de los microorganismos.
2. Coloración Gram:
La diferenciación de Gram se basa en el color que adquieren las bacterias cuando se tratan
con el colorante cristal violeta seguido por una solución lugol (mordiente), para luego
someterlas a una decoloración con alcohol acetona 50%, después de la cual se usa una
coloración de contraste la safranina. Las bacterias gram-positivas (coloración azul o
morada) son resistentes a la decoloración y conservan el complejo cristal violeta-yodo, los
microorganismos gram-negativos, toman la coloración de contraste (coloración rosa o roja).

4. 2 Competencias
Capacita y adiestra al estudiante para que (el) (la):
- Realice manualmente métodos de tinción habituales usados en la preparación de
láminas de observación
- Describa minuciosamente sus observaciones, al microscopio

4.3 Materiales y equipos

4.3.1.- Cultivos bacterianos:
a) Cultivo de Escherichia coli
b) Cultivo de Staphylococcus aureus
c) Cultivo de Klebsiella
4.3.2.- Coloración simple:
a) Azul de Metileno
4.3.3.- Coloración Gram:
a) Violeta de genciana (colorante primario)
b) Lugol (mordiente)
c) Alcohol – acetona 50% (decolorante)
d) Safranina (colorante de contraste)

4.4 Procedimiento
1. Coloración simple:
- Prepara un frotis a partir del cultivo proporcionado.
- Fija al calor.
- Cubre el frotis con el colorante Azul de Metileno y deja actuar por 3 a 5 minutos.
- Lava con agua y deja secar.
- Observa al microscopio con objetivo de inmersión.
-
2. Coloración Gram:

F-CV3-3B-2 10 REV. JUNIO 2007

 - Prepara frotices de cultivos de E. coli y S. aureus.
- Deja secar al aire y fija con calor.
- Cubre los frotices con reactivo de cristal violeta durante un minuto.
- Lava los portaobjetos con agua corriente durante 5 segundos.
- Cubre el frotis con la solución de lugol y deja actuar durante 2 minutos.
- Lava con agua corriente, y aplica lentamente el alcohol – acetona y seguirá
agregando hasta que la tintura ya no fluya del frotis.
- Lava inmediatamente con agua corriente.
- Cubrirá el frotis con la solución de safranina durante 30 segundos.
- Lava con agua corriente y deja secar la preparación.
- Observa al microscopio utilizando el lente de inmersión.
-

4.5 Resultados

Registra, dibuja y colorea la morfología de cada una de las muestras coloreadas

4. 6 Cuestionario
1. ¿Qué importancia tiene la pared celular bacteriana en la coloración de Gram?
2. ¿Cuáles son las diferencias químicas importantes que explican el estado ácido-
resistente?
4. 7 Fuentes de información
 Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. Microbiology: An Introduction, Books a
la Carte Edition. 13va edición. Editorial Pearson. 2018
 Jawetz, Ernst. Microbiología Médica de Jawets (25). s.I: Mac Graw-Hill.2011
  Manual de Practicas de Microbiologia General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_gen
eral.pd

F-CV3-3B-2 11 REV. JUNIO 2007

 PRACTICA Nº 5
METABOLISMO MICROBIANO

5.1.- Marco teórico

En esta práctica se presentará un panorama general de las reacciones bioquímicas
microbianas relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos y sobre las proteínas,
haciendo uso de las pruebas bioquímicas diferenciales que permiten la identificación de
microorganismos (en especial los microorganismos patógenos)
.
5.2 Competencias
Manipula e identifica los microorganismos en función a su comportamiento bioquímico.

5.3 Materiales y equipos

a) Placas con agar TSA
b) Tubos con: gelatina, caldo peptonado
c) Tubos con medio de: Citrato de Simmons en plano inclinado, Urea, TSI en plano
inclinado y con TSA.
d) Cultivos de: E. coli, B. subtilis,Ps. aeruginosa, Enterobacter, Proteus vulgaris,
Staphylococcus. Aureus.
e) Reactivos de kovac
f) Peróxido de hidrógeno al 3%.
g) Pipetas Pasteur.
h) Tiras de oxidasa

5.4 Procedimientos

Principios bioquímicos de las reacciones en TSI:

Primer día
- Con el asa de siembra, inocula una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y
estría la superficie del pico de flauta.
- Rotula e incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada.
- Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
- Fermentación de la glucosa únicamente (rojo/amarillo): esto se debe a que la glucosa
(que se encuentra en baja concentración con respecto a los otros azucares) ha sido
utilizada y la cantidad de ácido producido no es suficiente para neutralizar los productos
alcalinos generados por la utilización de las peptonas. Estos procesos que son
oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no estar en
contacto con el oxígeno, solo hay fermentación y el medio permanece ácido.

F-CV3-3B-2 12 REV. JUNIO 2007

- Fermentación doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo): la fermentación de la
glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azúcares produce gran cantidad de ácido,
por lo que el tubo permanece amarillo.
- No fermentación de carbohidratos (rojo/anaranjado): se presenta únicamente utilización
oxidativa de peptonas, por lo que solo la superficie del tubo se alcaliniza.
- Producción de gas: formación de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.
Acción sobre las proteínas
Hidrólisis de la gelatina:
Primer día
- Rotula cada tubo con el nombre de la cepa correspondiente: E. Coli y B. Subtilis.

- Inocula cada cepa en un tubo con gelatina, haciendo uso de un asa en punta,
introduciendo de manera vertical hasta el fondo del tubo.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa los resultados. Observa la hidrólisis de la gelatina
-
Producción de indol:
Primer día
- Rotula sus tubos con el nombre del microorganismo: E. coli y B. subtilis.
- Inocula cada cepa en su tubo correspondiente.
- Incuba a 37ºC por 24 horas
Segundo día
- Agrega 4 gotas del reactivo de Kovac´s, dejando resbalar por la pared interna de
cada tubo que presenta desarrollo bacteriano, luego agite suavemente.
- La reacción es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona
superior del tubo, pocos segundos después de haber agregado el reactivo.
- Las bacterias que a pesar de desarrollar en el medio no producen indol,
permanecerán sin cambio alguno (reacción negativa).
-
Producción de sulfuro de hidrógeno:
Primer día
- Por la técnica de puntura y estría, siembra separadamente en el medio TSA las cepas
de E. coli y P. vulgaris.
- Coloca una tira de papel de filtro impregnada con acetato de plomo.
- Incuba a 37ºC por 24 horas
Segundo día
- Observa el ennegrecimiento del papel de filtro, por la producción del sulfuro de
hidrógeno (reacción positiva).
-
Pruebas bioquímicas diferenciales
Utilización del citrato:
Primer día
- Siembra por la técnica de estría en cada tubo con las cepas de E.coli y Enterobacter
aerogenes.
- Incuba a 37ºC por 24 horas
Segundo día

F-CV3-3B-2 13 REV. JUNIO 2007

 - La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del
agar en 24 a 48 horas.
- Es negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.
-
Hidrólisis de la úrea:
Primer día
- Por la técnica de estría, siembra los tubos con medio de urea con E.coli y P.vulgaris.
No inocular el fondo.
- Rotula e incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- La prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la superficie o en todo
el tubo.
- La prueba es negativa, si el medio permanece del color original.
-
Prueba de la catalasa:
- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el
cultivo de Staphylococcus aureus o Streptococcus viridans, y transferir el inóculo a
un portaobjetos limpio.
- Añade de 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
- Observa si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el
reactivo.
- Descarta la lámina en un recipiente con desinfectante.
-
Reacción de la citocromo oxidasa:
- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el
cultivo de E coli o Pseudomona, y transferir el inóculo a una tira del reactivo de
oxidasa.
- Considera la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloración azul violáceo
intensa en la tira, en un máximo de 5 segundos.

5.5 Resultados
Reporta los resultados y explica el fundamento bioquímico de cada una de las pruebas
realizadas en la práctica

5.6 Cuestionario.
1. ¿Cómo podría emplear las conclusiones que derivan de esta práctica para clasificar a
las bacterias?
5.7 Fuentes de information
 Wiley, J., Sherwood, L, Woolverton, C. Prescott’s Microbiology. 10ma edición.
McGraw-Hill Education. 2017
 Talaro, K. P., Ches, B. Foundations in microbiology. 10ma edición. McGraw-Hill
Education. 2017

SEMINARIO
F-CV3-3B-2 14 REV. JUNIO 2007
 PRACTICA Nº 6
METODOS FISICOS Y QUIMICOS DE CONTROL MICROBIANO

6.1. - Marco teórico

6.1.1. - Acción de los agentes físicos y químicos sobre la viabilidad de las bacterias
La muerte microbiana se produce cuando una célula no puede volver a dividirse para
formar dos nuevas células o sea pierden su viabilidad
En esta práctica vamos a determinar si un tratamiento específico mata todas las células, si
reduce su número hasta niveles aceptables o si simplemente detienen el crecimiento
durante un período de tiempo limitado
Los aspectos químicos de esta práctica se limitan a los compuestos que son normalmente
tóxicos y que se consideran como materiales desinfectantes o antisépticos
6.1.2.- Efecto de los desinfectantes químicos:
Con frecuencia se desea una rápida desinfección y esterilización a temperatura ambiente,
sobre todo para diferentes objetos que pueden dañarse al aplicarles calor.
Existen varios compuestos químicos tales como los fenólicos, el formaldehído, alcoholes,
halógenos y detergentes, para la desinfección a la temperatura ambiente.
Una práctica muy común ha consistido en considerar al etanol al 70% y el isopropanol
como soluciones esterilizantes universales.

6.2 Competencias
- Elabora un listado de productos farmacéuticos cuya fabricación sea resultado de
procesos biotecnológicos
- Ensaya y observa el efecto de los agentes físicos y químicos sobre la viabilidad de
las bacterias.
-
6.3 Materiales y equipos
1. Desarrollo bacteriano:
- Cultivos de la práctica anterior sembrados en los distintos medios
Características morfológicas de los cultivos bacterianos.
-
2. Acción de los agentes físicos y químicos sobre la viabilidad de las bacterias
- Solución de: merthiolate, tintura de yodo, cristal violeta, fenol al 5%, hipoclorito de
sodio 5%.
- Discos de Papel filtro
- Placas con agar nutritivo
- Cultivo de: Escherichia coli, Staphylococcus, Bacillus subtilis
- Baño maria
- Frasco con 30 mL de caldo nutritivo
- Pipetas estériles de: 1 mL y 5mL
- Placas petri estériles (6 por cada grupo)
- Tubos estériles (8 por cada grupo)
- Tubos con Agar nutritivo (4 por cada grupo)
- Hisopos estériles
F-CV3-3B-2 15 REV. JUNIO 2007
 - Asas de siembra
- Incubadora
- Autoclave

6.4.- Procedimiento

6.4.1.- Acción de los agentes físicos y químicos sobre la viabilidad de las bacterias:
Acción del calor (llama directa)
- Esteriliza el asa de siembra a la llama directa del mechero.
- Toma el inóculo y siembra en la mitad de la placa con agar nutritivo
- Esteriliza el asa de siembra, tomar otro inoculo, somete a la acción de la llama
directa y siembra en la otra mitad del agar.
- Rotula e incuba a 37ºC durante 24 horas.

6.4.2 Acción de los agentes químicos

- Inocula abundantemente la superficie de una placa de agar, con 3 asadas del
microorganismo en estudio. Disemina uniformemente.
- Con una pinza previamente esterilizada, coloca los discos de papel embebidos con
las sustancias suministradas y equidistantes entre sí.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.

6. 5 Resultados
Reporta y describe:
1. Las características del crecimiento de cada uno de los cultivos bacterianos ensayados.

6.6 Cuestionario
1.- El cuestionario se proporcionara a medida que se desarrolle la práctica

6.7 Fuentes de información

 Tobón, S. R., Cadavid, R. M. A., & Gutiérrez, L. A. Patógenos Microbianos e
Indicadores Microbiológicos de calidad del agua para consumo humano. Facultad
Nacional de Salud Pública: El escenario para la salud pública desde la ciencia, 2017,
35(2), 2.
 Wiley, J., Sherwood, L, Woolverton, C. Prescott’s Microbiology. 10ma edición.
McGraw-Hill Education. 2017

F-CV3-3B-2 16 REV. JUNIO 2007

 PRACTICA Nº 7
EFECTOS DE LOS ANTIBIÓTICOS SOBRE LAS BACTERIAS

7.1 Marco teórico

Los antibióticos (anti-contra; bio-vida) constituyen un grupo de compuestos
terapéuticamente útiles.
Estos compuestos químicos se caracterizan por ser subproductos metabólicos de un
microorganismo, y casi siempre son letales para otro microorganismo no relacionado. A
partir de 1940, se aislaron numerosos antibióticos, que probaron ser eficaces contra una
variedad de microorganismos patógenos (bacterias y hongos)
La investigación en este campo sigue constituyendo uno de los principales objetivos de la
industria farmacéutica.
La acción de los antibióticos sobre las bacterias se puede demostrar in vitro de diferentes
maneras. Un modo preciso de ellos es por el método de dilución en tubo. Existe también el
método del disco único de sensibilidad ideado por Kirby y Bauer.

7. 2 Competencias
- Aplica métodos para evaluar la actividad antimicrobiana in -vitro
- Obtiene la concentración mínima inhibitoria de antibióticos en estudio

7. 3 Materiales y equipos
- Frasco con 100 mL de caldo Mueller – Hinton
- Placas con agar Mueller – Hinton
- Escala de Mc Farland 0.5
- Cultivo de E.coli
- Cultivo de S.aureus
- Cultivo de Ps.aeruginosa
- Discos de antibióticos
- Hisopos estériles
- Pinzas estériles
- Tubos estériles de 16 x 150
- Pipetas estériles de 10 mL
- Pipetas estériles de 5 mL

7. 4 Procedimiento
1. Método de difusión en agar
Primer día
- Prepara una dilución de la bacteria en estudio equivalente a 0.5 de la escala de Mc
Farland (1.5 x 108 bacterias).
- Siembra una placa de agar Mueller – Hinton con un hisopo embebido en la dilución
anterior.
- Coloca los discos de los antibióticos con ayuda de las pinzas estériles a 2 cm del
borde de la placa y equidistantes entre si.
- Presiona suavemente cada disco para que se adhiera al agar.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
F-CV3-3B-2 17 REV. JUNIO 2007
 - Después de la incubación, observa los halos de inhibición alrededor de los discos
de antibióticos.
La sensibilidad del microorganismo a los antibióticos utilizados, se establece por
comparación en una gráfica de tamaños de la zona.
-
2. Método de dilución en tubo
Primer día
- Con una pipeta de 10 mL tomar el cultivo proporcionado y dejar caer una gota al
frasco que contiene 100 mL de caldo Mueller – Hinton.
- Mezcla y con la misma pipeta, repartirá el caldo en 10 tubos estériles, inoculando el
primer tubo con 9 mL y los restantes con 5 mL del caldo.
- Prepara una fila de diluciones del antibiótico de 100 mg a 4 ug; con la pipeta de 5
mL toma 1 mL de la solución de antibiótico e inocula el primer tubo.
- Mezcla y saca 5 mL para el segundo tubo y así sucesivamente hasta el noveno tubo.
- Del noveno tubo, saca 5 mL y elimina conjuntamente con la pipeta.
- El tubo Nº 10 no recibirá antibiótico y servirá como control del desarrollo
bacteriano.
- Incuba los tubos a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa la turbidez de los tubos comparándola con la del tubo control (Nº 9).
- Los tubos que no presentan turbidez se debe a que la bacteria fue inhibida en su
desarrollo.
- La menor concentración de antibiótico que inhibió el desarrollo bacteriano será la
MIC.

7.5 Resultados
1. Reporta los resultados obtenidos (diámetro de los halos) de los microorganismos
empleados frente al antibiótico analizado.
7.6 Cuestionario
- Se realizará a medida del desarrollo de la práctica
7.7 Fuentes de información

 Manual de Practicas de Microbiología General, AquiauhualtMa de los Angeles,

Universidad Autónoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.
pd
 Wiley, J., Sherwood, L, Woolverton, C. Prescott’s Microbiology. 10ma edición.
McGraw-Hill Education. 2017

F-CV3-3B-2 18 REV. JUNIO 2007

 PRIMER EXAMEN ESCRITO

F-CV3-3B-2 19 REV. JUNIO 2007

 PRACTICA Nº 8
PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS DE IMPORTANCIA
MÉDICA (I)

8. 1 Marco teórico

1. Estudio de los estafilococos

La patogenicidad de una especie de Estafilococo, se determina por producción de
hemolisina, fermentación del manitol y producción de las enzimas coagulasa y
desoxiribonucleasa.

2. Estudio de los estreptococos

Agrupados originalmente por su capacidad para producir lisis de los hematíes, así
tenemos los estreptococos alfa, beta y gama hemolíticos, según sea la lisis parcial, total
o nula.
Existen varias pruebas específicas para el estudio de estos microorganismos como son:
- Prueba de la bacitracina, que se usa para la diferenciación de un estreptococo Beta
hemolítico del Grupo A, de los Beta hemolíticos del Grupo No A.
- Prueba de la catalasa, para evidenciar la presencia de esta enzima sobre el peróxido
de hidrógeno.

8. 2 Competencias
- Ensaya los métodos de identificación diagnóstica in Vitro de especies
representativas del género Staphylococcus y Streptococcus.

8. 3 Material y métodos
- Placas con agar sangre
- Placas con agar manitol salado
- Placas con agar DNA
- Cultivo de : Staphylococcus aureus y S. epidermidis; Streptococcus viridans, S.
pyogenes, S. pneumoniae y S. agalactiae
- Reactivo de coagulasa
- Solución HCl 1N
- Solución de peróxido de hidrógeno al 3%

8. 4 Procedimiento
1. Estudio de los estafilococos
Coloración y morfología
- Efectúa frotices en láminas portaobjetos con cada una de las cepas.
- Después de fijarlas al calor, realiza coloraciones de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión y anota las características
morfológicas.

F-CV3-3B-2 20 REV. JUNIO 2007

 Inoculación en agar sangre
Primer día
- Toma una placa de agar sangre y lo di vide en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estafilococos: S.
aureus y S. epidermidis.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa el crecimiento en agar sangre.
-
Crecimiento en agar manitol salado
Primer día
- Toma una placa de agar manitol salado y dividelo en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con las mismas cepas del ejercicio anterior.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa el crecimiento en agar manitol salado y describe la morfología de las
colonias.
- Observa el viraje del color del indicador rojo de fenol, debido a la acidez
- .
Prueba de la coagulasa
Primer día
- Toma dos tubos que contienen 0.5 mL de plasma de conejo (reactivo de coagulasa).
- Inocula cada uno de ellos con 0.1 mL de cada una de las dos cepas de estafilococos.
- Incuba a 37ºC.
- Observa cada hora la aparición de coágulos, por espacio de 4 horas.
- De ser negativo el resultado, se deja incubando y se hace una lectura final a las 24
horas.
- Si aparece un coágulo, la bacteria posee la enzima coagulasa.
-
Acción de la DNAsa
Primer día
- Toma una placa de agar DNA y la divide en dos sectores.
- Inocula en una mitad con el cultivo de S. aureus y la otra mitad con S. epidermidis.
- En ambos casos, la siembra la realiza con un solo trazo lineal perpendicular a la
línea divisoria.
- Incuba a 37ºC por 24 horas
Segundo día
- Agrega a la superficie del agar 1 ml de HCl 1N y espera unos minutos.
- El HCl 1N precipita el DNA contenido en el medio de cultivo, enturbiándolo.
- Observa la presencia de la enzima DNAsa, por la aparición de un halo transparente
alrededor de la siembra, que indica la ausencia de DNA.
-
Prueba de la catalasa
- Toma una asada de cada cultivo de S. aureus y S. epidermidis y lo coloca sobre un
portaobjetos limpio.
- Añade 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
- Observa si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el
reactivo.

F-CV3-3B-2 21 REV. JUNIO 2007

 - Descarta la lámina en un recipiente con desinfectante.

2. Estudio de los estreptococos

Inoculación en agar sangre
Primer día
- Toma una placa de agar sangre y la divide en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estreptococos: S.
viridans (alfa hemolítico) y S. pyogenes (beta hemolítico).
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa las diferencias de hemólisis en agar sangre.

Prueba de la catalasa
- Toma una asada del cultivo de Streptococcus pyogenes y coloca sobre un
portaobjetos limpio.
- Añada 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
- Observa si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el
reactivo.
- Descarta la lámina en un recipiente con desinfectante.

8. 5 Resultados
Observa y reporta los resultados
8.6 Cuestionario
¿Qué factores condicionan la patogenicidad del S. aureus en comparación con otras
especies de estafilococos?
1. ¿Qué enfermedades produce el S. epidermidis y el S. saprophyticus?
2. Es recomendable en un paciente que presenta un cuadro de faringoamigdalistis, hacerse
un examen de secreción faríngea a fin de descartar la presencia de Streptococcus
pyogenes

8. 7 Fuentes de información
 Manual de Practicas de Microbiología General, AquiauhualtMa de los Angeles,
Universidad Autónoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_gen
eral.pd

F-CV3-3B-2 22 REV. JUNIO 2007

 PRACTICA Nº 9
PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS DE IMPORTANCIA
MÉDICA (II)

9. 1 Marco teórico
1. Grupo Clostridia
Son formadores de esporas, anaerobios estrictos, cuyas especies patógenas se
caracterizan por producir exotoxinas muy importantes. Entre las enzimas mas
importantes que producen son las proteolíticas.
Grupo Bacillus
El genero Bacillus, agrupa microorganismos aerobios y anaerobios facultativos, Gram
positivos, caracterizados por su capacidad de producir endoesporas y que pueden
sobrevivir en el ambiente por mucho tiempo.
9. 2 Competencias
- Manipula en el Laboratorio especies del género Bacillus .

9. 3 Materiales y equipos
- Cultivo de: Bacillus subtilis
- Tubos con gelatina
- Placas con agar sangre
- Tubos con caldo TSB
- Tubos con caldo thioglicolato
- Tubos con TSA
- Peróxido de hidrógeno
- Asas de siembra
- Incubadoras

9.4.- Procedimiento

9.4.1.- Grupo Bacillus

Coloración y morfología
- Prepara frotices del cultivo de Bacillus subtilis y colorea por la tinción de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión.
- Observa los bacilos dispuestos en cadenas largas con los extremos rectos. Las
esporas se localizan generalmente en la parte subterminal del bacilo y aparecen
como áreas no teñidas.
-
Inoculación en agar sangre
Primer día
- Siembra la cepa de B.subtilis en agar sangre por el método de dispersión –
agotamiento.
F-CV3-3B-2 23 REV. JUNIO 2007
 - Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- En el agar sangre, observa la beta – hemólisis producida por B.subtilis.

Inoculación en TSA
Primer día
- Siembra la cepa de B.subtilis en TSA por el método de dispersión – agotamiento.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa las características de la colonia, gris blanquecino, grande, extendido, de
bordes irregulares.

Hidrólisis de la gelatina
Primer día
- Siembra por el método de puntura en el tubo con gelatina.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Enfría el tubo y observa la hidrólisis de la gelatina.

Prueba de la catalasa
- Toma una asada del cultivo de B.subtilis y lo coloca sobre un portaobjetos limpio.
- Añade 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
- Observa si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el
reactivo.
- Descarta la lámina en un recipiente con desinfectante.

Movilidad
- Toma una asada del cultivo de B.subtilis y lo coloca sobre un portaobjeto limpio.
- Coloca una laminilla encima del portaobjetos y observa la movilidad del B.subtilis
utilizando el objetivo de 40x.

9 .5 Resultados
Esquematiza y reporta los resultados obtenidos en cuanto a su morfología microscópica y
las características de cada uno de los microorganismos trabajados en la práctica.

9. 6 Fuentes de información
 Manual de Practicas de Microbiología General, AquiauhualtMa de los Angeles,
Universidad Autónoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_gen
eral.pdf

F-CV3-3B-2 24 REV. JUNIO 2007

 PRACTICA Nº 10
PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS DE IMPORTANCIA
MÉDICA (III)

10.1.- Marco teórico

1. Grupo Enterobacterias
Las diferentes especies de enterobacterias se identifican por su actividad metabólica en
diferentes medios de cultivo que contienen carbohidratos, proteínas, aminoácidos, etc.
Estos microorganismos no producen citocromo – oxidasa, lo que las diferencia de las
Pseudomonas, Alcalígenes, Aeromonas y Vibrios.
2. Grupo Pseudomonas
Algunas especies son patógenas oportunistas para el hombre, siendo la mas importante
Pseudomonas aeruginosa por ser la especie mas frecuentemente asociada con
enfermedad humana. P.aeruginosa desarrolla fácilmente en los medios de cultivo, la
mayoría de las especies son identificadas en base a su olor característico, morfología
colonial, pigmentos y otros.
3. Grupo Vibrios
En el género Vibrio se describen dos grupos: un grupo comprende a Vibrio cholerae,
causante del cólera y los Vibrio no aglutinantes que pueden producir diarreas no
epidémicas. Otro grupo, lo conforman las especies halofilicas, que tienen afinidad por
el cloruro de sodio. Entre estos, V. parahaemoliticus, que puede producir enfermedades
similares al cólera pero sin ser tan severas.

10.2.- Competencias
Ensaya los métodos de identificación diagnóstica in Vitro en el laboratorio de especies
representativas: Escherichia coli, Salmonella, Shigella y Pseudomonas aeruginosa

10. 3 Materiales y métodos

Grupo Enterobacterias

- Placas con agar: Mc Conkey, SS, EMB.

- Tubos de Id. bioquímica: Urea, SIM y/o MIO, TSI, Citrato de Simmons, LIA
- Tubos con caldo: peptonado y/o TSB.
- Cultivo de: E.coli, Salmonella tiphy, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter
aerogenes, Proteus vulgaris
- Reactivos de: Kovac´s,
- Tiras de oxidasa
- Láminas porta y cubreobjetos
- Incubadoras
- Microscopio
- Aceite de inmersión
- Asas de siembra en aro, puntura.

Grupo Pseudomonas
- Placas con agar: Mc Conkey
F-CV3-3B-2 25 REV. JUNIO 2007
 - Tubos de identificación bioquímica: TSI, citrato de simons. Urea y LIA
- Tubos con: TSA
- Tubos con TSB y/o caldo peptonado
- Cultivo de Pseudomonas aeruginosa
- Set de coloración Gram
- Reactivo de oxidasa
- Asa de siembra en aro, puntura.

10. 4 Procedimiento
1. Grupo Enterobacterias
Movilidad
- Toma una asada de la cepa del cultivo proporcionado y lo coloca sobre un
portaobjetos limpio.
- Coloca una laminilla encima del portaobjetos y observa la movilidad del
microorganismo utilizando el objetivo de 40x.

Inoculación en agar Mc Conkey

Primer día
- Siembra la cepa proporcionada por el método de dispersión – agotamiento la placa
con agar Mc Conkey.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- La degradación de la lactosa a ácidos se manifiesta por el viraje de color a rojo del
indicador de pH rojo neutro; siendo estas colonias, lactosa – positivas.
- Las colonias que son lactosa – negativas son incoloras
-
Inoculación en agar EMB (Eosina – Azul de Metileno)
Primer día
- Siembra la cepa proporcionada por el método de dispersión –agotamiento en la
placa con agar EMB.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- En el medio EMB observa colonias negruzcas con brillo metálico verdoso, cuando
metabolizan la lactosa o sacarosa y translúcidas o de color ámbar si son lactosa –
negativas.
-
Inoculación en agar SS (Salmonella – Shigella)
Primer día
- Siembra la cepa proporcionada por el método de dispersión – agotamiento en la
placa con agar SS.
- Incubar a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- En el medio SS, la detección de coliformes se comprueba cuando hay degradación a
ácido mediante el indicador de pH rojo neutro y observará colonias negras, si las
bacterias producen sulfuro de hidrógeno.

Diferenciación metabólica del grupo de Enterobacterias

Primer día
F-CV3-3B-2 26 REV. JUNIO 2007
 - Con la cepa asignada, procede a inocular por los métodos de siembra adecuados,
los siguientes medios:
- Caldo TSB y/o peptonado
- Agar: Urea, TSI, SIM , Citrato, LIA
- Incuba a 37ºC por 24 horas
Segundo día
- El alumno anotará los resultados de este ejercicio y efectuará la identificación de la
cepa proporcionada. Comparará los resultados con la tabla proporcionada: Ver tabla:
10-1.
a) Agar Urea: la prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la
superficie o en todo el tubo y es negativa, si el medio permanece del color original.
Observe el resultado obtenido y compare con los resultados de los demás alumnos
de la clase.
b) Agar TSI: es indispensable que la lectura en el plazo establecido y observe:
- Producción de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
- Fermentación de la glucosa únicamente (rojo/amarillo).
- Fermentación doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo).
- No fermentación de carbohidratos (rojo/anaranjado).
- Producción de gas: formación de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.
c) Agar SIM (Azufre – Indol – Movilidad):
- Detecta la producción de hidrógeno sulfurado por medio de la observación de un
precipitado negro en el medio.
- Realiza la prueba de producción de indol.
- Observa la movilidad del microorganismo, y realiza un examen macroscópico del
medio por una zona de desarrollo difuso que parte de la línea de inoculación.

d) Caldo peptonado y/o TSB: después del período de incubación:

- Agrega en zona 4 gotas del reactivo de Kovac´s, en cada tubo que presenta
desarrollo bacteriano, luego agitar suavemente.
- La reacción es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona
superior del tubo, pocos segundos después de haber agregado el reactivo y es
negativa si no hay cambio alguno.

e) Agar Citrato:
- La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del
agar en 24 a 48 horas y negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.

f) Agar LIA (agar lisina hierro)

- Producción de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
- Metabolismo de la Lisina
- Producción de ácido en fondo a partir de la glucosa

Nota: para la lectura se recomienda hacer uso de las tablas de identificación

bioquímica que describen las reacciones de diagnóstico clave para identificar los
géneros de las bacterias entéricas

g) Reacción de la Citocromo Oxidasa

F-CV3-3B-2 27 REV. JUNIO 2007

 - Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento del tubo con la cepa
proporcionada, y transferir el inóculo a una tira del reactivo de oxidasa.
- Considerara la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloración azul violáceo
intensa en la tira, en un máximo de 5 segundos.

Grupo Pseudomonas
Coloración y morfología
- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por la tinción de
Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión.
-
Inoculación en TSA
Primer día
- Siembra la cepa de Pseudomonas aeruginosa en TSA por el método de dispersión –
agotamiento.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día Observa las características de la colonia y presencia de pigmentación
- .
Inoculación en agar TSI
Primer día
- Con el asa de siembra, inocula en el centro del tubo y estría la superficie del pico
de flauta.
- Rotula e incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
Realiza la lectura tal como se indica para las enterobacterias
.
Reacción de la Citocromo Oxidasa, proceder tal como se indica para las
enterobacterias
Cultivo a 42ºC
Primer día
- Siembra la cepa de P. aeruginosa en los tubos de TSB por la técnica de inoculación.
- Incuba a 42ºC por 24 horas
Segundo día
- Observa la presencia o no de crecimiento microbiano a 42 ºC, en los tubos

10 .5 Resultados
1. Esquematiza, registra y reporta los resultados obtenidos, identificando en cada caso la
especie.

10 .6 Cuestionario
Describa el fundamento de las pruebas realizadas

10. 7 Fuentes de información

F-CV3-3B-2 28 REV. JUNIO 2007

  Manual de Practicas de Microbiología General, AquiauhualtMa de los Angeles,
Universidad Autónoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_gen
eral.pdf

PRACTICA Nº 11

F-CV3-3B-2 29 REV. JUNIO 2007

 SEMINARIO DE INVESTIGACION DE VIRUS

PRACTICA Nº 12
F-CV3-3B-2 30 REV. JUNIO 2007
 MICOLOGIA

12.1 Marco teórico

Lo hongos normalmente se encuentra en la naturaleza como organismo saprofitos, algunas
especies son hongos producen micosis profunda, muchos de ellos son oportunistas.
Los hongos suelen dividirse en hongos filamentosos y levaduriformes, dentro de los
levaduriformes el género más conocido es la Cándida; de las cuales existen más 150
especies; de ellas solo 20 están asociadas a infecciones en humano, no hay que olvidar que
este microorganismo se encentra formando parte de la flora normal del hombre, por eso la
Cándida se comporta como un oportunista. Estos pueden producir bacteremias, ITU,
infecciones bronquiales, colonizan hasta los dispositivos médicos como: catéteres, tubos
endotraqueales, sondas Foley y otros.

12.2. Competencias
Ensaya los métodos in vitro para la identificación e investigación de especies de
importancia clínica.

12.3 Materiales y equipos

 Tubos con levaduras: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida glabrata
 Solución de koh al 10%
 Set de coloración de gram
 Placas con agar dextrosa saboraud
 Chromo agar candida
 Láminas de portaobjeto 3x 1 y laminillas 22x22
 Asas de siembra
 Microscopio
12.4.- Procedimiento
Examen directo con koh 10%
 En una lámina 3x1 colocar una gota de koh al 10%
 Con un asa de siembra estéril se coge una colonia de levaduras
 Se homogeneiza
 Se coloca una laminilla 22x22
 Observar al microscopio con objetivo 40x
 Buscar las levaduras
Coloración Gram
 Con un asa estéril coger una colonia de levaduras
 Fijar a mechero
 Agregar cristal violeta
 Lavar con agua
 Agregar lugol gram
 Lavar con agua
 Decolorar con alcohol acetona al 50%
 Lavar con agua
 Agregar safranina
 Lavar con agua

F-CV3-3B-2 31 REV. JUNIO 2007

  Secar y observar a 100x

Cultivo
 Tomar con un asa de siembra en aro
 Se esteriliza a un mechero de bunsen
 Se extrae una colonia
 Se coge la placa cromo agar cándida
 Sembrar por difusión y agotamiento
 Se incuba a 37°C por 24 horas
 observar y anotar los resultados
12.5.- Resultados
 Candida albicans: color verde esmeralda o verde claro
 Candida tropicalis: color azulverdoso o azul metalico
 Candida krucei: rosa claro a rosado
 Candida glabrata: mate o mate claro

12.6.- Cuestionario
1.- Factores de virulencia de la Cándida albicans
2.- Fundamento del crecimiento en cromo agar candida.

12.7.- Bibliografía
1.- Odds, F.C., and R. Bernaerts. 1994. CHROMagar Candida Medium, a new differential
isolation medium for presumptive identification of clinically important Candida species. J.
Clin. Microbiol. 32: 1923-1929.
2.- Pfaller, M.A., A. Huston, and S. Coffman. 1996. Application of CHROMagar Candida
Medium for rapid screening of clinical specimens for Candida albicans, Candida tropicalis,
Candida krusei, and Candida (Torulopsis) glabrata. J. Clin. Microbiol. 34: 56-61.

PRACTICA Nº 13
F-CV3-3B-2 32 REV. JUNIO 2007
 FAGOCITOSIS
SEMINARIO
13 .1 Marco teórico
La fagocitosis es la propiedad que tiene algunas células de englobar a las bacterias o
cualquier cuerpo extraño y tratar de destruirlas por acción de enzimas es un fenómeno no
específico y se incrementa cuando intervienen anticuerpos específicos contra bacterias u
otros antígenos
Entre las células fagocíticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrófagos:
monocitos libres y células fijas; células que pertenecen al sistema retículo endotelial (RES).
En la práctica se comprobarán los resultados de la prueba de fagocitosis in vivo, obtenidos
en ratones normales y en ratones inmunizados inoculados con glóbulos rojos de carnero
13. 2 Competencias
- Ensaya en el laboratorio el fenómeno de la fagocitosis

13. 3 Materiales y equipos

- Suspensión de glóbulos rojos de carnero al 2%.
- Ratones normales.
- Ratones inmunizados con glóbulos rojos de carnero.
- Colorante de Leishman
- Equipo de disección.
- Láminas portaobjetos.
- Torundas de algodón.

13. 4 Procedimiento
- Inocula 0,5 mL de suspensión de glóbulos rojos de carnero por vía intraperitoneal, a
cada uno de los ratones normales e inmunizados.
- Después de 30 minutos, sacrifica a los ratones por dislocación cervical.
- Previa desinfección con alcohol, abre la cavidad abdominal y realiza frotices del
líquido peritoneal utilizando las torundas de algodón.
- Seca al aire y colorea las láminas con Leishman.
- Observa la presencia de glóbulos rojos de carnero libres y la existencia de
macrófagos con glóbulos rojos englobados.

13. 5 Resultados
Reportar los resultados de las observaciones hechas en las láminas coloreadas y
comparar el promedio de los glóbulos rojos fagocitados por los macrófagos tanto de los
animales normales como de los fagocitados
13. 6 Cuestionario
I. ¿Cuáles son los mecanismos de defensa de la respuesta inmune inespecífica?
Explique.
II. ¿Qué es la respuesta inmune específica y de cuantos tipos puede ser ésta?. ¿Qué se
requiere para que se inicie la respuesta inmune celular?

F-CV3-3B-2 33 REV. JUNIO 2007

13.7 Bibliografía recomendada
 Manual de Practicas de Microbiología General, AquiauhualtMa de los Angeles,
Universidad Autónoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_gen
eral.pdf

F-CV3-3B-2 34 REV. JUNIO 2007

 PRACTICA Nº 14
PODER BACTERICIDA DEL SUERO
SEMINARIO
14. 1.- Marco teórico
El líquido obtenido de la sangre que se deja coagular se conoce como suero. Este
comprende varias moléculas, pero no células ni factores de coagulación, el suero de un
animal inmunizado de manera adecuada contiene sustancias neutralizantes especificas Se
caracterizan por ser termolábiles y no dializables.
Por capacidad de anteponerse a las toxinas bacterianas, se les denominó anticuerpos o
inmunoglobulinas. Desde hace 70 años se conoce un componente sérico con capacidad de
lisar eritrocitos,y destruir bacterias Gramnegativas. Actualmente se sabe que el
complemento es un grupo de proteínas séricas en concentraciones bajas en el suero normal
las cuales se “activan” para formar una cascada enzimática.

14.2 Competencias
- Demuestra in-vitro el poder bactericida del suero.

14. 3 Materiales y equipos

- Muestra de sangre de un paciente con hemocultivo positivo, para la obtención del
suero.
- Tubos de prueba
- Suspensiones bacterianas de: Salmonella typhi y Satphylococcus aureus.
- Escala de Mc Farland
- Solución salina estéril.
- Agar Mueller Hinton
- Placas Petri estériles.

14. 4 Procedimiento
- Obtiene una muestra de sangre procedente de un paciente con hemocultivo positivo,
luego separa el suero asépticamente y lo almacena a –20º C.
- Coloca 0,5 ml de suero en cuatro tubos (luego de descongelarlo y homogenizarlo).
- Rotula los tubos con los números 1, 1’, 2 y 2’.
- Los tubos 1 y 1’ deben permanecer tal cual y los tubos 2 y 2’, deben ser sometido a
calor (56º C por 30’)
- Trabaja paralelamente un blanco (0,5 mL de solución salina).
- Prepara las suspensiones bacterianas de los microoganismos de estudio, a una
concentración similar al tubo 0,5 de la escala de Mc Farland.
- Mezcla el contenido de cada uno de los tubos 1, 1’, 2, 2’ y blanco (cada uno contiene
un volumen de 0,5 mL) con 0,5 mL de las suspensiones bacterianas preparadas.
- Incuba los tubos conteniendo las mezclas, a 37º C por 1 hora.
- Siembra por duplicado, por el método de incorporación.

14 .5 Resultados
Observa, reporta y explica acerca del crecimiento microbiano en cada placa

14.6 Cuestionario

F-CV3-3B-2 35 REV. JUNIO 2007

1.- ¿Cuáles son los mecanismos de defensa de la respuesta inmune inespecífica? Explique.
2.- ¿Qué es la respuesta inmune específica y de cuantos tipos puede ser ésta?. ¿Qué se
requiere para que se inicie la respuesta inmune celular?
14.7.- Fuentes de información
 Manual de Practicas de Microbiología General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_gen
eral.pdf

F-CV3-3B-2 36 REV. JUNIO 2007