UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

DEPARTAMENTO DE FÍSICA

Espalhamento dinâmico de luz e a calibração de uma pinça magnética

Rayane Maria de Oliveira

Prof. Márcio Santos Rocha (Orientador)

Trabalho Final da Disciplina Projeto Orientado

(FIS 399).

Viçosa-Minas Gerais-Brasil
Novembro-2018
 UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FÍSICA
RESUMO

Nas últimas décadas vários métodos de espectroscopia foram desenvolvidos para a medição
de propriedades mecânicas de moléculas únicas. Um desses métodos é o da Pinça Magnética,
que exerce força e/ou torque sobre uma ou sobre um grupo de moléculas. No experimento clás-
sico, uma ponta da molécula é presa a uma lamínula e a outra ponta é presa a uma microesfera
paramagnética, e com o auxílio de imãs ou fios transportando correntes podemos manipular a
microesfera e obter informações da molécula. O campo magnético gerado pelo imã exerce uma
força sobre a microesfera que pode aumentar ou diminuir movendo-se o imã para perto ou longe
da lamínula/amostra, essa força pode ser de aproximadamente 10fN até 100pN dependendo da
configuração do imã. Nos experimentos mais comuns de pinça magnética, a microesfera é
iluminada por uma luz que fica localizada acima dos imãs, produzindo imagens de difração.
Comparando essas imagens de difração com a imagem de difração de uma microesfera de re-
ferência, que fica presa na lamínula, podemos descobrir a distância que a molécula foi estirada.
Além disso, como a microesfera está em uma solução, ela possui movimento Browniano, que
depende da força aplicada sobre ela pelos ímãs. Por meio destas informações, podemos cons-
truir um gráfico de força por extensão das moléculas, extraindo propriedades da mesma. O
próximo passo deste trabalho é implementar a calibração simultânea da força e da posição da
microesfera utilizando espalhamento dinâmico de luz, o que evitará o trabalhoso processo de
análise digital das imagens coletadas no experimento. Para tanto, será utilizado um laser e um
detector de fótons acoplados ao microscópio óptico. A luz espalhada pela microesfera será co-
letada pelo detector, e analisada com o auxílio de um correlacionador digital. As flutuações
de intensidade da luz fornecerão a força aplicada sobre a microesfera, enquanto a intensidade
média espalhada fornecerá a posição da mesma. Testes preliminares já foram executados no
laboratório e os resultados são promissores.
Conteúdo
1 Introdução 4

2 Objetivos 4

3 Revisão bibliográfica 5
3.1 Princípio de funcionamento das pinças magnéticas . . . . . . . . . . . . . . . 5
3.2 Preparação das amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.3 Técnicas experimentais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.3.1 Imagem de difração . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.3.2 Pinça magnética lateral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
3.3.3 Espalhamento dinâmico de luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

4 Resultados e Conclusões 8

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1 Introdução
A micromanipulação de moléculas únicas é uma importante técnica experimental que vem
ganhando destaque devido às variadas aplicações, em especial em Física da Matéria Mole e
em Física Biológica. Com o uso dessa técnica de espectroscopia de força de moléculas únicas
é possível analisar, por exemplo, as variações nas propriedades mecânicas de um polímero, o
que permite avaliar as mudanças estruturais durante uma interação deste polímero com outra
molécula [1]. Em 1969 Ashkin e colaboradores desenvolveram o método de pinçamento óp-
tico nos Estados Unidos, onde utilizaram laser fortemente focalizado para o aprisionamento de
partículas, que ajudou em estudos de sistemas biológicos na escala de micrômetros [2].
Além do método de pinça óptica existem vários outros, e o que estudamos neste trabalho é
o de pinçamento magnético. As Pinças Magnéticas, são instrumentos que utilizam um campo
magnético externo para aplicar força em uma microesfera paramagnética que está ligada a uma
das extremidades de uma molécula, no nosso caso o DNA, enquanto a outra ponta do biopolí-
mero está fixa em uma lamínula sob o estágio do microscópio. Este campo pode ser gerado por
diferentes configurações, sejam elas: imãs permanentes ou fios transportando correntes, desde
que sejam posicionados de forma correta, otimizando o gradiente de campo magnético na região
da amostra. Com esse aparato conseguimos obter a curva de força por extensão, que permite
determinar as propriedades mecânicas do complexo formado entre a molécula de DNA e um
ligante qualquer [3].
Assim, neste trabalho iniciamos explicando a ideia básica de uma pinça magnética e a téc-
nica de difração por imagem, que utiliza a calibração de Gosse e Croquete para obter a extensão
da molécula de DNA. Utilizamos a técnica de estiramento da molécula de DNA lateralmente,
ou seja, puxamos o DNA perpendicularmente ao eixo óptico (eixo z). E por último explica-
mos a ideia por trás da calibração da pinça magnética com espalhamento dinâmico de luz, os
resultados iniciais e as propostas futuras para esta nova ferramenta.

2 Objetivos
Este trabalho tem como objetivo principal estabelecer um padrão de calibração para a Pinça
Magnética baseado em espalhamento dinâmico de luz, para então obtermos as propriedades
mecânicas básicas da molécula de DNA, que são o comprimento de contorno e comprimento de
persistência. Primeiramente calibramos a pinça através da comparação da imagem de difração
da microesfera de referência com uma microesfera que possui uma molécula de DNA ligada a
ela. Em seguida, damos início a utilização da técnica de espalhamento dinâmico de luz para
obter resultados mais precisos na determinação da posição da microesfera e da força aplicada .

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3 Revisão bibliográfica

3.1 Princípio de funcionamento das pinças magnéticas

A montagem principal de uma pinça magnética clássica é mostrada na figura 1, que consiste
basicamente de um microscópio, de espelhos, de uma câmera CCD, de um computador, e o
fundamental, imãs.

Figura 1: Montagem experimental de uma pinça magnética clássica [3]

Com esta montagem conseguimos estirar a molécula de DNA, que tem uma das pontas
presa na superfície da lamínula e outra presa na microesfera magnética por meio de ligações
não-covalentes que resistem forças na ordem de 100 pN (piconewtons). O campo magnético
gerado pelos imãs pode exercer força de 10 fN (femtonwetons) até 100 pN na microesfera, que
podemos calcular através da expressão [4]:

→ 1→ → →
F= ∇ (m . B) (1)
2
→ →
onde m é o momento magnético induzido da microesfera pelo campo magnético externo, B .
Esta força é devido ao momento de dipolo dos imãs, desde que o campo magnético dos mesmos
seja não-uniforme [4]. Observe também que podemos aplicar uma ampla gama de forças sobre
a microesfera, movendo os imãs para cima ou para baixo, a medida que o gradiente local do
campo magnético é diminuído ou aumentado.
Além de estudarmos o estiramento da molécula de DNA, a pinça magnética tem a grande
vantagem de poder estudar a rigidez e o grau de superenrolamento do DNA através da rotação
do campo magnético externo, ou seja, da rotação dos imãs [4], só podemos fazer isto porque
o torque aplicado pelo DNA na microesfera é insignificante comparado com o imposto pelo
campo magnético externo.

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 Para isto, precisamos calcular a força que os imãs exercem sobre a microesfera magnética,
e sabemos que ela depende da flutuação da microesfera, < δ x2 >, e da extensão da molécula de
DNA, l, através da expressão [5]:

KB T l
F= (2)
< δ x2 >
Utilizamos a técnica de imagem de difração e estiramento lateral da molécula de DNA
para obter essas informações. Estamos aplicando a técnica de espalhamento dinâmico de luz
para obter melhores resultados, isto evitará ainda o trabalhoso processo de análise digital das
imagens coletadas no experimento. Estas técnicas serão explicadas na seção 3.3.

3.2 Preparação das amostras

O nosso porta - amostra consiste de uma lamínula, onde é colado em seu centro, com pa-
rafina, um anel de borracha do tipo O-ring. As amostras consistem de uma solução aquosa de
PBS (Phosphate Buffer Saline) e de NaCl = 150mM, além das microesferas magnéticas e do
DNA. Assim, conseguimos prender uma ponta do DNA na lamínula do porta – amostra e a outra
ponta na microesfera magnética, através de um protocolo de solução descrito na referência [6].
Então, com a pinça magnética realizamos os estiramentos da molécula de DNA.

3.3 Técnicas experimentais

3.3.1 Imagem de difração

Nesta técnica a microesfera é iluminada por uma luz (LED) colocada acima dos imãs, e
a interferência desta luz com a luz espalhada pela microesfera produz imagem de anéis de
difração concêntricos no plano focal da objetiva. O método de Gosse e Croquete nos permite
obter a extensão do DNA. Utilizando a imagem de difração, eles observaram que quando o plano
focal da objetiva era deslocado com precisão, a imagem dos anéis de difração da microesfera
amarrada ao DNA mudava, como na figura 2 A-D [4].

Figura 2: A-D: Imagem do padrão de difração da microesfera, e o perfil de calibração [3]

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 Desta forma, eles criaram um perfil de calibração, figura 2, que nos permite determinar a
extensão do DNA, relacionando a imagem de difração da microesfera de referência que está
localizada (presa) na lamínula com a distância percorrida pela microesfera amarrada ao DNA,
como representado na figura 3.

Figura 3: Representação esquemática da microesfera amarrada a molécula de DNA e uma mi-

croesfera de referência.

Com essa técnica e com a utilização de programas computacionais, como o ImageJ que
calcula a posição do centro de massa da microesfera fornecendo a sua posição e o KaleidaGraph
para construir o gráfico, conseguimos calcular a força aplicada pelos imãs e a extensão vertical
média da molécula de DNA.

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3.3.2 Pinça magnética lateral

Na pinça magnética lateral a montagem do experimento é a mesma feita para a técnica de

imagem de difração, porém neste caso o ímã é deslocado de forma que a microesfera paramag-
nética se movimenta na superfície da amostra, ou seja, perpendicular ao eixo óptico (eixo z na
Figura 3). E para obter a extensão do DNA utilizamos a expressão:

p
l= x2 + y2 (3)

3.3.3 Espalhamento dinâmico de luz

Quando a microesfera magnética é iluminada por uma fonte de luz, no nosso caso o la-
ser vermelho de He-Ne, ela espalha a luz em todas as direções. A técnica de Espalhamento
Dinâmico de Luz (Dynamic Light Scattering, DLS), também chamada de Espectroscopia de
Correlação de Fótons (Photon Correlation Spectroscopy, PCS), consiste na análise da intensi-
dade da luz espalhada, fornecendo informações através do movimento da microesfera, como o
tamanho da microesfera e de sua posição relativa ao laser [7].
Como a microesfera executa movimento Browniano na solução em que se encontra, a sua
posição flutua no tempo, acarretando flutuações da intensidade da luz espalhada por ela, que
esta relacionada com a força que a pinça magnética exerce sobre a microesfera.
Para obter a posição da microesfera, nós utilizamos a intensidade média espalhada, pois
este depende da posição da microesfera em relação ao feixe de He-Ne. Para isto precisamos
do perfil de retroespalhamento, que é uma calibração medindo a intensidade da luz espalhada
enquanto a microesfera é deslocada em relação ao feixe de He-Ne. Para obtermos estas in-
formações utilizamos o programa Brookhaven-Intruments- Dynamic light scattering software
que é o programa do correlacionador, juntamente com o detector de fótons BI-APD, nos dando
graficamente a curva do perfil de retroespalhamento da microesfera [7, 8].

4 Resultados e Conclusões
Adaptando a ideia do método de Gosse e Croquete, obtivemos um resultado satisfatório para
a técnica de imagem de difração. Com o deslocador do microscópio fomos estirando a molécula
de DNA, fazendo filmagens de 10 segundos e e deslocando de 2 a 3 µm para cada vídeo gravado.
Então, comparando estas filmagens com as filmagens que foram feitas da microesfera que estava
presa na lamínula tínhamos uma noção do quanto a molécula de DNA foi estirada, como mostra
a Figura 4:
Sabendo da extensão da molécula de DNA,l, e da flutuação da microesfera, < δ x2 >, através
da equação (2) conseguíamos obter o gráfico de força por extensão do DNA e tirar as variáveis
de interesse, que eram o comprimento de persistência, A, e o comprimento de contorno, L,

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Figura 4: Lado esquerdo: imagem da calibração, quando a microesfera estava presa na lamínula;
Lado direito: microesfera grudada com a molécula de DNA.

através do ajuste (Equação 3) feito utilizando o modelo Worm-Like Chain (WLC) que descreve
o comportamento semi-flexível de polímeros [9].
 
KB T z 1 1
F= + − (4)
A L 4(1 − Lz )2 4
A Equação 3 é o ajuste do modelo WLC para a molécula de DNA,onde z é a extensão da
molécula na direção do eixo z. Obtivemos com sucesso a curva característica da força por
extensão do DNA, como mostra a Figura 5.

Figura 5: Curva de força por extensão da molécula de DNA, onde o comprimento de contorno
é L = (19, 4 ± 4)µm e de persistência é A = (34 ± 1)nm.

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 Porém a determinação da extensão do DNA, l, através de comparação de imagens não pode
ser feita através do olho humano, pois não conseguimos determinar com precisão este valor.
Assim, estamos utilizando o o software ImageJ para relacionar o nível de cinza das filmagens
com a intensidade de luz na amostra da microsfera magnética. E através da expressão

C = (I − I0 )/I0 (5)

onde c é o contraste da intensidade, I é a intensidade e I0 é a intensidade média, queremos

relacionar o valor do contraste da intensidade da microesfera de calibração com o valor da
microesfera com DNA, para obter a extensão da molécula de DNA [10].
Com a técnica da pinça magnética lateral também conseguimos obter a curva característica
de um DNA e tirar as informações de interesse como mostra a Figura 6. Porém alguns ajustes
ainda devem ser feitos, pois a microesfera não se move apenas na superfície, ela também possui
um deslocamento no eixo óptico [11].

Figura 6: Gráfico de um DNA com comprimento de contorno L = (22, 3 ± 2)µm e comprimento

de persistência A = (2.8 ± 1)nm.

Porém essas técnicas são muito trabalhosas e agora estamos também adaptando à pinça
magnética para obter a extensão da molécula de DNA,l, e a força sobre a mesma, com a técnica
de espalhamento dinâmico de luz. A Figura 7 mostra o esquema experimental que estamos
utilizando em nossas medidas.

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 Figura 7: Montagem experimental.

As linhas pontilhadas representam o microscópio, que contém a amostra com a microesfera

magnética, e acima possui o imã permanente que gera campo magnético. Dois lasers atravessam
a objetiva, o laser de He-Ne que é utilizado para o estudo do movimento da microesfera através
da luz espalhada, nos fornecendo os dados da pinça magnética e o laser infravermelho (IV) que
é usado para pinçar a microesfera para conseguirmos calibrar a pinça óptica, pois construímos
esta montagem tanto para o uso da pinça magnética quanto para o uso da pinça óptica.
E1 , E2 , E3 , E4 , E5 , E6 e E7 são espelhos, sendo E4 um espelho dicróico, que reflete o laser
IV mas são transparente para o laser de He-Ne. L é uma lente que serve para colimar o feixe de
laser IV e F é o filtro de densidade neutra.
E em uma saída do microscópio conectamos a câmera CMOS que leva a imagem da amostra
para análise através de um computador e na outra saída conectamos detector de fótons BI-
APD ligado ao correlacionador TuboCorr digital autocorrelator, que fornece as funções de
correlação da intensidade da luz espalhada pela microesfera em função do tempo.
A Figura 8, mostra o feixe do laser He-Ne espalhado por uma microesfera.

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 Figura 8: Feixe de luz espalhada devido ao laser He-Ne.

Como a microesfera executa movimento Browniano na solução, observamos que sua posi-
ção ficava flutuando com o tempo e a luz espalhada por ela foi detectada pelo detector de fótons
BI-APD. Então com a aparelhagem toda pronta, podemos com ajuda de programas computa-
cionais obter a altura que a microesfera se encontra através da intensidade média espalhada, e
também podemos tirar a força que o imã gera sobre a microesfera presa a molécula de DNA.
Uma observação importante é que estamos trabalhando com amostras monodispersas, assim,
não precisamos calcular o tamanho das microesferas, que vem com um raio de 1,5 µm pelo
fabricante.
Além de aperfeiçoar esta nova técnica, nosso próximo passo será também torcer a molécula
de DNA com ajuda do motor Brushed Motor Controller- KDC101 da ThorLabs para estudar
quantidades como rigidez torcional e o grau de superenrolamento de DNA. Já estamos execu-
tando alguns testes e os resultados estão sendo promissores.

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Referências
[1] Keir C Neuman and Attila Nagy. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers,
magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature methods, 5(6):491, 2008.

[2] Arthur Ashkin. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Physical
review letters, 24(4):156, 1970.

[3] Jong Min Sung. Single molecule studies using magnetic tweezers.

[4] ID Vilfan, J Lipfert, DA Koster, SG Lemay, and NH Dekker. Magnetic tweezers for
single-molecule experiments. In Handbook of single-molecule biophysics, pages 371–
395. Springer, 2009.

[5] Zhongbo Yu, David Dulin, Jelmer Cnossen, Mariana Köber, Maarten M van Oene, Orkide
Ordu, Bojk A Berghuis, Toivo Hensgens, Jan Lipfert, and Nynke H Dekker. A force cali-
bration standard for magnetic tweezers. Review of scientific instruments, 85(12):123114,
2014.

[6] Paulo Roberto Brasil de Oliveira Marques. Construção de genossensor amperométrico

para diagnóstico da hepatite c baseado em monocamadas auto montadas e detecção não
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[7] Márcio Santos Rocha. Pinças Ópticas: Experimento, Teoria e Aplicação no estudo da
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[8] PS Alves and MS Rocha. Videomicroscopy calibration of optical tweezers by position

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[9] John F Marko and Eric D Siggia. Stretching dna. Macromolecules, 28(26):8759–8770,
1995.

[10] Ulisses Moreira Silveira Andrade. Microscopia de desfocalização e seus limites de vali-
dade: um estudo experimental. 2010.

[11] J Madariaga-Marcos, S Hormeño, CL Pastrana, GLM Fisher, MS Dillingham, and Fer-

nando Moreno-Herrero. Force determination in lateral magnetic tweezers combined with
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