INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE

BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES

Práctica 3
Efecto de pH y temperatura en la actividad enzimática de la invertasa

PROFESORES:
Dra. Oliver Salvador María Del Carmen
Dr. Linares Fernández Luis Carlos
M en C. Villalobos Escobedo Flor Selene

EQUIPO: 2

GRUPO: 5BV1

INTEGRANTES:
 Calixto Canseco Luis Fernando
 Campos Ramirez Eduardo
 Aguilar Pintor Hector Abraham
 Martiñon Hinojosa Roberto Tadeo
 Cortés López Marcos Emmanuel

FECHA DE ENTREGA: 26/09/18

ÍNDICE

Introducción……………………………………………………………………………3
Objetivo general.. ……………………………………………………………………..4
Objetivos particulares…………………………………………………………………4
Metodología……………………………………………………………………………5
Resultados……………………………………….…………………………………….6
Análisis o discusión……………………………………………………………………10
Conclusiones……………………………………………………………………………11
Referencias……………………………………………………………………………11
INTRODUCCIÓN

INVERTASA
Las enzimas que catalizan la hidrolisis de sacarosa en glucosa y fructosa se
conocen como invertasas o frutohidrolasas y su actividad al igual que las demás
enzimas se ve afectada por la concentración de sustrato, pH, temperatura o
presencia de iones metalitos, entre otros.

La producción de invertasa ha sido reportada en Saccharomyces cerevisiae,

Candida utilis, Xanthophyllomyces y hongos filamentosos del género Aspergillus,
Aureobasididum y Penicillium. Industrialmente, S. cerevisiae es el microorganismo
de elección para la obtención de la enzima debido a su alta capacidad de
fermentación de sacarosa y por ser una cepa hiperproductora de invertasa (F.
Veana, 2017).
La actividad óptima de las invertasas generalmente se encuentra en un pH entre
4,6 y 5,0 y una temperatura entre 35°C y 50°C (M. Ferreira, et al. 2017).

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá
un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica
y es llamado pH óptimo.
La relación entre el pH y la actividad enzimatica depende del comportamiento ácido-
base del enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima (centro activo) pueden
contener grupos funcionales ácidos y básicos, siendo su grado de disociación
dependiente del pH, lo que determinará, entre otros aspectos, la conformación de
la proteína, la capacidad de unión del sustrato al centro activo del enzima (K m) y la
capacidad de transformación del sustrato (kcat). Los estudios cinéticos a diferentes
valores de pH nos proporcionan información sobre el mecanismo catalítico de los
enzimas y la naturaleza de los aminoácidos más directamente implicados en la
catálisis (Tena Manuel, et al.).
La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH y las
desviaciones por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente
su actividad o incluso pueden provocar la desnaturalización de la proteína.

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por
cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones
catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a
partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La
temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima.
Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a
la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debido a la
desnaturalización de las proteinas y por lo tanto su inactivacion.

OBJETIVO GENERAL
Analizar el efecto de los parámetros fisicoquímicos: pH y temperatura sobre la
actividad catalítica de una enzima.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Evaluar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
 Evaluar el efecto del pH en la actividad enzimática.
 Determinar el pH con mayor actividad catalítica en la invertasa
 Determinar la temperatura optima de la invertasa
METODOLOGÍA
Determinación del pH óptimo para la invertasa
Se prepararon microtubos para DNS
• (X48 + 8 blancos) 0.1 mL DNS
• Blanco: DNS + Sol. sacarosa (0.1 mL c/u)

Se preparon 24 tubos de reacción

• pH: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 (x3)
• con 0.95 mL sol. sacarosa

Con condiciones constantes

• Temperatura
• Concentracion

Se virtió 0.1 mL de muestra o solucion

problema

Se adicionó 0.05 mL de [E]

• A los tubos de reaccion

Se tomo muestra 0.1 mL (x2)

• Al minuto de iniciar la reaccion

Se continuo con el protocolo de:

• Azucares reductores

Se realizo análisis de los datos obtenidos

• Gráficas
• Ecuaciones
• Actividad de la enzima
Determinación de la temperatura óptima para la invertasa
Se prepararon microtubos para DNS
• (X30 + 5 blancos) 0.1 mL DNS
• Blanco: DNS + Sol. sacarosa (0.1 mL c/u)

Se preparon 12 tubos de reacción

• Temperaturas: Ambiente, 40, 55, 70 y 85 °C
(x3)
• con 0.95 mL sol. sacarosa

Con condiciones constantes

• pH = 5
• Concentracion de sustrato 3%

Se virtió 0.1 mL de muestra o solucion

problema

Se adicionó 0.05 mL de [E]

• A los tubos de reaccion

Se tomo muestra 0.1 mL (x1)

• Al minuto de iniciar la reaccion

Se continuo con el protocolo de:

• Azucares reductores

Se realizo análisis de los datos obtenidos

• Gráficas
• Ecuaciones
• Actividad de la enzima

RESULTADOS Y ANÁLISIS
A) Efecto del pH en la actividad enzimatica.
Los datos obtenidos de la práctica en la que determinamos el efecto del pH en la
enzima invertasa, fueron tratados para calcular concentraciones en cada pH a partir
de las absorbancias leídas en los diferentes tiempos de la reacción enzimatica,
utilizando el método de DNS y la curva tipo para obtener las concentraciones,
expresadas en la tabla 1.
Tabla 1. Concentración de azucares en cada pH, expresadas en g/L.
Graficando el contenido de la Tabla 1. Se observa en la figura 1. el aumento de la
concentración de azúcares reductores, en función del tiempo, y el pH al que la
invertasa convierte más cantidad de sustrato en producto.
Figura 1.

A partir de la figura 1. Se realizaron regresiones lineales para cada curva, las cuales
expresamos en la tabla 2. Y con las cuales calculamos la actividad enzimatica de la
invertasa, en cada pH.
Tabla 2. Ecuaciones de las líneas de tendencia para cada pH.

Graficando el cambio de la actividad enzimatica en función del pH mostrado en la

figura 2. Logramos observar el efecto del pH en la actividad enzimatica,
Figura 2.
A partir de la figura 2, afirmamos que en el pH 3 es en el cual logró una mayor
actividad enzimatica la invertasa, además nos muestra que a partir de un pH 7 ya
no presenta actividad enzimatica, teóricamente se logra el punto óptimo en un pH
entre 4 y 6, de acuerdo a los resultados de esta práctica, establecemos que se
puede trabajar con buenos resultados de actividad enzimatica de la invertasa, en un
intervalo entre 3 y 6 siendo pH 3 el óptimo.

Partiendo de los resultados, utilizamos el pH óptimo obtenido, para calcular a

actividad específica y UI expresando ambos resultados en la tabla 3.
Tabla 3.

B) Efecto de la temperatura en la actividad enzimatica.

Los datos obtenidos de la práctica en la que determinamos el efecto de la
temperatura en la enzima invertasa, fueron tratados para calcular concentraciones
en cada temperatura a partir de las absorbancias leídas en los diferentes tiempos
de la reacción enzimatica, utilizando el método de DNS y la curva tipo para obtener
las concentraciones, expresadas en la tabla 4.
Tabla 4.
En la figura 3 podemos observar el cambio de la concentracion respecto al tiempo
que se presento en cada temperatura.
Figura 3.

EFECTO DE TEMPERATURA
22 ºC 40 ºC 55 ºC 70 ºC 85 ºC

4
CONCENTRACION G/L

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
-1
TIEMPO MINUTOS

Partiendo de la figura 3, se realizaron regresiones lineales para obtener la ecuacion

de la recta tendencia de cada curva, con la cual obtenemos la actividad enzimatica
en cada temperatura presentadas en la tabla 5.
Tabla 5.

Graficando la actividad enzimatica previamente calculada, presentando la figura 4,

se puede afirmar en base a los resultados, que la invertasa tiene mayor actividad
enzimatica en una temperatura de 55ºC, la cual es la optima tanto teoricamente
como en el experimento realizado en laboratorio, y ademas se obtuvo que no es
recomendable realizar la reaccion a temperaturas mas altas a 70ºC debido a que
presenta muy baja o nula actividad enzimatica, por una posible desnaturalizacion
de la enzima por altas temperaturas.
Figura 4.

Utilizando el punto optimo en el que la invertasa presenta mayor actividad

enzimatica, realizamos los calculos tanto de la Actividad especifica, como de UI,
ambos calculos presentados en la memoria de calculo.
Tabla6.

MEMORIA DE CÁLCULO
A) Efecto del pH
 B) Efecto de la temperatura

CONCLUSIONES
 El pH optimo en el cual la invertasa presenta mayor actividad enzimatica es
ph 3.
 La temperatura optima en la que la invertasa presenta mayor activivdad
enzimatica es de 55ºC.
 A altas temperaturas existe una desnaturalizacion de la enzima, por lo cual
no hay actividad enzimatica.
 La invertasa presenta actividad enzimatica solo en un rango de pH de 3 a 7.

REFERENCIAS
Manuel Tena Aldave, Jesús V. Jorrín Novo, Estudio cinético de la actividad invertasa
de levadura de panadería. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,
Campus Universitario de Rabanales, Córdoba.

Marcela Vega Ferreira, Aline Farias Rossler, Ricardo Peraça Toralles, Walter
Augusto Ruiz, Cesar Valmor Rombaldi, Extracción optimizada y purificación parcial
de invertasa aislada de S. Cerevisiae en puré de durazno, Revista Brasileira de
fruticultura, ISSN 0100-2945, Brasil, 2017, Obtenido de: <http://dx.doi.org
/10.1590/0100-29452018489>

Veana, F., Aguilar, C., Viader, J. & Rodríguez, R. Invertasa del Genero Aspergillus
y su impacto biotecnológico. Marzo 20, 2017, de SMMB Obtenido de:
<http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_2011_1/Veana_Invertasa.pdf>

Alberto Eugenio Espinel González, Estudio de la represion catabolica por glucosa

en Candida utilis, Tesis Doctoral, Universidad Complutense De Madrid, Facultad De
Ciencias Biologicas, Departamento De Microbiologia, España, 1996.