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OBJETIVO.

 Comprender el fundamento y desarrollar el manejo de la técnica de la cromatografía de


exclusión.
 Realizar la desalación de una proteína.

INTRODUCCION.

Las técnicas cromatográficas están basadas en la separación de los componentes de una mezcla,
aprovechando la distribución de dichos componentes entre dos fases: la fase móvil y la fase
estacionaria. Generalmente, mediante el empleo de una columna que contiene la fase estacionaria,
los compuestos a separar son arrastrados por la fase móvil y son analizados a su paso por el
detector. Si la fase móvil es un gas, da lugar a la cromatografía de gases, mientras que, si es un
líquido, se denomina cromatografía líquida. La cromatografía de exclusión es un tipo de
cromatografía líquida en la cual la fase estacionaria es sólida y la fase móvil es líquida. Se utiliza el
término de “Cromatografía de exclusión por tamaño”. También se denomina “cromatografía de
permeabilidad sobre gel” (GPC) o de permeación en gel. Su principal aplicación es la separación de
las moléculas en función de su tamaño con la finalidad de estudiar el peso molecular y distribución
de los polímeros3). El inicio de esta técnica se estableció a partir de la preparación de microesferas
de geles de compuestos orgánicos y biológicos solubles en agua, los cuales se aplicaron a la
separación de polímeros disueltos en disolventes orgánicos utilizando un relleno de poliestireno. En
consecuencia, la técnica se denominó permeabilidad en gel (GPC). Actualmente esta tecnología es
rápida y permite trabajar a presiones elevadas mediante el empleo de nuevos rellenos con una
distribución de poros muy precisa y una resistencia mecánica apropiada para altas presiones. Las
principales características de esta técnica cromatográfica son: ‐ Fase estacionaria es inerte, por lo
que la columna no se desactiva. ‐ La muestra no interacciona químicamente con la fase estacionaria,
ni con la fase móvil. ‐ Los solutos son generalmente sustancias de peso molecular elevado (mayores
de 2000). Dependiendo de su medida y estructura, éstos se retienen o se eluyen a través de la
columna. No se pueden emplear gradientes de elución en la fase móvil.

RESULTADOS.

TABLA 1. DETERMINACION DEL VOLUMEN VACIO (Vo) DE LA COLUMNA.

Volumen de elución A615


(mL)
3 0.003
6 0.003
9 0.002
12 0.002
15 0
18 0.051
21 0.714
24 0.440
27 0.080
30 0.016
33 0.013
36 0.005
TABLA 2. SEPARACION DE SULFATO DE BARIO Y LA ALBUMINA
Volumen de A280 Masa del tubo Masa del tubo BaSO4
elución (mL) vacío (g) con precipitado
(g)
3 0 0 0 0
6 0 0 0 0
9 0 0 0 0
12 0 0 0 0
15 0 0 0 0
18 0.110 0 0 0
21 0.383 0 0 0
24 0.446 8.6176 0 0
27 0.093 8.8088 0 0
30 0.017 8.6706 0 0
33 0.014 8.5639 8.6044 40.5
36 0.07 6.2571 6.2855 28.4
39 0.06 5.2660 5.2955 29.5
42 0 8.6170 8.6542 37.2
45 0 7.9701 8.0439 72.8
48 0 8.6211 8.6739 52.8
51 0 6.3061 6.3710 38.8
54 0 7.7565 7.7923 0
57 0 0 0 0
60 0 0 0 0

a) ¿Qué sustancia eluyó primero y cual después?

La sustancia que eluyó primero fue la albúmina ya que esta es la molécula más grande y el
sulfato de bario es la sustancia que eluyó al final, ya que se trata de una sal cuya molecula es
muy pequeña.

b) ¿Qué es un gel? ¿Qué características debe tener el que es cromatográficamente útil?

Un gel es un sistema coloidal donde la fase continua es sólida y la dispersa es líquida. Los geles
presentan una densidad similar a los líquidos, sin embargo, su estructura se asemeja más a la de un
sólido.

Las características que debe tener un gel para la cromatografía deben ser que tenga un tamaño de
poro conocido, es decir, se debe saber la concentración exacta, este tamaño de poro dependerá del
tamaño de la molécula que se desea separar. También hay que considerar el agua retenida y el
volumen del lecho, esto para la determinación del volumen del gel y establecer las condiciones
correctas en la cromatografía.

c) Mencione por lo menos 3 aplicaciones diferentes a la usada en la práctica que puede tener esta
técnica.

 Determinación de peso molecular.


 Purificación de ADN y proteínas
 Purificacion de virus

d) Escriba las estructuras químicas del Sephadex, del Bio-Gel A y del Bio-Gel P indicando donde y de
qué forma se da el entrecruzamiento en cada caso y el tipo de enlace que se presenta.
Los geles de poliacrilamida Bio-Gel P, para la filtración en gel de alta resolución, se preparan por
copolimerización de acrilamida y N, N ' -metilenbisacrilamida. Geles Bio-Gel P, la red de
entrecruzamiento se logra entre la acrilamida y la bis acrilamida usando TEMED y persulfato de
amonio se usan como catalizadores.

Sephadex es una resina de filtración en gel preparada por entrecruzamiento de dextrano con
epiclorohidrina. Los diferentes tipos de Sephadex difieren en su grado de entrecruzamiento y, por
lo tanto, en su grado de hinchamiento y su rango de fraccionamiento molecular. Sephadex tiene
cinco tipos de G que van desde G-10 para moléculas pequeñas hasta G-75 para moléculas más
grandes.
DISCUCIÒN:

En esta práctica se hizo el empaquetamiento de la columna usando regulador y Sephadex G-25,


dejando sedimentar. Posteriormente se determinó el volumen vacío, esto se logró con dextrana
azul 2000 que es una molécula muy grande y esta es capaz de solo pasar por fuera del gel, esto
nos permite saber el volumen vacío, al observar la absorbancia de los tubos con el eluyente se
observó el tubo con mayor absorbancia y ese sería nuestro volumen vacío, de acuerdo con la
tabla 1 el volumen vacío fue de 24 mL.

Después se seleccionaron 25 tubos y se pesaron, se agregó la muestra en la columna la cual


contiene sulfato de amonio y albumina se eluyò y los tubos obtenido se leyó su absorbancia en
aquellos tubos donde se obtuvieron las eluciones finales se les agrego cloruro de bario y en
aquellos donde hubo precipitado se centrifugaron y se obtuvieron sales, se pesaron y se obtuvo
la diferencia y se determinó el peso de la sal.

Para la determinación del volumen total se usaron los valores del diámetro y longitud de la
columna, el volumen se calculó de la siguiente manera; π x r2 x h. El valor fue de 61 mL.

El volumen del gel se obtiene usando los valores de agua retenida y volumen de lecho y el valor
fue de 12. 2 y el volumen interno se calcula por diferencia en la formula y el valor fue de 24.76

La razón por la cual los tubos finales se les agrego cloruro de bario fue porque en ellos estaba
presente el sulfato de amonio ya que al ser una molécula pequeña tuvo una elución lenta a
comparación de la albumina que es más grande, al agregar el cloruro de bario reacciono con el
sulfato de amonio dando como producto cloruro de amonio y sulfato de bario que precipita y de
esta forma determinar el volumen en el cual eluyo la sal.

Los resultados obtenidos fueron correctos ya que en teoría la albumina debería ser la primera en
eluir ya que al ser una molécula grande no penetra los poros del gel y solo recorre fuera de ello
esto le permite recorrer menos distancia a comparación de la sal de amonio que si penetra el gel
ya que la molécula es pequeña, al penetrar los poros del gel hace que la sal recorra mucho
mayor distancia que la albumina, esto se llevó correctamente en la práctica. Hubo algunos
problemas con la practica ya que al introducir la muestra salpico en las paredes de la columna
esto pudo provocar errores en la determinación.

BIBLIOGRAFIA.

https://upcommons.upc.edu/bitstream/handle/2099/13132/LA%20CROMATOGRAF%C3%8DA%
20DE%20EXCLUSI%C3%93N,%20AN%C3%81LISIS%20DE%20LA%20DISTRIBUCI%C3%93N%20DE%
20PESOS.pdf

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