Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales

Universidad Nacional de Misiones

TRABAJO PRÁCTICO nro. 4:

SUSTANCIAS NITROGENADAS

Dra. Ana Eugenia Thea

Cátedra Bromatología y Nutrición
BIOQUÍMICA y FARMACIA

Cátedra Bromatología
LIC. en ANÁLISIS QUÍMICOS Y BROMATOLÓGICOS

2018
 1. Proteínas, péptidos y aminoácidos.

Nitrógeno 2. Compuestos básicos volátiles: amoníaco, sales de amonio, aminas.

en los alimentos 3. Compuestos básicos fijos (especialmente en las carnes): urea,

creatina, creatinina, purinas, hipoxantinas, etc.
4. Nitrógeno inorgánico: nitratos y nitritos

ESTUDIO DE LAS SUSTANCIAS NITROGENADAS EN LOS ALIMENTOS

 Determinar valor nutritivo de alimentos→ (INFORMACIÓN NUTRICIONAL - 1 g proteínas = 4 kcal/cal*)

 Evaluar grados de actividad proteolítica→

 Controlar la genuinidad de productos → Leche mín. 2,9 g/100g

aa libres en jugos de fruta

 Evaluar el grado de contaminación microbiana →

 Verificar el cumplimiento de normas toxicológicas→ Nitritos y nitratos

 Grado de impurificación de efluentes → Presencia de Nitrógeno en agua residuales →EUTROFIZACIÓN

* kcal=cal uso coloquial aceptado
INFORMACIÓN

NUTRICIONAL
DETERMINACIÓN DEL NITRÓGENO TOTAL
1) Método de Dumas
COMBUSTIÓN COMPLETA
(CuO – 800-1000 °C)
CxHyNz (g/l) + O2(g) xCO2 (g) + yH2O (g) + zNO2 (g) Reducción a N2
ALIMENTO
(Nitrógeno orgánico e
inorgánico) Detector de conductividad
térmica (λ)
RÁPIDO, SENCILLO, EXACTO

2) Método de Kjeldahl

 MÉTODO DE REFERENCIA PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN ALIMENTOS

(ISO, AOAC, Farmacopeas, Códigos)

 NITRÓGENO ORGÁNICO TOTAL DE LA MUESTRA → Factor de corrección→

PROTEÍNAS
 MÉTODO DE KJELDAHL
1. ETAPA DE DIGESTIÓN 2. ETAPAS NEUTRALIZACIÓN
y DESTILACIÓN

3. ETAPA DE TITULACIÓN
 MÉTODO DE KJELDAHL
1. Digestión
𝐜𝐚𝐭𝐚𝐥𝐢𝐳𝐚𝐝𝐨𝐫𝐞𝐬
𝐏𝐫𝐨𝐭𝐞𝐢𝐧𝐚𝐬 𝐲 𝐬𝐮𝐬𝐭𝐚𝐧𝐜𝐢𝐚𝐬 𝐧𝐢𝐭𝐫𝐨𝐠𝐞𝐧𝐚𝐝𝐚𝐬 + 𝐇𝟐 𝐒𝐎𝟒 → (𝐍𝐇𝟒 ) 𝐒𝐎𝟒
𝐜𝐚𝐥𝐨𝐫 𝟐

2. Neutralización
(𝐍𝐇𝟒 )𝟐 𝐒𝐎𝟒 + 𝟐 𝐍𝐚𝐎𝐇 → 𝐍𝐚𝟐𝐒𝐎𝟒 + 𝟐𝐍𝐇𝟑 + 𝟐𝑯𝟐 𝑶

3. Destilación
Ácido débil Ácido fuerte

𝐇𝟑 𝐁𝐎𝟑 á𝐜𝐢𝐝𝐨 + 𝐍𝐇𝟑 → 𝐍𝐇𝟒 𝐇𝟐𝐁𝐎𝟑 (𝐚𝐥𝐜𝐚𝐥𝐢𝐧𝐨) 𝐇𝐀𝐞𝐧 𝐞𝐱𝐜𝐞𝐬𝐨 (á𝐜𝐢𝐝𝐨) + 𝐍𝐇𝟑 → 𝐍𝐇𝟒 𝐀 + 𝐇𝐀𝐫𝐞𝐦𝐚𝐧𝐞𝐧𝐭𝐞

4. Titulación

𝐍𝐇𝟒 𝐇𝟐𝐁𝐎𝟑 + 𝐇𝟐 𝐒𝐎𝟒 → (𝐍𝐇𝟒 )𝟐 𝐒𝐎𝟒 + 𝐇𝟑 𝐁𝐎𝟑 𝐇 +𝐀−𝐫𝐞𝐦𝐚𝐧𝐞𝐧𝐭𝐞 + 𝐍𝐚+𝐎𝐇− → 𝐍𝐚𝐀 + 𝐇𝟐 𝐎

(alcalino) (ácido)

𝐍𝐇𝟒 𝐇𝟐 𝐁𝐎𝟑 + 𝐇𝐂𝐥 → 𝐍𝐇𝟒 𝐂𝐥 + 𝐇𝟑 𝐁𝐎𝟑

 MÉTODO DE KJELDAHL
1. Etapa de digestión 𝐏𝐫𝐨𝐭𝐞𝐢𝐧𝐚𝐬 𝐲 𝐬𝐮𝐬𝐭𝐚𝐧𝐜𝐢𝐚𝐬 𝐧𝐢𝐭𝐫𝐨𝐠𝐞𝐧𝐚𝐝𝐚𝐬 + 𝐇𝟐 𝐒𝐎𝟒
𝐜𝐚𝐭𝐚𝐥𝐢𝐳𝐚𝐝𝐨𝐫𝐞𝐬
𝐜𝐚𝐥𝐨𝐫
→ (𝐍𝐇𝟒 ) 𝐒𝐎𝟒
𝟐

Equipo
microKjeldahl

Digestor macroKjeldahl

Muestra 3-5 horas

H2SO4 conc
Catalizador

390 °C
 MÉTODO DE KJELDAHL
2. Etapa de neutralización 3. Etapa de destilación
(𝐍𝐇𝟒 )𝟐 𝐒𝐎𝟒 + 𝟐 𝐍𝐚𝐎𝐇 → 𝐍𝐚𝟐𝐒𝐎𝟒 + 𝟐𝐍𝐇𝟑 + 𝟐𝑯𝟐 𝑶
𝐇𝟑 𝐁𝐎𝟑 á𝐜𝐢𝐝𝐨 + 𝐍𝐇𝟑 → 𝐍𝐇𝟒 𝐇𝟐𝐁𝐎𝟑 (𝐚𝐥𝐜𝐚𝐥𝐢𝐧𝐨)

NH3 𝐇𝐀𝐞𝐧 𝐞𝐱𝐜𝐞𝐬𝐨 (á𝐜𝐢𝐝𝐨) + 𝐍𝐇𝟑 → 𝐍𝐇𝟒 𝐀 + 𝐇𝐀𝐫𝐞𝐦𝐚𝐧𝐞𝐧𝐭𝐞

NaOH 40 % NH3

~ 150-200 mL

1. H3BO3
2. HCl o H2SO4 0,1 N
 MÉTODO DE KJELDAHL
4. Etapa de titulación 5. Cálculos y expresión
de los resultados
𝑽𝒎 − 𝑽𝒃𝒓 . 𝑵. 𝒇. 𝟎, 𝟎𝟏𝟒. 𝟏𝟎𝟎
1. 𝒈 % 𝒅𝒆 𝑵 =
𝒎
1. HCl o H2SO4
(sal de amonio alcalina)
𝑽𝒂 . 𝑵𝒂 . 𝒇𝒂 − 𝑽𝒎 −𝑽𝒃𝒓 . 𝑵𝒃 . 𝒇𝒃 ]. 𝟎, 𝟎𝟏𝟒. 𝟏𝟎𝟎
2. NaOH 0,1 N 2. 𝒈% 𝒅𝒆 𝑵 = 𝒎
(ácido remanente)

g % PROTEÍNAS = g % N * F
ALIMENTO FACTOR DE CONVERSIÓN
Carne y derivados 6,25
Huevo 6,68
Productos lácteos 6,38
Soja 5,71
Trigo, centeno y cebada 5,83
Maíz 6,25
Arroz 5,93
Semillas oleaginosas 5,30
1. H3BO3 Almendras 5,18
2. HCl o H2SO4 0,1 N Maníes 5,46
Gelatina 5,55
 KJELDAHL vs. DUMAS
Ventajas del método de Kjeldahl Ventaja del método de Dumas

 Apropiado para varios tipos de  Rápido, sencillo y económico

productos.
 Muestra equivalencias satisfactorias al
 Alta fiabilidad. compararlo con el método de Kjeldahl en
análisis de forrajes y alimentos infantiles,
 Usado como método de referencia. aunque con valores levemente mayores.

 No dosa nitritos ni nitratos. Desventajas del método de Dumas

Desventajas del método de Kjeldahl ꓫ Incluye nitrógeno inorgánico.

ꓫ Interfieren compuestos nitrogenados no ꓫ Requiere pequeñas cantidades de muestra 5-

proteicos. 50 mg, finamente dividida y homogénea para
minimizar el error de muestreo.
ꓫ Uso de catalizadores tóxicos o caros.
ꓫ Este método no puede aplicarse a material
húmedo por lo que debe efectuarse un
ꓫ Elección del factor de conversión.
secado previo.
 80 % DE LAS
PROTEÍNAS DE
LA LECHE

100g caseínas → 15,76 g de NITRÓGENO

15,76 g N 100 g proteínas

XgN Y g proteínas

𝟏𝟎𝟎 𝒈 𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂𝒔 FACTOR

Y g proteínas = X g N .
𝟏𝟓,𝟔𝟕 𝒈 𝑵 6,38
DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS TOTALES
1) Método de Sörensen (índice de formol – número de formol)
• Muestras en estado líquido (jugos, mostos, extractos)
• Evaluación de aa libres, por ejemplo en jugos de frutas → GENUINIDAD
• Evaluación de los mostos antes de la vendimia → REQUIERE NUTRICIÓN???
• Grado de hidrólisis de una proteína → CONTROL DE HIDROLIZADOS
Bloqueo (grupo

VALORACIÓN ACIDEZ
metilenoimino) 3. NaOH 0,1 N

formol

Ácido carboxílico libre

1. MUESTRA NEUTRALIZADA CON
NaOH
(con fenolftaleína hasta color rosado)
+
2. FORMOL NEUTRALIZADO
DETERMINACIÓN DEL NITRÓGENO BÁSICO VOLÁTIL (NBV)
1. Evaluación del ESTADO HIGIÉNICO SANITARIO de alimentos ricos en proteínas.
microorganimos
PROTEÍNAS, PÉPTIDOS, aa NH3 + aminas (mono, di y trimetilaminas)

2. Los ácidos volátiles y los aminoácidos libres no

interfieren porque quedan retenidos en el medio
alcalino.

3. La determinación es rápida y sencilla, aunque para

confirmar la ausencia de gérmenes patógenos se
necesita un ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.

4. El CAA fija un máximo de 30 mg de NBV por

100 g de producto para las carnes y pescados aptos
para el consumo.
DETERMINACIÓN DEL NITRÓGENO BÁSICO VOLÁTIL (NBV)

INDICAN DETERIORO
AVANZADO
DETERMINACIÓN DEL NITRÓGENO BÁSICO VOLÁTIL (NBV)
1. Balón de destilación 2. Destilación del NH3 y
1. MUESTRA aminas básicas volátiles por
2. MgO arrastre de vapor
3. Agua Recojo con
El medio ligeramente básico: a) H3BO3
a) Inhibe la hidrólisis de proteínas
b) Inhibe la formación de bases b) HCl o H2SO4
volátiles a partir de los aa

𝟏) 𝑁𝐻4+ + 𝑂𝐻− → 𝐻2 𝑂 + 𝑁𝐻3 ↑

𝟐) (𝐶𝐻3 )2 𝑁𝐻2+ + 𝑂𝐻− → 𝐻2 𝑂 + (𝐶𝐻3 )2 𝑁𝐻 ↑ 3. Titulación:
𝟑) (𝐶𝐻3 )3 𝑁𝐻+ + 𝑂𝐻 − → 𝐻2 𝑂 + (𝐶𝐻3 )3 𝑁 ↑ a) HCl o H2SO4
b) NaOH
Bases de NH3 di y trietilamina
DETERMINACIÓN DE NITRATOS Y NITRITOS
MUESTRA (5g)
+
Existen límites máximos AGUA (20 mL)
Disgrego, homogenizo
permitidos de estos Disuelvo sales en el agua
aditivos en diferentes
productos., en especial
chacinados.

Reacción de Griess Ilosva (nitratos)

Ppm=mg/L → CÁLCULOS