Você está na página 1de 23

Univerzitet u Novom Sadu

Prirodno-matematički fakultet
Departman za hemiju, biohemiju i zaštitu
životne sredine

Obezbeđenje kvaliteta i dobra laboratorijska


praksa

Predmetni profesor:

Prof. dr Biljana Abramović

Student:

Jovana Jelić, 44M/15


Novi Sad

Sadržaj

1. Uvod
1

2. Obezbeđenje kvaliteta 2

2.1. Nastanak i razvoj standarda za upravljanje kvalitetom u 2


laboratoriji
2.2. Osnovni elementi Standarda ISO/IEC 17025 4
2.3. Totalni kvalitet 5

2.3.1. Kvalitet rezultata 6


2.3.2. Kontrola kvaliteta rada 7
2.3.3. Planiranje kontrole kvaliteta 9
3. Validacija analitičkih metoda 11
4. Dobra laboratorijska praksa (DLP) 15
4.1. Rukovođenje 15
4.2. Program za osiguranje kvaliteta 16
4.3. Prostor za istraživanje 16
4.4. Aparati i instrumenti za istraživanje 16
4.5. Eksperimentalni subjekt 17
4.6. Supstance 17
4.7. Standardni operativni protokol 17
4.8. Realizacija istraživanja i završni izveštaj 17
5. Zaključak 18
6. Literatura 19
1.Uvod

Pojam kvaliteta u oblasti laboratorijaske prakse se može najkraće definisati kao skup
karakteristika jedne procedure, odnosno postupka koji daje analitički rezultat koji ispunjava
očekivane i propisane zahteve koje zadovoljavaju korisnika tih rezultata.
Laboratorijski postupak ili procedura je niz radnji koje se ostvaruju u laboratoriji uz pomoć
analitičke opreme, bilo da je ona jednostavna ili kompleksa, sa ciljem da se dobije odgovarajući
rezultat koji analogno ili digitalno, kvalitativno ili kvantitativno opisuje analizirani supstrat.
Očekivane ili propisane karakteristike rezultata su nastale kao proizvodi dugogodišnje analitičke
prakse ponavljanjem analitičkog postupka pri optimalnim uslovima rada sa istim supstratom uz
pomoć iste ili slične analitičke opreme. Provera kvaliteta nekog postupka ili rezultata ostvaruje
se njegovim ponavljanjem uz dodatnu primenu odgovarajuće matematičko-statističke obrade.
Principi Dobre laboratorijske prakse (DLP) moraju se primeniti na sva pretklinička ispitivanja
bezbednosti supstanci koje ulaze u sastav lekova za upotrebu u humanoj medicini, pesticida,
kozmetičkih proizvoda, lekova za upotrebu u veterinarskoj medicini, dodataka hrani, dodataka
hrani za životinje i industrijskih hemikalija. Supstance koje se ispituju najčešće su sintetske
hemijske supstance, ali mogu biti i prirodnog ili biološkog porekla, a u nekim slučajevima, i živi
organizmi. Cilj ispitivanja ovih supstanci je prikupljanje podataka o njihovim karakteristikama
i/ili bezbednosti poštujući zdravlje ljudi i/ili životnu sredinu. Pretkliničko ispitivanje bezbednosti
po zdravlje ljudi i životnu sredinu obuhvaćeno principima Dobre laboratorijske prakse odnosi se
na rad u laboratorijii. Osim posebnih izuzetaka predviđenih nacionalnim zakonodavstvom,
principi Dobre laboratorijske prakse primenjuju se na sva pretklinička ispitivanja bezbednosti po
zdravlje ljudi i životnu sredinu u cilju registracije ili izdavanja dozvole za stavljanje u promet
lekova za upotrebu u humanoj i veterinarskoj medicini, pesticida, dodataka hrani, dodataka hrani
za životinje, kozmetičkih i sličnih proizvoda, kao i za registraciju industrijskih hemikalija. Dobra
laboratorijska praksa je sistem kvaliteta koji se odnosi na organizacione postupke i uslove u
kojima se pretklinička ispitivanja bezbednosti po zdravlje ljudi i životnu sredinu planiraju,
obavljaju, nadgledaju, beleže, arhiviraju i o njima izrađuju izveštaji.[1]

1
2. Obezbeđenje kvaliteta

Nepreciznost i netačnost su karakteristike metode, a zahtevani nivo analitičkog kvaliteta može


da se postigne različitim kombinacijama nepreciznosti i netačnosti. Međutim, analitički kvalitet i
kvalitet krajnjeg rezultata nisu ista stvar. Kod obezbeđivanja kvaliteta krajnjeg rezultata važno je
da se zna kakve su potrebe i zahtevi korisnika tog rezultata i da se ti zahtevi implementiraju u
proces rada. Ovo je važno imati na umu jer korisnik posmatra rezultat sa medicinske tačke
gledišta, posmatra ga u odnosu na referentne vrednosti ili u odnosu na raniji rezultat, a ne
razmišlja o rezultatu sa aspekta nepreciznosti i netačnosti.

2.1. Nastanak i razvoj standarda za upravljanje kvalitetom u laboratoriji

Evolucija sistemskih prilaza upravljanju kvalitetom laboratorija do danas je imala interesantan


put razvoja. Naime, on se može povezati i sa sistemskim prilazima razvoja kvaliteta, koji su
imali odlučujući uticaj i na razvoj modela za upravljanje kvalitetom u laboratoriji. Može se reći
da je taj razvoj u početku tekao paralelno: ISO (ostali svet), SAD (GLP) i EU (EN 45001). Pri
kraju prošlog veka – ovi napori su ujedinjeni. Tako, za laboratorije, on ima sledeću istoriju [2-8]:

 1978. godina. ISO (International Organizatin for Standardization) iz Ženeve, donosi ISO
Guide 25 - General Requirements for the Compentence of Testing Laboratory, što znači da
se ovaj dokument odnosio samo na ispitne laboratorije. On je bio baza za razvoj kasnijih
modela standarda za upravljanje kvalitetom u laboratoriji.

 1981. godine. US Food and Drug Administration gency and US Environmental Protection
Agency, zvanično donose dokument Good Laboratory Practice (GLP). On predstavlja set
pravila koja definišu »dobru praksu rada« u laboratoriji. Ona su se u početku odnosila na
analitičko-hemijske laboratorije. Ovaj dokument, kao i prethodni, postali su osnova za
razvoj svih kasnijih modela za upravljanje kvalitetom u laboratoriji.

 1982. godina. ISO i IEC (International Electrotechnical Commission) izdaju zajedničku


verziju ISO/ IEC Guide 25 (General Requirements for the Compentence of Calibration
and Testing Laboratory). Znači, ovaj vodič se sada širi i na Laboratorije za etaloniranje.

 1988. godina. EEC (Brussels) izdaje draft verziju evropskog standrda EN 45001 – General
criteria for the Operation of Testing Laboratories.

 1989. godina. Izdaje se zvanična verzija evropskog standarda za ispitne laboratorije – EN


45001.

 1990. godina. Nova verzija ISO/IEC Guide 25

2
 1992. godina. OECD (Organization for Economic Cooperation and Development), pri UN
Ženeva, izdaje – The OECD Principles of Good Laboratory Practice. Osnova za ovaj
dokument je GLP iz 1981. godine.

 1993. godina. CEN/CLC TC1 (The European Technical Committee on Conformity


Assessment) upućuje zvaničan dokument ISO organizaciji za otpočinjanje zajedničkog
rada na reviziji ISO/IEC Guide 25.

Naime, evropski standard 45001, nije naišao na očekivani odijum u javnosti, jer je u svojoj
suštini predstavljao mešavinu zahteva za GLP Laboratorije i zahteva za akreditaciju, tako da u
svojoj suštini nije mogao da zameni ISO Guide 25. Polazeći od ovoga ISO CASCO (Committee
on Conformity Assessment) je 12. janura 1994. godine u Ženevi organizovao zajednički sastanak
svih zainteresovanih strana. Doneta je odluka da u junu te godine (1994.) počne rad na reviziji
ISO/IEC Guide 25, u okviru ISO/CASCO WG 10. Prvi sastanak ove WG je održan 16 i 17 marta
1995. godine. Na njemu je učestvovalo 25 eksperata iz celog sveta, koji su definisali početne
tačke novog modela ISO Guide 25.
One su glasile:
a) vodič mora definisati jasne kriterijume kompetentnosti Laboratorije, koji se mogu
koristiti i kao kriterijumi za njenu akreditaciju,
b) ovaj model mora zamenti postojeći standard EN 45001, kao na nacionalnom tako i
na međunarodnom nivou,
c) relacija sa modelom ISO 9000 mora biti jasna i nedvosmislena, i
d) vodič mora biti otvoren za razvoj i primenu novih metoda merenja i principa
uzorkovanja

Posle ovoga WG 10 drži u 1995. i 1996. godini dva sastanka, posle kojih usvaja zavrčnu verziju
ovog dokumenta. Prema pravilima ISO organizacije on se prosleđuje NOS (Nacionalne
organizacije za standardizaciju), CASCO članicama, kao i sekretarijatu CEN/CEL TC 1 na
razmatranje, glasanje i usvajanje. Međutim, nakon pozitivnog odjeka u javnosti, ISO/CASCO
Committee, na sastanku u Sidneju 15 maja 1997. godine donosi odluku da najnoviju reviziju ISO
Guide 25, prevede u međunarodni ISO 17025 standard. ISO TMB (Technical Management
Board) se složio sa ovim predlogom, tako da je odmah proglašena njegova CD1 verzija. Ona je u
toku diskusije rezultirala dokumentom od 131 strane, koji je razmatran na sednici ISO/ CASCO
WG 10, na sastanku u Ženevi 26 i 27 februara 1988. godine. On je rezultirao novom verzijom
standarda ISO/ DIS 17025, koji je zvanično posle glasanja i prihvatanja, publikovan u julu 1998.
godine. U martu (30. i 31.) 1999. godine, ISO/ CASCO WG 10 je konačno prihvatio FDIS
verziju ISO 17025. Ova verzija je 16. septembra 1999. godine, upućena na glasanje NOS, koje je
završeno 16. novembra 1999. godine. Time su se stekli svi uslovi da je 15 decembra 1999.
godine proglašen novi ISO/IEC standard 17025 – General requirements for the competence of
testing and calibration laboratories. Interesantno je da su protiv ove verzije glasali Austrija,
Kolumbija, SAD. Od glasanja je bila uzdržana Nemačka.

3
2.2. Osnovni elementi Standarda ISO/IEC 17025

Za laboratoriju se može reći da je to celina u okviru koje se vrše ispitivanja merenjem. Ona
predstavlja važan element za obezbeđenje kvaliteta u sistemu trgovine, posebno međunarodne.
Naime, laboratorija svojim kompetentnim rezultatima ispitivanja obezbeđuje uklanjanje barijera
u međunarodnoj trgovini i ubrzava protok roba, koji se zasniva na međunarodnom kredibilnom
sistemu priznavanja rezultata ispitivanja. Ovo se postiže primenom standarda ISO/IEC 17025, uz
pomoć koga svaka laboratorija postaje međunarodno kompetentna – akreditovana. To znači da se
laboratoriji zvanično priznaje njena kompetentnost za ispitivanje na osnovu dobijenog ovlašćenja
od kredibilne organizacije za to [9-12].
Akreditacija je postupak koji primenjuje organizacija nadležna za akreditovaje (kod nas je
Akreditaciono telo Srbije– ATS)[13], i na propisan način utvrđuje osposobljenost i kompetentnost
za obavljanje poslova i zadataka sertifikacije, ispitivanja proizvoda i kontrole usaglašenosti.
Postupak akreditacije je proces u kome akreditaciono telo utvrđuje da li organizacija ispunjava
zahteve standarda i uslove za obavljanje definisanih poslova u obimu akreditacije.
Obim akreditacije predstavlja područje kompetentnosti laboratorije, odnosno obuhvata
ispitivanja koja se vrše korišćenjem metoda (standardnih, nestandardnih, razvijenih u samoj
Laboratoriji).
Akreditaciono telo koristi standard SRPS ISO/IEC 17025:2006 [13] koji je identičan
međunarodnom standardu ISO/IEC 17025: 2005, za priznavanje kompetentnosti laboratorija,
koji definiše zahteve za to, a koji se odnose na kotrolu kvaliteta laboratorije i tehničke
kompetencije dobijenih rezultata ispitivanja– ocenjivanje kvaliteta.

Projekat akreditacije laboratorije se izvodi u šest faza:

 prva faza – donošenje odluke menadžmenta o realizaciji projekta akreditacije (poslovna


odluka, plan projekta, resursi),
 druga faza – ocena postojećeg stanja i obuka menadžmenta laboratorije,
 treća faza – formiranje i obuka timova; projektovanje modela QC/QA; projektovanje
modela dokumentacije,
 četvrta faza – izrada dokumentacije; unapređenje poslovnih procesa laboratorije; obuka
za primenu modela,
 peta faza – primena modela; korektivne mere; predakreditacioni audit,
 šesta faza – prijava za akreditaciju; akreditacija.

Svaka od navedenih faza ima svoju dalju detaljnu strukturu.[13]

4
2.3. Totalni kvalitet

Upravljanje totalnim kvalitetom koje je prvo uspostavljeno u industriji, uvedeno je i u


zdravstvene organizacije. Prilagođena šema obuhvata više različitih segmenata koji su prikazani
na Slici 1.

Slika 1. Šema upravljanja totalnim kvalitetom

 Kvalitet laboratorijskog procesa (QLP) obuhvata propise, procedure, standarde i


mogućnosti koje određuju kako se radi u laboratoriji. Uputstva za laboratorijske metode
opisuju kako se izvode metode kojima se dobija laboratorijski rezultat.

 Kontrola kvaliteta (QC) obuhvata procedure za praćenje procesa rada u laboratoriji,


otkrivanje i otklanjanje problema pre nego što rezultat izađe iz laboratorije. Analitičke
karakteristike metode se prate statističkom kontrolom kvaliteta.

 Ocenjivanje kvaliteta (QA) obuhvata šire praćenje drugih dimenzija, odnosno


karakteristika kvaliteta, koje su unapred definisane prema zahtevima korisnika rezultata.
Ovde spadaju aktivnosti kojima se prati preanalitička faza rada, ali i spoljašnja kontrola
kvaliteta.

 Unapređenje kvaliteta (QI) ima cilj da otkrije uzroke ili izvore problema koji su
identivikovani kroz faze "Kontrola kvaliteta" i "Ocenjivanje kvaliteta". Nekada to može
da uradi jedan čovek, a nekada su potrebni timovi ljudi i odgovarajući alati (npr. različiti
dijagrami).

5
 Planiranje kvaliteta (QP) obuhvata procese koji treba da obezbede kvalitet prema
zahtevima korisnika. Ovde spada izbor novih metoda i instrumenata, kao i izbor i dizajn
procedura za kontrolu kvaliteta.
 Standardi ili ciljevi kvaliteta (QS) predstavljaju zahteve koji treba da budu dostignuti da
bi se zadovoljile potrebe korisnika. Kad se govori o analitičkom kvalitetu, cilj je da se
dobije rezultat koji se nalazi u okviru dozvoljenih granica.

Sve ove aktivnosti zajedno predstavljaju proces upravljanja kvalitetom koji funkcioniše kao
petlja. QLP definiše najbolji način da se uradi posao, QC i QA predstavljaju meru koliko dobro
je posao urađen, kada se pojavi problem QI otkriva njegov uzrok, a uzrok se otklanja uz pomoć
QP.[14]

2.3.1. Kvalitet rezultata

Nivo kvaliteta koji treba da se postigne u laboratoriji ne može da se postavi na apsolutnoj


vrednosti, a u isto vreme zavisi od vrste ustanove u kojoj se laboratorija nalazi, od nivoa
opremljenosti laboratorije, od profesionalnog interesovanja naučnika koji koriste rezultate, kao i
od troškova koje traženi nivo kvaliteta iziskuje. Problem koji se često pojavljuje u laboratorijama
je da ne znamo za sve parametre koji je zahtevani nivo kvaliteta, a iza toga sledi pitanje kako
znamo da dobro radimo ako ne znamo koji nivo kvaliteta treba da dostignemo. Čak i kada je nivo
kvaliteta definisan, postavlja se pitanje kako znamo da smo ga dostigli kod svih analiza koje
radimo. Postizanje traženog nivoa kvaliteta zahteva pripremu sveobuhvatnog programa za
obezbeđivanje kvaliteta. Ovakav program podrazumeva širok spektar planova, dokumenata i
procedura, a obuhvata sve i svakog u laboratoriji. To znači da opredeljenje za dostizanje željenog
nivoa kvaliteta mora da bude sveopšte, odnosno svi zaposleni u laboratoriji moraju da budu
opredeljeni za sprovođenje takvog programa.
Osnovni uslov za sprovođenje programa obezbeđenja kvaliteta je da laboratorija ima
administrativnu podršku. Ovo je važno stoga što sprovođenje takvog programa zateva određena
finansijska sredstva, kao i veću ili manju reorganizaciju unutar laboratorije. Pored toga, osoblje u
laboratoriji mora da ima odgovarajuće obrazovanje i iskustvo, a ako ga nema mora da se
organizuje dodatne edukacija. I na kraju, za sprovođenje programa za obezbeđenje kvaliteta
neophodne su dobre tehničke procedure i to:

a) Procedure za kontrolu preanalitičkih uslova: uzimanje, transport i distribucija uzorka,


priprema radnih lista, izdavanje rezultata i održavanje baze podataka;

b) Procedure za kontrolu analitičkih promenjivih: analitička metoda, standardizacija i


kalibracija metode, dokumentacija za izvođenje analitičke metode i praćenje kritične
opreme i materijala;

c) Procedure za praćenje analitičkog kvaliteta: statističke metode i kontrolne karte.

6
Program za obezbeđivanje kvaliteta rada i rezultata podrazumeva da u laboratoriji moraju da
postoje razrađeni mehanizmi za rešavanje problema, odnosno mehanizmi koji će da obezbede
vezu između identifikacije problema i primene rešenje za otklanjanja tog problema.[14]

2.3.2. Kontrola kvaliteta rada

Kontrola kvaliteta rada predstavlja samo deo ukupnog sistema kvaliteta i pod tim nazivom se
podrazumevaju kvantitativne tehnike i procedure kojima se prate izvori mogućih grešaka,
određuje veličina greške i upozorava osoblje da je kvalitet rada ugrožen. Statistička kontrola
kvaliteta je osnovna tehnika za praćenje kvaliteta rada u laboratorijama i ona daje kvantitativnu
meru kvaliteta rada.
Rezultat rada u hemijskim laboratorijama je numerički rezultat, koji kao i svaki drugi proizvod
može biti dobar ili loš. Za razliku od fizičkih proizvoda koji mogu da se prostim pregledanjem
ocene kao dobri ili loši, laboratorijski rezultati ne mogu jednostavno da se ocene.
Na primer, ako u uzorku pacijenta dobijemo vrednost holesterola 5,0 mmol/L, postavlja se
pitanje kako znamo da je ta vrednost korektna, odnosno "dobrog kvaliteta". Međutim, ako je
vrednost 5,0 mmol/L dobijena u uzorku koji je ranije analiziran, a dobijene vrednosti prikazane
histogramom, i ako se ta vrednost nalazi u okviru ranije dobijenih vrednosti, možemo da
zaključimo da je ova vrednost 5,0 mmol/L korektna. Kada se u seriji u kojoj se nalazi poznati
uzorak istovremeno obrađuju i uzorci pacijenata i ako smo za poznati uzorak zaključili da je
korektan, onda posredno možemo da zaključimo da su i nepoznati uzorci pacijenata korektni.
U laboratorijama se kontrola kvaliteta sprovodi pomoću kontrolnih tačaka koje se koriste tako
da se kontrolna vrednost dobijena jednog dana upoređuje sa vrednostima koje su dobijene u više
prethodnih dana. Na Slici 2 je prikazan histogram vrednosti dobijenih u kontrolnom uzorku u
toku više dana. Iz tih vrednosti su izračunate srednja vrednost i standardna devijacija pomoću
kojih su određene kontrolne granice i to kao ±1Sd, ±2Sd i 3±Sd.
8.0

7.2

6.4

5.6

4.8
Frequency

4.0

3.2

2.4

1.6

0.8

0.0
0.46 0.47 0.48 0.49 0.50 0.51 0.52 0.53 0.54

Slika 2. Ideja kontrole kvaliteta rada u laboratorijama.

Prema Gauss-ovoj raspodeli (Slika 3) može da se očekuje da će se oko 68% vrednosti naći u
granicama ±1Sd, oko 95% u granicama ±2Sd i oko 99,7% u granicama ±3Sd (Slika 4). Prema

7
tome, verovatnoća je samo 0,3% da se dobije vrednost izvan ±3Sd, odnosno takva vrednost se ne
očekuje, a kada se ona pojavi, to je znak da postoji neki problem, odnosno da sa metodom nešto
nije u redu. [14]

Slika 3.Gustina verovatnoće normalne raspodele sa različitim parametrima. Zelenom bojom je


predstavljena normalna normirana raspodela (μ = 0, σ = 1).

Takođe je mala verovatnoća (svega 5%) da se pojavi vrednost izvan ±2Sd, ali nije sasvim
neočekivana; verovatnoća 5% znači da se svakih 20 vrednosti može da pojavi jedna izvan
granica ±2Sd. Nasuprot ovome, vrlo je očekivano da se pojave vrednosti izvan granica ±1Sd i
verovatnoća iznosi oko 32% ili svaka treća vrednost. Zbog toga se granice ±1Sd ne koriste za
procenu rezultata kada se u kontroli kvaliteta koristi samo jedna kontrolna vrednost.[14]

Slika 4. Normalna raspodela u procentima

Svrha statističke kontrole kvaliteta je da se prati analitički kvalitet merenja u toku stabilnog
procesa, da se detektuje odstupanje od stabilnog procesa i da se spreči izdavanje rezultata koji su

8
praćeni greškom koja ima medicinski značaj. Sa gledišta hemičara, kontrolna provedura treba da
bude takva da ga upozori kada kod metode postoji problem, odnosno da ga ne upozori kada je
metoda u redu. Drugim rečima, hemičar želi da zna kada kod metode postoji realan problem, ali
ne želi da gubi vreme na rešavanje nepostojećih problema.[14]

2.3.3. Planiranje kontrole kvaliteta

Kod planiranja kontrole kvaliteta potrebno je da se zna koji nivo kvaliteta je potreban za različite
testove, nepreciznost i netačnost za te testove, kao i nivo verovatnoće za odbacivanje rezultata.
Informacije koje su potrebne nalaze se u literaturi, različitim uputstvima i kriterijumima za
spoljašnju kontrolu kvaliteta. Ono što je važno imati na umu je da proces kontrole kvaliteta mora
sistematski da planira, da bi se obuhvatila sva kritična mesta u procesu rada. Planiranje kontrole
kvaliteta, kao i njeno kasnije izvođenje može da se radi uz pomoć kompjutera i specijalizovanih
software ili ručno. Takođe, u praksi se ide ka tome da kontrola kvaliteta bude uniformna i da se
isti princip kontrole primenjuje na što veći broj parametara, što nije najbolji pristup. Metode sa
boljim performansama zahtevaju "manju" kontrolu, dok metode sa lošijim performansama
moraju više i obimnije da se kontrolišu. Planiranje kontrole kvaliteta može da se opiše u osam
koraka, kako je shematski prikazano na Slici 5.[14]

Slika 5. Šema planiranja kontrole kvaliteta

1. Definisanje potrebnog kvaliteta. Potreban kvalitet može da se definiše u obliku


dozvoljene ukupne analitičke greške; ako se u toku rada pređe dozvoljena ukupna analitička
greška smatra se da rezultat nema prihvatljiv kvalitet. Dozvoljena ukupna analitička greška se
definiše na osnovu dozvoljene nepreciznosti i netačnosti metode. Dobru osnovu za definisanje
dozvoljene nepreciznosti i netačnosti predstavlja biološka varijacija, a takođe i informacije o
kliničkom tretmanu odgovarajuće bolesti, koje ukazuju na potreban analitički kvalitet rezultata
da bi on bio medicinski upotrebljiv.
2. Ocenjivanje karakteristika metode u obliku nepreciznosti i netačnosti je kritičan korak u
planiranju procedure za kontrolu kvaliteta. Nepreciznost i netačnost metode predstavljaju tzv.
stabilne performanse, ali od koristi je da se znaju i nestabilne performanse, kao što su vrsta i
9
veličina analitičke greške, kao i frekvenca pojavljivanja. Ovi podaci se lako dobijaju iz
eksperimenata koji su izvedeni tokom validacije metode. dobijaju iz eksperimenata koji su
izvedeni tokom validacije metode.
3. Odabiranje odgovarajuće procedure za kontrolu kvaliteta prema kontrolnim
materijalima koji se koriste, broju kontrolnih uzoraka u jednoj seriji, kontrolnim pravilima i
karakteristikama za odbacivanje rezultata.
4. Primena procedure za kontrolu kvaliteta uz pomoć različitih grafika ili namenskih
software-a.
5. Evaluacija verovatnoće za odbacivanje, odnosno verovatnoće za detekciju greške. Na
osnovu verovatnoće za detekciju greške (Ped) analitičke metode mogu da se klasifikuju u tri
grupe: sa visokom detekcijom greške gde je Ped > 90%, sa umerenom detekcijom greške gde je
Ped = 50 – 90% i niskom detekcijom greške gde je Ped < 50%. Ukoliko metoda ima visoku
detekciju greške onda je statistička i nestatistička kontrola kvaliteta svedena na najmanju meru i
obrnuto, ako metoda ima malu detekciju greške, onda je potrebno da se procedura kontrole
kvaliteta optimizira za stabilnost procesa, da se osoblje dobro uvežba itd.
6. Izbor odgovarajućih kontrolnih pravila i broja kontrolnih uzoraka. Procedura za
kontrolu kvaliteta imaju svoje karakteristike za odbacivanje, koje moraju da budu poznate pre
nego što počnemo sa primenom.
7. Prilagođavanje procedure za kontrolu kvaliteta da se postigne ravnoteža između
statističkih i nestatističkih komponenata. Procedura za kontrolu kvaliteta (i cela strategija za
kontrolu kvaliteta) prilagođavaju se metodi i njenoj mogućnosti za detekciju greške. Ako metoda
ima visoku mogućnost detekcije greške, dovoljna je sama statistička kontrola da sedetektuje
greška, ali ako metoda ima nisku detekciju greške onda samo statistička kontrola nije dovoljna
da se detetktuje greška, već su potrebne i neke preventivne mere.
8. Promena procedure i strategije za kontrolu kvaliteta. Kada se promene karakteristike
metode ili se promene zatevi za kvalitetom iste metode, potrebno je da promeni cela procedura
kontrole kvaliteta, ili neki njeni segmenti, kao što su npr. kontrolna pravila.[14]

10
3. Validacija analitičkih metoda

Šta je to validacija analitičkih metoda? Najjednostavnija definicija kaže da je to postupak


kojim dokazujemo da naša metoda služi svrsi koju smo joj namenili, a najjednostavnija logika
kaže da je pre svega potrebno znati/definisati svrhu metode. Nakon toga se, po struci i logici
posla, utvrđuju postupci, tj. planiraju i sprovode eksperimenti čije rezultate treba prikupiti i
prikazati kao dokaze o validnosti metode. Sigurno je da se isti postupci neće primenjivati na sve
metode – različito se pristupa validaciji kvalitativnih i kvantitativnih metoda; razlikuju se
postupci validacije metode kojom se određuje analit u uzorku i one kojom se određuju tragovi u
kompleksnom matriksu. Svakoj se metodi pristupa individualno, procenjuje se šta treba uraditi
kao dokaz upotrebljivosti iste. I struka i regulativa i zakonodavstvo prihvatili su osam osnovnih
parametara, tj. funkcija validacije:

• specifičnost /selektivnost
• linearnost
• osetljivost
• preciznost
• tačnost
• granica određivanja
• granica detekcije
• robusnost.

Kombinacijom tih parametara oblikuje se plan validacije za svaku metodu.

 Specifičnost /selektivnost svojstvo je metode da tačno i specifično odredi željeni analit u


prisutnosti ostalih komponenata u matriksu uzorka pod utvrđenim uslovima ispitivanja. Iako
se u praksi često poistovećuju, specifičnost i selektivnost dva su različita svojstva metode.
Specifična metoda je ona kojom se može odrediti samo jedan specifični analit. Metoda kojom
se može određivati više komponenata istovremeno, ali pod uslovom da te komponente pri
određivanju ne smetaju jedna drugoj, naziva se selektivnom. Selektivnost je nezaobilazan
parametar za validaciju većine metoda. U praksi se dokazuje poređenjem odziva metode
(signal) na referentni materijal i analit u uzorku. Kod hromatografskih metoda, osim
poređenja hromatograma referentnog materijala i uzorka, potrebno je dokumentovati i
parametre koji određuju razdvojenost i simetriju pikova, a kod određenih metoda i prikupiti
dokaze o čistoći pikova.[15]

 Linearnost je određena kao mogućnost metode da unutar određenog područja daje ispitne
rezultate proporcionalne koncentraciji analita u uzorku. U praksi se linearnost određuje
merenjem odziva metode (signala) na različite poznate koncentracije referentnog materijala
(preporučuje se najmanje pet koncentracija uz tri ponavljanja). Procenjuje se matematički i
grafički. Matematički se preko linearne regresije izrazi jednačina pravca (y = ax + b) i
izračuna koeficijent korelacije (k).

11
Nagib pravca (a) parameter je koji ukazuje na osetljivost metode. Odsečak (b) može
ukazivati na procentnu grešku. Za koeficijent korelacije uobičajeno se postavlja kriterijum
k ≥ 0,99. Za vrlo niske koncentracije prihvata se i kriterijum k ≥ 0,98. Grafički prikazi
zavisnosti signala od koncentracije analita važni su zbog mogućnosti vizualnog nadzora.
Najčešće se upotrebljavaju dva načina grafičkog prikaza:

• Grafički prikaz odstupanja od regresijskog pravca prema koncentraciji ili logaritmu


koncentracije – za linearna područja odstupanja pođednako raspoređena između
pozitivnih i negativnih vrijednosti (Slika 6a).

• Grafički prikaz relativnih signala (odnos signala i odgovarajuće koncentracije) na osi y i


odgovarajućih koncentracija na osi x log skale. Dobijena linija treba biti vodoravna u
celome linearnom području, a područje linearnosti prestaje pri koncentracijama gde linija
relativnog odziva seče paralelne linije koje odgovaraju 95 % ili 105% koncentraciji
(Slika 6b).[15]

Slika 6. Dva načina grafičkog prikaza linearnosti

 Osetljivost može biti definisana i kao neophodna koncentracija analita koja daje određenu
veličinu merenog signala. Određuje se iz nagiba kalibracione prave. Za analit u tragovima
treba primeniti metodu sa najvećom osetljivošću – kriva 1 (Slika 7). Pri upoređivanju
osetljivosti različitih tehnika ili instrumenata neophodno je uzeti u obzir i postupak izrade
analize. [16]

12
Slika 7. Odrađivanje
osetljivosti analitičke metode
 Preciznost se određuje kao izraz slaganja između niza merenja izvedenih iz istog homogenog
uzorka pod propisanim uslovima. Zavisno od uslova u kojima se određuje razlikujemo:

 ponovljivost – pri čemu uslovi uključuju jednu laboratoriju, istog analitičara, istu
aparaturu, kratko razdoblje.

 prosečna preciznost ili međupreciznost – preciznost koja se ostvaruje unutar istog


laboratorija u dužem vremenskom periodu uz očekivane promene nekih uslova (različiti
analitičari, instrumenti, reagensi različitih dobavljača).

Eksperimentima preciznosti otkrivaju se slučajne greške metode, a numerički je pokazatelj


standardna devijacija, koeficijent varijacije ili varijansa. Kod eksperimenata prosečne
preciznosti je važno da se merenja koja se ponavljaju sprovoditi u uslovimaa koji su što
sličniji onima pri rutinskoj upotrebi metode. Važno je naglasiti da se eksperimenti preciznosti
rade na homogenom autentičnom uzorku, a postupak se ponavlja prema propisu u metodi
upravo onako kako će se ubuduće raditi u praksi. Broj ponavljanja treba zadovoljiti zahteve
statistike. Najčešće se radi po tri ponavljanja na nekoliko različitih koncentracija koji se,
naravno, poklapaju s područjem linearnosti. Kriterijum prihvatljivosti zavise od vrste analize,
matriksa uzorka i koncentracije analita koji se određuje.[15]

 Tačnost (istinitost) analitičke metode izražava podudaranje dobijenih rezultata sa stvarnim.


Pod pojmom »stvarni rezultati« podrazumevaju se rezultati konvencionalno prihvaćeni kao
tačni ili referentne vrednosti određenog standarda. Sprovodi se najmanje na pet različitih
koncentracija uz najmanje tri ponovljena merenja svakog uzorka određene koncentracije.
Odstupanja od stvarne vrednosti najčešće se iskazuju kao procenat iskorišćenja (Recovery,
R):
R = Cexp / Cstd · 100 % (1)

gde su Cexp i Cstd izmerena i stvarna količina analita u uzorku. [17]

Na Slici 8 je dat prikaz preciznosti i tačnosti.

13
Slika 8. Prikaz preciznosti i tačnosti
 Granica detekcije predstavlja najmanju količnu analita u uzorku koja sa sigurnošću može biti
detektovana (ali ne i određena). Zavisno od toga da li je metoda instrumentalna ili ne,
moguće je nekoliko pristupa određivanju granice detekcije:

– vizualna procena se može koristiti za instrumentalne i ne-instrumentalne metode;


granica detekcije određuje se analizom uzoraka poznate koncentracije analita do
minimalne koncentracije koja se pouzdano može detektovati,
– detekcija prema odnosu signala i šuma primenjiva je samo na metodama koje pokazuju
šum bazne linije,
– standardna devijacija signala i nagiba krive – granica detekcije (GD) može se izraziti kao:

GD = 3,3 σ /S (2)

gde je σ standarna devijacija signala, a S nagib kalibracione krive. Nagib krive S može se
proceniti iz kalibracione krive analita.[17]

 Granica određivanja predstavlja najmanju količinu analita koju kvantitativno možemo


odrediti u nekom uzorku. Taj se parametar uglavnom određuje pri određivanju dozvoljene
koncentracije onečišćenja i razgradnih produkata. Poput određivanja granice detekcije i
granica određivanja se može utvrditi na više načina:

– vizualna procena se može koristiti za instrumentalne i ne-instrumentalne metode;


granica određivanja određuje se analizom uzoraka poznate koncentracije analita do
minimalne koncentracije koja se može kvantitativno odrediti uz prihvatljivu tačnost i
preciznost metode,
– odnos signala i šuma,
– standardna devijacija signala i nagiba krive – granica određivanja (GO) može se izraziti
kao:
GO = 10 σ /S (3)

14
gde je σ standarna devijacija signala, a S nagib kalibracione krive. Nagib krive S se može
proceniti iz kalibracione krive analita. [17]

 Robustnost (otpornost) metode pokazuje koliko je metoda osetljiva na nekontrolisane


promene parametara (u realnim uslovima) kao što su: temperatura, pH rastvora, koncentracija
reagenasa, vreme reakcije, itd. Eksperimetalno se parametri u metodi kontrolisano menjaju i
prate se rezultati (recovery; RSD). [15]

Pri sprovođenju validacije nije potrebno za svaku metodu odrediti sve parametre. Njihov
odabir zavisi od primene metode, kao što je to prikazano u Tabeli 1. Razumevanje značenja
pojedinih parametara i načina na koji se izvode u laboratoriju, poznavanje funkcija metode i
regulatornih zahteva osnova su za postavljanje kriterijuma prihvatljivosti za svaki parametar, što
je također neizostavni deo validacije. Postavljeni kriterijumi upoređuju se s dobijenim
rezultatima eksperimenata, a zadnji korak validacije je pisanje izveštaja sa jasno naznačenim
zaključkom o potvrdi da metoda odgovara namenjenoj svrsi. [15]

Tabela 1. Validacijski parametri potrebni za validaciju analitičkih metoda različitih namena

Parametri validacije Identifikacijski Analiza tragova Određivanj


testovi kvalitativn granična e sadržaja
a
Specifičnost da da da da
Linearnost ne da ne da
Osetljivost ne da ne da
Preciznost ne da ne da
Tačnost ne da ne da
Granica detekcije ne ne da ne
Granica određivanja ne da ne ne

4. Dobra laboratorijska praksa (DLP)

Dobra laboratorijska praksa obuhvata grupu, na svetskom nivou prihvaćenih organizacionih


procesa i uslova pod kojima se laboratorijska istraživanja planiraju, izvode, kontrolišu i beleže,
kao i smernice za sastavljanje završnog izveštaja o sprovedenom istraživanju.
Principi DLP se koriste u ispitivanjima različitih supstanci sa ciljem da se dobiju podaci o
njihovim osobinama i/ili bezbednosti njihove primene u odnosu na zaštitu zdravlja ljudi ili
čovekove okoline. Definisanje Principa DLP treba da podstakne razvoj standardizovanih
smernica za dobijanje kvalitetnih podataka eksperimentalnih istraživanja. Postojanje velikog
broja podataka sličnog kvaliteta formira osnovu za uzajamno prihvatanje i razmenu podataka
ispitivanja između različitih država. Ukoliko svaka pojedinačna država može da se sa sigurnošću
osloni na podatke dobijene iz drugih zemalja, izbegava se dupliranje pojedinačnih ispitivanja, što

15
u ekonomskom pogledu smanjuje troškove istraživanja i štedi vreme. Isto tako, primena principa
DLP bi trebalo da podstakne prevazilaženje tehnoloških barijera i dodatno unapredi zaštitu
zdravlja ljudi i čovekove okoline. [18]

4.1. Rukovođenje

Organizacija prostora za istraživanje i prijem kvalifikovanog osoblja je od ključnog značaja za


početak bilo kakvog eksperimentalnog ispitivanja.S tim u vezi, rukovodilac ustanove/laboratorije
u kojoj će se obavljati istraživanje treba da osigura primenu principa DLP. Ovo obuhvata:
pripremu kvalitetnog plana istraživanja, odabir kvalifikovanog osoblja i definisanje radnih
dužnosti za svakog člana istraživačkog tima, obezbeđivanje adekvatnog istraživačkog prostora,
opreme i neophodnog materijala, primenu zdravstvenih i drugih bezbednosnih mera u skladu sa
nacionalnim i međunarodnim propisima, formiranje–primenu standardnog operativnog protokola
sa prethodno definisanim veštinama i procedurama za rad u laboratoriji, organizaciju adekvatnog
beleženja i arhiviranja originalnih rezultata istraživanja i pripremu završnog izveštaja.[18]

4.2. Program za osiguranje kvaliteta

S obzirom na to da se planirani eksperimenti izvode u skladu sa principima DLP, ustanova u


kojoj se sprovodi ispitivanje treba da ima u pismenoj formi sačinjen specijalni program
obezbeđenja kvaliteta. Njega sprovodi imenovani pojedinac ili nekoliko osoba, koje su
odgovorne rukovodiocu ispitivanja, koje su upoznate sa procedurama uključenim u istraživanje,
a same ne učestvuju u istraživačkom procesu. Sprovođenjem navedenog programa se obezbeđuje
da plan studije i standardni operativni protokol budu uvek dostupni istraživačima, osigurava se
periodična kontrola laboratorije i praćenje napredovanja studije u skladu sa planom istraživanja,
blagovremeno se obaveštava rukovodioc istraživanja o bilo kom odstupanju od plana studije ili
standardnog operativnog protokola, evaluira se završni izveštaj u cilju potvrde da su
metodologija, procedure i dobijeni rezultati adekvatno opisani i da prezentovani rezultati tačno
oslikavaju originalne rezultate istraživanja.[18]

4.3. Prostor za istraživanje

Prostor za istraživanje/laboratorija treba da ima određenu veličinu, konstrukciju i lokaciju,


čime se ispunjavaju neophodni zahtevi za izvođenje ispitivanja i smanjuju mogućnosti za pojavu
smetnji, koje bi mogle da utiču na validnost studije. Neophodno je da se osigura dovoljan broj
prostorija ili odeljaka u cilju adekvatnog odvajanja delova istraživačkih procesa. Pogodan prostor
treba da bude na raspolaganju za dijagnostikovanje, tretman i kontrolu bolesti, koje predstavljaju
neprihvatljiv stepen opasnosti za ispitivane životinje. Treba da postoje odeljci za čuvanje
supstanci, opreme i neophodnih nabavki. Ovi odeljci treba da budu odvojeni od onih u kojima se
sprovodi istraživanje. Neophodno je da se obezbede frižideri za odlaganje uginulih životinja i
kvarljivih supstanci. Rukovanje otpadom i njegovo odlaganje treba da bude izvođeno na način

16
kojim se neće ugrožavati proces istraživanja i životna okolina. Neophodno je da se obezbedi
prostor za arhivu, za čuvanje i ponovno pregledavanje originalnih podataka istraživanja,
izveštaja i uzoraka.[18]

4.4. Aparati i instrumenti za istraživanje


Aparati korišćeni za dobijanje eksperimentalnih podataka treba da budu adekvatno smešteni u
istraživačkom prostoru i da budu odgovarajućeg dizajna i namene. Korišćeni instrumenti treba da
periodično budu pregledani, čišćeni, održavani i kalibrisani prema standardnom operativnom
protokolu. Aparatura i materijal korišćeni tokom istraživanja ne bi trebalo da ometaju rad samog
eksperimentalnog sistema. [18]

4.5. Eksperimentalni subjekt

Na osnovu postojećih zakonskih normi je potrebno da se obezbede adekvatni uslovi za


smeštaj, rukovanje i brigu o životinjama, biljkama, mikroorganizmima, kao i ćelijskim ili
subcelularnim sistemima, u cilju dobijanja kvalitetnih eksperimentalnih podataka. Tek primljene
životinje i biljke treba izolovati dok se ne utvrdi njihov zdravstveni status, a zatim aklimatizovati
na spoljašnje okruženje pre početka eksperimenta. U slučaju pojave bilo kakvog nepredviđenog
uginuća ili bolesti, takav organizam ne treba koristiti za eksperiment, i ukoliko je moguće, traba
ga ukloniti na humani način. [18]

4.6. Supstance

Podatke o karakteristikama supstanci, datumu prijema, primljenim količinama i količinama


korišćenim u ispitivanju treba beležiti i čuvati. Neophodno je da se u svim ispitivanjima koriste
referentne/kontrolne supstance da bi se osigurala validnost dobijenih podataka. Procesi
rukovanja, uzorkovanja, obeležavanja i čuvanja supstanci treba da budu jasno definisani. [18]

4.7. Standardni operativni protokol

Ustanova u kojoj se vrši istraživanje treba da ima pisani standardni operativni protokol o
procedurama i veštinama laboratorijskog rada, koji je odobren od rukovodioca istraživanja i
kojim se osigurava kvalitet i originalnost podataka dobijenih tokom istraživačkog procesa. Svaka
pojedinačna laboratorija treba da ima uvek dostupan standarni operativni protokol. Standardni
17
operativni protokol obavezno treba da sadrži sve relevantne podatke o korišćenim supstancama,
aparaturi, eksperimentalnim životinjama (ili drugim eksperimentalnim subjektima), zatim
uputstva za beleženje eksperimentalnih podataka i njihovo kasnije arhiviranje, procedure za
osiguranje kvaliteta istraživanja, opis zdravstvenih i drugih mera predostrožnosti i dr. [18]

4.8. Realizacija istraživanja i završni izveštaj

Izvođenje istraživanja treba da bude u skladu sa prethodno pripremljenim detaljnim planom


istraživanja, zacrtanim vremenskim periodom trajanja istraživanja, predloženom
eksperimentalnom metodologijom i obezbeđenim finansijskim resursima. Završni izveštaj
potpisuje i datira rukovodilac istraživanja. Ovaj izveštaj treba da sadrži: detaljan plan studije,
podatke o eksperimentalnim i kontrolnim supstancama, informacije o ustanovi u kojoj je
obavljeno istraživanje, datume početka i završetka istraživanja, izjavu o obezbeđenju kvaliteta,
opis korišćenog materijala i eksperimentalne metodologije, rezultate, diskusiju rezultata,
zaključake i ocenu ispitivanja.[18]
5. Zaključak

Obezbeđenje kvaliteta podrazumeva integrisane aktivnosti koje obuhvataju planiranje,


primenu, ocenu, izveštavanje i poboljšanje kvaliteta sa ciljem da odgovarajući analitički
postupak, oprema ili usluga zadovolji tip ili nivo kvaliteta očekivan od naručioca/korisnika
rezultata.
Upravljanje kvalitetom je sistematizovan poduhvat koji uključuje naučne i tehničke aktivnosti:
• koje proveravaju da li određeni postupak, oprema, odnosno uslugu imaju takve osobine
i mogućnosti da prema postavljenim standardima ispunjavaju zahteve korisnika,
• koje vrše proveru da li je zadovoljena određena tehnika rada ili aktivnost neophodna da
se sa sigurnošću ispune svi zahtevi značajni za kvalitet.

Kontinuiranim praćenjem kvaliteta ispitivanja i stalnim unapređenjem, laboratorija obezbeđuje


poverenje u rezultate ispitivanja a samim tim i svoju kompetentnost. Laboratorije kao institucije
su posrednici između proizvonača i kupca. Da bi se izbeglo nepotrebno dupliranje ispitivanja
kako kod proizvođača tako i kod kupca, laboratorije moraju da se obavežu da će da rade po
odrenenim standardima. Standardi kojima se laboratorije obavezuju da će raditi su međunarodni,
i ako postoje, nacionalni standardi koji se poklapaju sa međunarodnim.
Poboljšanje rada laboratorije se ogleda u tome što se osoblje periodično edukuje i upućuje na
treninge (međunarodne, regionalne i nacionalne), laboratorija se uključuje u međunarodna
ispitivanja i/ili etaloniranja, kao i preko stalnog poboljšavanja perfomansi instrumenata i
uvođenjem novih (boljih) metoda.

18
6. Literatura

[1] Član 29. stav 2. Zakona o lekovima i medicinskim sredstvima,Smernice Dobre laboratorijske
prakse, "Službeni glasnik RS", br.28, 2008.
[2] Engelhard T, Feller E, Nizri Z. A Comparasion of the Complimentary and Different Issues in
ISO/IEC 17025 and OECD GLP. Accred Qual Assur 2003; 8: 208–212.
[3] Walsh M. Revision of ISO Guide 25. Accred Qual Assur 1999; 4: 365–369.
[4] Fox A. GLP Regulations vs. ISO 17025. Accred Qual Assur 2003; 8: 303 – 309.
[5] Pritzkow J. Pratical Experience of the Laboratories in Implementing the ISO/IEC 17025.
Accred Qual Assur 2003; 8: 25– 29.
[6] Peter van der Leemput H. ISO/IEC 17025:1999 – The New Standard for Laboratories.
Accred Qual Assur 2000; 5: 394–399.
[7] Kohl H. The New ISO 17025–Basic Idea. Accred Qual Assur 1998; 3: 422– 428.
[8] Hembeck H. GLP and other QA Systems–A Comparison. Accred Qual Assur 2002; 7: 266–
276.
[9] Barker R, Wichmann B. Guidance for Accredited Laboratories. Accred Qual Assur 1999; 4:
287– 298.
[10] Forsten J. Experience of Implementing of ISO/IEC 17025. Accred Qual Assur 2002; 7: 234–
239.
[11] Walsh M. Revision of ISO Guide 25. Accred Qual Assur 1999; 4: 365–369.

19
[12] Dizdadji F, Anklam E. Strategic Views of Accreditation. Accred Qual Assur 2004; 9: 317–
322.
[13] Srpski standard, SRPS ISO/IEC 17025, 2006.
[14] Spasić S. Principi kontrole kvaliteta rada. Bilten (Casop is FDS) 1984; 1: 10-11-12.
[15] Katica Lazarić, Svijet po mjeri ,Validacija analitičkih metoda – osnovna načela, Hrvatsko
mjeriteljsko društvo, 2012; 61-65.
[16] Karajović Zogović M., Matović V.,Validacija metoda ispitivanja, 33. Nacionalna
konferencija o kvalitetu, Kragujevac, 2006; 134-138.
[17] M. Medić-Šarić, I. Jasprica i Ž. Debeljak: Uvod u validaciju metoda analize lijekova, Farm.
Glas. 62, 2006.
[18] WHO Library Cataloguing-in-Publication Data , Handbook: good laboratory practice
(GLP): quality practices for regulated non-clinical research and development - 2nd ed,
Switzerland, 2009.

20