Biossegurança na manipulação

de microrganismos patogênicos
ao homem e animais
Erna Geessien Kroon
Laboratório de Vírus
ICB – UFMG
 Como evitar a
cadeia ?

Perigo

Acidente
Dano pessoal e material
Plantas, animais, homem,
meio ambiente
 Biossegurança

A construção do conceito de
biossegurança, teve seu inicio na
década de 70, quando a comunidade
científica iniciou a discussão sobre os
impactos da engenharia genética na
sociedade.
Riscos – Agentes Infecciosos

Probabilidade de dano ou doença

Patogenicidade
Via de transmissão
Estabilidade do agente
Dose infectante
Concentração
Origem
Profilaxia
Determinação dos níveis de Biossegurança
para impedir o escape ao meio ambiente
Níveis de Biossegurança
NB-1
normas de biossegurança nível 1 =
normas para a manipulação de agentes
biológicos que representam baixo risco
individual e para a comunidade
(microrganismos que normalmente não
causam doença em seres humanos ou
animais de laboratório sadios).
 NB-1
Equipamento de Segurança ( Barreira Primária)

Roupa protetora - avental e luvas

Podem ser necessários: proteção facial
proteção de ouvidos

Instalações (Barreiras Secundárias)

•Pia para lavar as mãos
•Superficies de fácil limpeza
•Bancadas
•Mobiliário robusto
•Janelas teladas
 NB-1
Práticas microbiológicas

•Uso de pipetadores mecânicos (automáticos)

•Lavar as mãos
•Acesso restrito ou limitado quando estiver
trabalhando
•Proibição de comer, beber e fumar
•Minimizar gotas e aerossóis
•Descontaminar áreas de serviço diariamente
•Descontaminar resíduos
•Manutenção de programa de controle de
insetos & roedores
Níveis de Biossegurança
NB-2 = normas de biossegurança
nível 2 = normas para a manipulação
de agentes biológicos que
representam risco individual
moderado e risco limitado para a
comunidade (microrganismos
capazes de causar doenças em seres
humanos ou animais de laboratório
sem apresentar risco grave ao
trabalhador, comunidade ou
ambiente. Tratamento efetivo e
medidas preventivas disponíveis,
risco de disseminação pequeno).
 NB-2
Como em NB-1 +
Práticas Microbiológicas
•Luvas
•Pipetas automáticas
•Cuidados com objetos cortantes
Equipamento ( Barreira Primária)
•Uso de capela classe II para agentes infecciosos
que formam aerossóis ou gotas
•grandes volumes
•altas concentrações
Instalação (Barreiras Secundárias)
•Autoclave
•Estação Lava Olho
NB-2 Práticas Especiais
•Descontaminar área de serviço
•Relatar liberações e acidentes
•Não ter animais no laboratório
•Programas de imunização
•Amostras de soro base
•Precauções com agulhas e objetos
cortantes
•Usar plásticos quando possível
•Não tocar em vidro cortado com as
mãos
 Equipamento de Segurança
( Barreiras Primárias)
• Capelas biológicas [NB-2/3]
•Roupa protetora pessoal
•Luvas
•Gorros
•Pipetadores automáticos
•Proteção para olhos e face
•Proteção respiratória [NB-3]
Cabine Segurança Biológica

Classe II
Proteção para indíviduo e ambiente
Suprimento e exaustão de ar por filtro
HEPA
IIA entrada de 75 lfpm e recircula
70% do ar
IIB entrada de 100 lfpm e exaustão de
70% (B1) ou 100% ( B2)
HEPA - High Efficiency Particulate Air
Fluxo laminar
Níveis de Biossegurança

NB-3 = normas de biossegurança nível 3

= normas para a manipulação de
agentes biológicos que representam
elevado risco individual e risco limitado
para a comunidade (normas para o
trabalho com microrganismos que
geralmente causam doenças em seres
humanos e/ou animais, ou ainda
resultam em sérias consequências
econômicas, com risco pequeno de
disseminação por contatos individuais,
existindo tratamento antimicrobiano ou
antiparasitário).
NB-3
NB-3
Níveis de Biossegurança
NB-4 = normas de biossegurança nível 4
= normas para a manipulação de
agentes biológicos que representam
elevado risco individual e elevado risco
para a comunidade (normas para o
trabalho com microrganismos que
causam doenças graves ou são letais
para seres humanos e animais, de
transmissão fácil por contatos
individuais casuais).
Desinfecção e esterilização

Antisséptico- inativa microrganismos

ou inibe sua multiplicação. Aplicado
em superfície de organismos.
Desinfetante - inativa microrganismos
ou inibe sua multiplicação. Não
inativa os esporos. Aplicado em
superfícies inertes
Esterilização – destrói todos os
microrganismos
Germicidas químicos
Hipoclorito de sódio 1a 5 g/l cloro – 1:50 a
1:10
Formaldeído -5% carcinogênico
Glutaraldeído -20 g/l -2% (alcalino)
Compostos fenólicos
Amônio quaternário – cloreto benzalcônio
Alcool – etanol ou 2 -propanol
Iodo
Peróxido de hidrogenio – 3%
Esterilização

Calor Seco 1600C de 2 a 4 h

Calor úmido – 15 minutos a 1210C
25 minutos a 1150C
Deslocamento por gravidade
Pré-vacuo
Incineração
AUTOCLAVE
Principais falhas humanas

limpeza incorreta ou deficiente dos materiais;

utilização de invólucros inadequados para os artigos a
serem esterilizados;
confecção de pacotes muito grandes, pesados ou
apertados;
disposição inadequada dos pacotes na câmara;
abertura muito rápida da porta ao término da esterilização;
tempo de esterilização insuficiente;
utilização de pacotes que saíram úmidos da autoclave;
mistura de pacotes esterilizados e não esterilizados;
não identificação da data de esterilização e data-limite de
validade nos pacotes;
desconhecimento ou despreparo da equipe para usar o
equipamento.
Substituir o bico de Bunsen

Calor infra-vermelho 5-7 segundos

a 815.6oC
Ou Bico de Bunsen protegido ou
alças descartáveis
Transporte

Embalagem primária e secundária a

prova de derramamento
Absorvente entre primário e
secundário
Cada embalagem primária é
embalada individualmente
Identificação depois da embalagem
secundária
Identificação de gelo seco
Transporte
Transporte de agente infeccioso
Recipientes para
recolher lixo
Depósito de vidro e
plástico
Recipientes para objetos
cortantes e vidro
Circulação de agentes infecciosos no
meio ambiente
 Doenças Emergentes e re-
emergentes em humanos
75% de origem animal
Fatores predisponentes
Alterações demográficas
Produção animal intensiva
Turismo
Comércio
Guerras
Degradação Ambiental
Tecnologia do DNA recombinante

Métodos usados para construção e

caracterização de moléculas de DNA
recombinante.
DNA Recombinante : DNA quimera de 2
espécies diferentes, usualmente a
bacteriana, plasmidial ou viral contendo
um gene de outra espécie.
Engenharia Genética : Aplicação de
técnicas de DNA recombinante
Plasmídeos
Produção de ovelha transgênica

Produção de proteínas de uso

farmacêutico

Imunização de animais por meio da

expressão transgênica de antígenos
virais
 Transferência de genes para seres humanos
Ex-vivo vetores Células humanas
vetor
Gene
terapêutico

In vivo Células alteradas

Transferência in vivo (seta em laraja)

Nesta estratégia os vetores contendo o gene
"terapêutico" são colocados diretamente no
tecido alvo.
Transferência ex vivo (seta em azul)
As células do paciente são removidas pelo
médico. No laboratório, o gene "terapêutico"
é adicionado às células que, em seguida,
retornam para o paciente geneticamente
corrigidas.
 No Brasil - Lei de
Biossegurança
11.105, 24 de março de 2005 Art. 1°

Esta Lei estabelece normas de segurança e

mecanismos de fiscalização sobre a
construção, o cultivo, a produção, a
manipulação, o transporte, a transferência, a
importação, a exportação, o armazenamento, a
pesquisa, a comercialização, o consumo, a
liberação no meio ambiente e o descarte de
organismos geneticamente modificados – OGM
e seus derivados ...
Da classificação de risco do
OGM
Para a classificação de risco, deve-se também
considerar:
a) a possibilidade de recombinação de seqüências
inseridas no OGM, levando à reconstituição
completa e funcional de genomas de agentes
infecciosos;
b) outros processos que gerem um genoma
infecciosos;
c) genes que codifiquem substâncias tóxicas aos
homens, aos animais, aos vegetais ou que
causem efeitos adversos ao meio ambiente;
d) genes de resistência a antibióticos de amplo
uso clínico.
Resolução Normativa Nº 02
Os OGM serão classificados em quatro classes de
risco, adotando-se como critérios o potencial
patogênico dos organismos doador e receptor, a(s)
seqüência(s) nucleotídica(s) transferida(s), a
expressão desta(s) no organismo receptor, o OGM
resultante e seus efeitos adversos à saúde humana
e animal, aos vegetais e ao meio ambiente.
Para genes que codificam produtos nocivos para a
saúde humana e animal, aos vegetais e ao meio
ambiente, o vetor utilizado deverá ter capacidade
limitada para sobreviver fora do ambiente de
contenção.
Todo organismo geneticamente modificado deverá
possuir um marcador capaz de identificá-lo dentre
uma população da mesma espécie.
Resolução Normativa Nº 5, de 12 de
março de 2008

Dispõe sobre normas para liberação

comercial de Organismos
Geneticamente Modificados e seus
derivados.
 SISTEMA DE BIOSSEGURANÇA DE OGM
Normas de
Biossegurança e
CTNBio avaliação de risco
Sócio-econômica e
interesse nacional

CNBS CIBio

Manutenção da
Biossegurança

OERF

Registro e Fiscalização
Resolução Normativa Nº 01, De 20 De Junho
De 2006
Art. 3º. A instituição que se dedique ao ensino, à
pesquisa científica, ao desenvolvimento tecnológico e à
produção industrial que utilize técnicas e métodos de
engenharia genética ou realize pesquisas com
Organismos Geneticamente Modificados (OGM) e seus
derivados deverá criar uma Comissão Interna de
Biossegurança (CIBio).
§ 1º. A instituição de que trata o caput deste artigo
indicará um técnico principal responsável para cada
projeto específico.
§ 2º. A instituição que pretender importar OGM e seus
derivados para uso em atividades de pesquisa deverá
instalar sua CIBio.
§ 3º. As instituições devem reconhecer o papel legal das
CIBios e sua autoridade e assegurar o suporte
necessário para o cumprimento de suas obrigações,
promover sua capacitação em biossegurança e
implementar suas recomendações, garantindo que elas
possam supervisionar as atividades com OGM e seus
derivados.
Resolução Normativa Nº 01, De 20 De Junho
De 2006

Art. 12. A instituição de direito público ou

privado que pretender realizar pesquisa em
laboratório, regime de contenção ou campo,
como parte do processo de obtenção de OGM
ou de avaliação da biossegurança de OGM, o
que engloba, no âmbito experimental, a
construção, o cultivo, a manipulação, o
transporte, a transferência, a importação, a
exportação, o armazenamento, a liberação no
meio ambiente e o descarte de OGM, deverá
requerer, junto à CTNBio, a emissão do
CQB.
Resolução Normativa Nº 01, De 20 De Junho
De 2006
Art. 13. As organizações públicas e privadas,
nacionais e estrangeiras, financiadoras ou
patrocinadoras de atividades ou ao ensino
com manipulação de organismos vivos, à
pesquisa científica e ao desenvolvimento
tecnológico e à produção industrial, devem
exigir a apresentação de CQB, sob pena de se
tornarem co-responsáveis pelos eventuais
efeitos decorrentes do descumprimento do
Decreto nº 5.591, de 22 de novembro de 2005.

Parágrafo único. A instituição que pretender

importar OGM e seus derivados para uso em
atividades de pesquisa deverá requerer CQB.
Resolução Normativa Nº 01,
de 20 de Junho de 2006
Art. 14. O CQB será emitido pela
CTNBio mediante requerimento da
CIBio da instituição interessada, o
qual deverá estar acompanhado da
documentação que consta do Anexo
desta Resolução Normativa.
Resolução Normativa Nº 01,
de 20 de Junho de 2006
V. para a emissão do CQB, a CTNBio
considerará a competência e
adequação do quadro funcional e a
infra-estrutura disponível para os
trabalhos com OGM e seus
derivados.
Resolução Normativa Nº 01,
de 20 de Junho de 2006

Art. 15. O CQB será emitido para uma

unidade operativa dentro de uma
instituição, podendo ser esta unidade
constituída por um ou mais laboratórios
ou outro tipo de infra-estrutura de
funcionamento.

Parágrafo único. A instituição, de

acordo com suas necessidades, poderá
requerer um ou mais CQBs.
Resolução Normativa Nº 01,
de 20 de Junho de 2006
Art. 16. Sempre que uma instituição
detentora de CQB pretender alterar
qualquer componente que possa
modificar as condições aprovadas na
emissão do CQB, sua CIBio deverá
requerer revisão ou extensão de seu
CQB junto à CTNBio.
Resolução Normativa Nº 01,
de 20 de Junho de 2006
Art. 19. A CTNBio poderá, conjuntamente com um ou
mais órgãos e entidades de registro e fiscalização,
realizar vistorias às instituições detentoras de CQB,
devendo, com base nos seus resultados, manter,
suspender ou cancelar o CQB da instituição vistoriada.

Parágrafo único. A critério da CTNBio e considerando as

classes de risco do OGM e seus derivados, a emissão,
revisão extensão, suspensão e cancelamento de CQB
poderá depender de vistoria às instalações.
 Liberações comerciais – Vacinas
animais
Vacina Inativada Contra Circovirose Suína –
Ingelvac Circoflex
- Processo 01200.002191/2007-35

Vacina Inativada Contra Circovirose Suína –

Suvaxyn PCV2 One
Dose - Processo 01200.001967/2007-08

Vacina RECOMBITEK - vacina contra

cinomose, hepatite, adenovirose, parvovirose,
parainfluenza, coronavirose
e leptospirose caninas - Processo 01200.000292/98-92.

Vacina VAXXITEK MD/IBD - uma vacina viva

recombinante contra a doença de Marek
e doença de Gumboro
- Processo 01200.005090/2003-92.
Fluxo para OGM
Indicação CIBio
CQB
Aprovação CQB
Submissão Projeto
NB-1 – pode ser CIBio
NB-2 – CTNBio
Aprovação
Identificação das áreas no Laboratório
Trabalho seguindo as normas
Impacto da tecnologia DNA recombinante

Genética Humana
Mapeamento e clonagem de genes de doenças humanas
Diagnóstico de doenças genéticas
Determinação de paternidade
Terapia genética
Estudo dos genomas inteiros

Biotecnologia
Medicina
Indústria
Agricultura e Pecuária
Produção de plantas e animais transgênicos
CRONOLOGIA DAS INOVAÇÕES NO
DESENVOLVIMENTO
DE NOVAS DROGAS

*
Fonte: Lehman Brothers Pharmaceutical Research
 Promotor bacteriano
β gal β gal

Cadeia A da

Produção da insulina
Cadeia B
insulina
AmpR da insulina
Transformação em E.coli

humana em E.coli

Cultura de células

Região amino-
Purificação da proteína terminal
de fusão β gal-insulina da cadeia B
madura
β gal
Cadeia A Cadeia B

Tratamento com BrCN

Peptídeos
da β gal

Cadeia A Cadeia B
Purificação das cadeias A e B

Primeira proteína recombinante Re-enovelamento

e oxidação das cisteínas

licenciada para uso terapêutico Insulina ativa

Ponte dissulfeto
Biotecnologia Verde

Plantas produzindo antígenos para vacinas:

Raiva
E. coli enterotoxigênica
Vibrio cholerae
Hepatite B
HIV
Malaria
Biotecnologia Branca - Industrial

desenvolvimento sustentado

2010 – 20% da indústria química

aplicará biotecnologia
300 bilhões de dólares

Hoje apenas 2%

Exemplo de integração interdisciplinar –

biocatálise, nanobiotecnologia,
bioprocessamento e bioinformática
Biotecnologia branca -exemplo
Remoção de óleos e graxas das
fibras de algodão – solução alcalina
quente
Uso de enzimas reduz em 60% de
emissão de resíduos na água, 20%
de redução de energia e 20% de
redução de custos .
Biotecnologia branca
Requer desenvolvimento de novas
enzimas, processos, produtos e
aplicações.
Metagenomica promete fornecer novas
moléculas
Mas ........
Sistemas de expressão são necessários
para que cada nova enzima e molécula
bioativa seja um sucesso econômico
O cupim é capaz de gerar 2 litros de
hidrogenio da fermentação de uma folha de
papel, sendo um dos reatores mais eficientes
do mundo.Tem mais de 200 espécies de
bactérias em seu intestino ajudando a explorar
os potenciais metabolitos da lignocelulose.
Metagenômica

Metagenômica é a estratégia para

isolar, sequenciar e caracterizar DNA
extraidos de amostras do meio
ambiente. Esses dados com as
assinaturas de RNA 16S ribosomal é
utilizado para determinar o perfil da
comunidade microbiana
Biotecnologia Azul

Tecnologias que envolvam aplicação

de métodos de biologia molecular a
organaismos marinhos e de água
doce
Antibióticos gerados de
diatomáceas marinhas
 Oceanos

Oceanos ocupam 70 % da superfície

da terra
Produz metade do oxigênio da terra
Microrganismos constituem 90 % da
biomassa viva dos oceanos
Vírus matam 20% dessa biomassa
por dia
Reservatórios inexplorados de
diversidade genética da Terra
 Oceanos

1 ml de água contem milhões de

partículas virais
A abundancia é 15 vezes maior que
de bactérias e archaebactérias
55% da biomassa procariota
Biotecnologia Vermelha

Envolve uso de biotecnologia para

processos biomédicos
Produção de ovelha transgênica

Produção de proteínas de uso

farmacêutico

Imunização de animais por meio da

expressão transgênica de antígenos
virais
Biotecnologia Vermelha

Finalidades
Médicas
Fonte: 2008 Survey, Biotechnology, New Medicines in Development, PhRMA
Fonte: 2008 Survey, Biotechnology, New Medicines in Development, PhRMA
Obrigada!