UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS

LIC. EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
Biología Molecular
Dra. Eliakym Arámbula Meraz

Presentación:
PCR

Integrantes:
Arteaga Molina Britania Guadalupe
Lucero Meza Lizbeth Guadalupe
Medina Valdez Nancy Daniela
Zazueta Gastélum Dalia Paulina
No cabe ninguna duda de que la técnica más revolucionaria de los últimos
15 años ha sido la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado
nuevas alas a la propia Ingeniería genética y a toda la biología molecular.
Fue inventada por Kary Mullis (bioquímico estadounidense) a mediados de
los años 80.

Kary Mullis
La PCR ha venido a cambiar el panorama, ya
que permite en principio producir in vitro
grandes cantidades de una secuencia de
ADN concreta sin recurrir a la clonación en
un organismo huésped.

"Es una técnica que consigue encontrar la aguja en el pajar, al

tiempo que produce un pajar de agujas por amplificación
selectiva".
 Extracción de Ácidos nucleicos
• Procesamiento de la muestra
• Extracción de los ácidos nucleicos
• Precipitación de los ácidos nucleicos

Preparación de la
¨Master¨ de PCR Comprobación

Metodología • Primers de la extracción

• Taq Polimerasa I
básica • dNTPs
• Tampón de
ADN diana
amplificación
Amplificación de los ácidos nucleicos extraídos
por PCR
• Desnaturalización
Amplificación génica: aumento en • Acoplamiento
el número de copias de un • Polimerización
fragmento de ADN particular.
Detección e interpretación
Clonación: es el proceso de hacer • Análisis electroforético por comparación
múltiples copias idénticas de un con patrones moleculares conocidos
fragmento particular de ADN. • Análisis secundarios de restricción,
hibridación, etc.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR)
La técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que consiste en la
amplificación in vitro de un fragmento de ADN específico.
Básicamente, se trata de replicar una y otra vez un mismo
fragmento de ADN (secuencia blanco) y, para ello, debemos
realizar in vitro lo que hacen las células in vivo para replicar su
ADN.

Se puede amplificar directamente de:

● ADN genómico
● ADNc (RT-PCR)
PCR convencional (en punto final)
Todos los elementos interactúan en tres etapas principales de los que se
compone la PCR:

*Desnaturalización

* Hibridación (Alineación)

*Extensión (Elongación)
Elementos necesarios para una PCR.
El tramo destinado a la amplificación puede tener desde veinte hasta más de dos mil
nucleótidos de longitud.

Amortiguador (Buffer): Mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN

polimerasa. (50 mM KCl, 10mM Tris (trisaminometano)-Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM
MgCl2.)

Iones divalentes y monovalentes: Los iones como el Mg++ , Cl ++ , Mn++ actúan como
cofactores (permite que la enzima Tap polimerasa se active y actúe ) así también como el
ion monovalente K+

Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP’s): dATP, dGTP, dCTP, dTTP, sustratos para

polimerizar nuevo ADN.
Dos cebadores, iniciadores, primers (Forward y reverse): Son secuencias cortas de
ADN, estos señalan el sitio donde debe actuar la Taq polimerasa para comenzar la
replicación, son altamente específicos y por ellos se logra la duplicación del fragmento
deseado.

DNA molde: Es la muestra que contiene la región molde que se quiere amplificar

Termociclador: Permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para la amplificación

de diversas hebras de ADN en la técnica de la PCR.
 Taq Polimerasa
● actividad polimerasa 5’ -> 3’

● Tiene una velocidad de 1Kb por minuto

● Tiene una tasa de error más elevada que otra Thermus aquaticus o Thermophilus aquaticus,
es un bacilo

● Las polimerasas de uso científico han sido modificadas para eliminarles su actividad
3’ -> 5’ exonucleasa que elimina las bases de la cadena que acaba de hacer.

● Aunque la polimerasa fuera aislada de T. Aquaticus, la que se emplea en los

laboratorios proviene de bacterias E. coli a las que se les ha insertado el gen de la
Taq polimerasa.
Master Mix
 Microcentrifugadora : Aparato que Agua inyectable o agua estéril:
tiene la función de rotar muestras de Sirve para completar el volumen final de la
laboratorio almacenadas en tubos de PCR. muestra.
(No es indispensable).

Vortex: Es un dispositivo simple que se Micropipetas y puntillas

usa comúnmente en los laboratorios para
agitar pequeños tubos o frascos de
líquido.
 Cada ciclo de una PCR consta de tres etapas:
1. Desnaturalización: En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una
temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos; también depende de la velocidad en la que el
termociclador aumenta la temperatura, esto varía de acuerdo al modelo del equipo. Al final
de esta etapa tendremos las cadenas separadas que servirán como templado para el
siguiente paso.
 Reward

35 pb del
inicio de la
secuencia Forward
35 pb después
de la región
que codifica

2.Hibridación:En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3’ del templado previamente
separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo
templado-primers, es importante que la temperatura de hibridación o temperatura melting
(Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es
el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será
eficiente.
3. Elongación (o replicación): En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo
templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega
dNTP’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La extensión de las
cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura óptima
para la reacción es de 72 °C.
Tap

❖ La elongación tiene un tiempo variable, siendo aconsejable un minuto por kilobase

Tras este paso lo más frecuente es volver al primer paso de 98ºC durante 10
segundos y repetir el ciclo entre 30 y 45 veces.
Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo. La repetición de este ciclo
unas 40 veces, permite obtener, como resultado de un experimento de
amplificación, millones de copias del fragmento de interés.
¿Cómo se analiza el producto de
amplificación?
Al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió eficientemente , los
ampliaciones son visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa
PCR en tiempo real
Es una técnica que combina la amplificación y la detección en
un mismo paso, al correlacionar el producto de la PCR de
cada uno de los ciclos con una señal de intensidad de
florescencia.

Para la amplificación de PCR en tiempo real además de los

reactivos que se emplean en la PCR de punto final, es
necesario emplear flouróforo.

Se necesita un termociclador, una unidad de captar señales

fluorescentes (flourómetro) para monitorear el progreso de la
reacción de amplificación. Un hardware y un software para la
captura y el análisis de los datos respectivamente.

Los flouroforos utilizados para seguir la amplificación del

ADN durante la PCR en tiempo real pueden ser de dos tipos:

a)Flouroforos con afinidad del ADN. b)sondas especificas

para fragmentos de ADN, es decir, que solo emiten
fluorescencia cuando se ha amplificado un fragmento del
PCR en
tiempo real
 Tipos de PCR
RT-PCR: amplificación de RNA: PCR in situ: La PCR in situ consiste en una
Es una variante de la PCR en la que usamos reacción de PCR en secciones histológicas o
ARN como molde inicial en vez de ADN, y células, donde los productos generados pueden
emplea una transcriptasa inversa para
realizar la síntesis de un ADN visualizarse en el sitio de amplificación.
complementario al ARN (ADNc).

*PCR con “Comienzo en caliente” Lo que varia en estos

*PCR ”larga” tipos de PCR es la
*PCR “anidada” temperatura con la que
se trabaja.
PCR Múltiplex: PCR en la cual se amplifica
más de una secuencia en una misma reacción.
Emplea dos o más pares de cebadores en un
único tubo con el fin de amplificar
simultáneamente múltiples segmentos de ADN.
PCR asimétrica: se trata de generar copias
monocatenarias de un DNA. En la variante más
simple, se añaden cantidades muy diferentes de
ambos cebadores, de modo que tras los primeros
ciclos de PCR uno de ellos se agota y, disponibles
ya suficientes copias del DNA diana.

El múltiplex 40 longitudes diferentes

de fragmentos de ADN específicos
del objetivo

PCR con adaptadores: Puede amplificarse una región de

ADN de secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de
restricción unos adaptadores oligonucleótidos sintéticos con
extremos cohesivos compatibles con los generados en la
muestra
Ventajas:
Ventajas y desventajas
● A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad
considerable para el estudio que se vaya a realizar.

● El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis.

● Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.

● Sus aplicaciones son multiples: medicina forense, diagnosticos, analisis

prenatales, ect.

Desventajas:

● Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce

por lo menos una mínima secuencia de 20-40 pb.

● Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al

fragmento que se desea sintetizar.

● La polimerizacion puede tener errores al sintetizr el ADN.

● Puede contaminarse con otro ADN (Puede ser del mismo investigador o de
cualquier otro).
Las aplicaciones de la PCR y de sus
numerosas variantes son prácticamente
ilimitadas:
• Simplifica muchos experimentos de I.G
• Permite Muchos estudios de expresión genética
• Secuenciación directa de secuencias amplificadas
• Detección de mutaciones
• Diagnósticos de enfermedades genéticas e infecciosas
• En ciencia forense:
identificación de restos biológicos, determinación de
paternidad, pruebas periciales en criminalística
• En arqueología y paleontología
PRACTICA DE LABORATORIO

1. Determinación de las cantidades 2.Toma de los diferentes compuestos con

de los componentes requeridos para ayuda de micropipetas de diferentes
la preparación del Master Mix. volúmenes, dependiendo del reactivo en
cuestión. Se añade a un tubo eppendorf
(tubo de PCR)
 Resultado de los 24 µM de Master Mix.

Se agrego la menor cantidad de sustancia

que fue de 0.8 µM, la cual fue Taq polimerasa

A la mezcla de 24 µM se le añade 1µM de
ADN con el gen de interés.
Aquí se encuentran las muestras
procedentes de cada equipo para
introducirlas al termociclador el cual
llevara acabo el proceso de cambio de
temperatura.
Las muestras se acomodan en el termociclador,
de una manera ordenada para así poder
diferenciar las muestras (cabe mencionar que es
sugerible tomar una fotografía al orden en el que
se acomodaron las muestras, ya que se corre el
riesgo de olvidar el orden).
*Programar el termociclador a las
condiciones requerida para la
realización de la PCR con las que
se amplificara el segmento de ADN
*Se corre el termociclador
*Retiramos el tubo de PCR una vez terminados los ciclos en el termociclador

*Por ultimo ya que tenemos los resultados de PCR Punto final, procederemos
a ver el producto amplificado en una electroforesis(gel de agarosa).