Guia de Practicas Bioquimica 2019-I

3B-2
GUÍA DE PRÁCTICAS
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MÉDICA
LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA
BIOQUÍMICA
2019
1
INDICE
PAGINA CARATULA 1
INDICE 2
INTRODUCCIÓN 4
PAUTAS PARA INFORME DE LABORATORIO - NORMAS DE BIOSEGURIDAD 5
SIMBOLOS DE SEGURIDAD 6
PRÁCTICA N°01:
MATERIAL E INSTRUMENTOS DE LABORATORIO, USO CORRECTO
Y MANIPULACIÓN. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES 8
PRÁCTICA N°02:
ESPECTROFOTOMETRÍA: FACTOR Y CURVA DE CALIBRACIÓN 14
PRÁCTICA N°03:
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA I: SUSTRATO Y PH 17
PRÁCTICA N°04:
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA II: ENZIMA,
TIEMPO, TEMPERATURA 22
PRÁCTICA N°05:
RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS 26
PRÁCTICA N°06:
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN 30
PRÁCTICA N°07:
AISLAMIENTO DE GLUCÓGENO HEPÁTICO - CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA 33
SEMANA N° 08 PRIMER EXAMEN ESCRITO
PRÁCTICA N°09:
HIDRÓLISIS DE LAS GRASAS POR ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA 36
PRÁCTICA N°10:
LÍPIDOS: SOLUBILIDAD Y SAPONIFICACIÓN 39
PRÁCTICA 11:
COLESTEROL OBTENCIÓN E IDENTIFICACIÓN 41
PRÁCTICA N°12:
IDENTIFICACIÓN Y VALORACIÓN DE LA VITAMINA C EN CÍTRICOS 44
2
PRÁCTICA N°13:
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS: OVOALBÚMINA 47
PRÁCTICA N°14:
DETERMINACIÓN DE ACIDO URICO 50
PRÁCTICA N°15:
DETERMINACIÓN DE ADN 53
3
INTRODUCCIÓN
Uno de los cursos fundamentales en las carreras de la salud es la Bioquímica, el cual

permite comprender los mecanismos de formación, transformación y utilización de los
distintos nutrientes que componen un determinado alimento; así como también como se
interrelacionan las distintas vías metabólicas.
La presente Guía de Prácticas de Bioquímica, está elaborada de acuerdo al Programa de

Bioquímica para la Escuela Académico Profesional de Tecnología Médica: Laboratorio
Clínico y Anatomía Patológica y contiene una serie experimentos de Laboratorio de
diferentes grados de dificultad, que permiten a los estudiantes adquirir habilidades y
destrezas para el análisis individual del material orgánico e inorgánico, al mismo tiempo
que complementan los conceptos fundamentales impartidos en las clases teóricas.
Con los principios aplicados en esta guía, los estudiantes los podrán orientarse en la
realización de trabajos de investigación que incrementen sus conocimientos bioquímicos.
Cada práctica tiene un pequeño resumen teórico.
Al iniciar cada práctica el alumno tendrá una pequeña orientación sobre la importancia
del análisis y de la utilidad del ensayo contenida en el Marco Teórico, seguidamente se
mencionarán los objetivos que se alcanzarán y que van acorde al tema asignado en el
Silabo del curso de Bioquímica.
En cada práctica también se indicará la lista de reactivos y materiales de Laboratorio a

utilizar, el procedimiento a seguir, los principales resultados a obtener, una pequeña lista
de preguntas contenidas en un cuestionario que se complementará sus conocimientos y
por último la bibliografía recomendada donde se apoyará cada práctica.
Los experimentos descritos son de fácil ejecución y permiten al estudiante desarrollar su

capacidad y criterio científico. Los temas de laboratorio se han diseñado teniendo en
consideración la accesibilidad de material e instrumentos con que cuenta la universidad.
La presente Guía orienta el procedimiento de las prácticas que complementa el

aprendizaje de la Bioquímica básica en relación del desarrollo teórico del curso.
Los autores agradecen anticipadamente la(s) crítica(s) o sugerencias que puedan tener
los lectores que sirvan para mejorar el presente trabajo.
Mg. Q.F. JOHANNA IVONNE REYES CASTILLO

Mg. Q.F RUBEN VALDIVIESO IZQUIERDO
4
PAUTAS PARA EL INFORME DE LABORATORIO
Cada estudiante debe presentar el informe de la práctica, a la semana siguiente del

mismo, teniendo en cuenta los siguientes puntos:
1. Título de la práctica.
2. Breve marco teórico.
3. Objetivo general.
4. Reacciones químicas que ocurren.
5. Diagrama de flujo del procedimiento.
6. Tabla de datos, resultados y observaciones.
7. Cálculos.
8. Gráficas, (si la práctica lo requiere)
9. Análisis de resultados y de gráficas.
10. Aplicaciones en la profesión.
11. Conclusiones.
12. Recomendaciones (posibles errores ocurridos).
13. Bibliografía.
NORMAS DE BIOSEGURIDAD
En el laboratorio existe una serie de normas de bioseguridad las cuales pueden evitar o
disminuir los riesgos de accidentes debido a la mala manipulación o desconocimiento de
lo que se realiza.
NORMAS PERSONALES
• Cada grupo de prácticas se responsabilizará del orden de su zona de trabajo y del

material que utilizará.
• Utilizar obligatoriamente mandilones para evitar posibles salpicaduras de
sustancias químicas lleguen a la piel y deterioro en sus prendas de vestir.
• Usar lentes de bioseguridad.
• Mantener recogido el cabello largo, en todo el proceso de la práctica.
• En el laboratorio está terminantemente prohibido fumar, beber y ni comer.
• Usar guantes de asbesto, para el aislamiento térmico, al manipular material
caliente.
• No manipular con las manos y menos con la boca, los productos químicos.
• No pipetear con la boca, se debe utilizar una pera manual o dispositivo que se
disponga para tal fin.
• Nunca adicionar agua sobre los ácidos, si se requiere diluir; siempre verter con
cuidado el ácido sobre el agua. No olvidar que hay desprendimiento de calor.
• Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) no deben estar cerca de
fuentes de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hará al baño
María, nunca directamente a la llama.
• Si algún ácido o producto corrosivo, tocase su piel, lavar inmediatamente con
abundante agua y avisar al profesor.
• Al preparar cualquier disolución se colocará en un frasco limpio y rotulado
convenientemente.
5
• Manipular con cuidado materiales punzocortantes
• Dejar enfriar el vidrio antes de tocarlo para evitar posibles quemaduras.
• Al calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo:
o fijarte que la boca del tubo de ensayo no apunte a ningún compañero.
Puede hervir el líquido y salir disparado, por lo que podrías ocasionar un
accidente.
o Calentar el contenido por la zona lateral del tubo, nunca por el fondo;
agitar constantemente y suavemente.
• Al pesar masas de productos químicos con balanza, se colocará papel de filtro u
otro sobre los platos de la misma y si es necesario, si el producto a pesar fuera
corrosivo, se utilizará un vidrio de reloj.
• Mantener en todo momento el orden y disciplina.
SÍMBOLOS DE RIESGO
Para manejar con seguridad las sustancias químicas se han ideado diversos códigos
dependiendo de la casa fabricante, pero en general los sistemas clasifican las sustancias
en las siguientes categorías:
• Sustancias explosivas
Peligro. Este símbolo señaliza sustancias que pueden explotar bajo determinadas
condiciones. Ejemplo: dicromato de amonio.
Precaución. Evitar choques, percusión, fricción, formación de chispas y contacto
con el calor.
• Sustancias oxidantes (comburentes)

Peligro: Los compuestos comburentes pueden inflamar sustancias combustibles
o favorecer la amplitud de incendios ya declarados, dificultando su extinción.
Ejemplo: permanganato de potasio, peróxido de sodio. Precaución: Evitar
cualquier contacto con sustancias combustibles.
• Sustancias fácilmente inflamables

Sustancias autoinflamables: Ejemplo: alquilos de aluminio, fósforo. Precaución.
Evitar contacto con el aire. Gases fácilmente inflamables: Ejemplo: butano,
propano. Precaución. Evitar la formación de mezclas inflamables gas-aire y
aislar de fuentes de ignición. Sustancias sensibles a la humedad: Productos
químicos que desarrollan emanaciones de gas inflamable al contacto con el
agua. Ejemplo: litio, borohidruro de sodio. Precauciones: evitar contacto con
agua o con humedad.
• Líquidos inflamables
En términos muy sencillos, los líquidos inflamables son aquellos que fácilmente
pueden arder. El que un líquido arda con más o menos facilidad depende de su
punto de llama. Entre más bajo sea este punto más fácilmente arde el reactivo
y por lo tanto mayor cuidado se ha de tener en su manejo, almacenamiento y
transporte. Con estos líquidos se ha realizado una clasificación teniendo en
cuenta lo anteriormente expuesto y su solubilidad en el agua.
6
• Sustancias tóxicas
Peligro: Tras una inhalación, ingestión o absorción a través de la piel pueden
presentarse, en general, trastornos orgánicos de carácter grave o incluso la
muerte. Ejemplo: trióxido de arsénico, cloruro de mercurio (II). Precaución:
Evitar cualquier contacto con el cuerpo y en caso de malestar acudir
inmediatamente al médico.
• Sustancias nocivas
Peligro: La incorporación de estas sustancias por el organismo produce efectos
nocivos de poca trascendencia. Ejemplo: tricloroetileno. Precaución: Evitar el
contacto con el cuerpo humano, así como la inhalación de vapores. En caso de
malestar acudir al médico.
• Sustancias corrosivas
Peligro: Por contacto con estas sustancias se destruye el tejido vivo y también
otros materiales. Ejemplo: bromo, ácido sulfúrico. Precaución. No inhalar los
vapores y evitar el contacto con la piel, los ojos y la ropa.
• Sustancias irritantes
Peligro: Este símbolo destaca en aquellas sustancias que pueden producir acción
irritante sobre la piel, los ojos y sobre los órganos respiratorios. Ejemplo:
amoníaco, cloruro de bencilo. Precaución. No inhalar los vapores y evitar el
contacto con la piel y los ojos.
7
PRÁCTICA N° 01
MATERIAL DE LABORATORIO, INSTRUMENTOS. USO CORRECTO Y MANIPULACIÓN

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES.
1.1. MARCO TEÓRICO

Los Laboratorios son unidades de trabajo académico adscritos a los Departamentos de la
Escuela cuya finalidad esencial es asegurar a los docentes-investigadores y a los alumnos
de ésta las condiciones para el cumplimiento de actividades de investigación y de prácticas
asociadas a las asignaturas del Plan de Estudios vigente que así lo exigen. Para el desarrollo
de las prácticas y las actividades del laboratorio se requieren diversos materiales, equipos
e instrumentos, entre los principales tenemos:
Materiales de Vidrio: Los materiales en los que se combinan las sustancias están fabricados
con vidrio óptico, vidrio de Jena o vidrio duro. Éstos, debido a su composición, son muy
resistentes a la acción de los reactivos químicos y/o los cambios bruscos de temperatura.
Algunos nombres comerciales de estos tipos de vidrio son el Pyrex y el Kimax. Algunos
ejemplos de estos materiales son: Tubo de ensayo; Vaso de precipitados; Matraz
Erlenmeyer; Matraz Base plana; Matraz de destilación; Balones, etc. Los materiales de
vidrio que no se utilizan para calentar sustancias están elaborados con otros tipos de vidrio.
Materiales para medir volúmenes: Los materiales para medir volúmenes son de vidrio
o de plástico transparente y están graduados. Algunos de estos materiales son: Probeta;
Pipeta; Bureta; Matraz aforado.
Materiales de soporte y sujeción: En cuanto a los materiales de soporte y sujeción, con

excepción de la gradilla, que puede ser de madera o de plástico, son de metal. Algunos de
los materiales que pertenecen a esta clasificación son: Soporte universal con anillo de
fierro, pinzas para bureta y tela de alambre con asbesto; Gradilla para tubos de ensayo;
triángulo de porcelana; Pinzas para tubo de ensayo; Pinzas para crisol; Pinzas de 2 o 3 dedos
con nuez.
Otros materiales del Laboratorio son: Mechero de alcohol, Embudo, luna de reloj; Cápsula
de porcelana, Mortero con pilón, Cuba hidroneumática, Cucharilla de combustión, Agitador
de vidrio, Frascos goteros, Espátula Tapones, Escobillones.
Instrumentos para medir: Los principales instrumentos para medir son: Balanza de dos
platillos y marco de pesas, Regla de 1m, Vernier Balanza triple brazo, Dinamómetro,
Termómetro.
Otros instrumentos y aparatos que usamos son: Lupa Lentes; Pinzas; Microscopio;
Agitador; Aguja Para Disección; La bagueta; Balanza eléctrica; Balanza analítica; Pipetas
automáticas; Bisturí.
F-CV3-3B-2 8 Rev. Junio 2007

Preparación de Soluciones
Las soluciones, son mezclas homogéneas de sustancias en iguales o distintos estados de

agregación. La concentración de una solución constituye una de sus principales características.
Bastantes propiedades de las soluciones dependen exclusivamente de la concentración. Su

estudio resulta de interés tanto para la física como para la química. Algunos ejemplos de
soluciones son: agua salada, Hidróxido de sodio y bicromato de potasio. Todas las propiedades de
las soluciones: color, sabor, densidad, punto de fusión y ebullición dependen de las cantidades
que pongamos de los diferentes solutos. La sustancia presente en mayor cantidad suele recibir el
nombre de solvente, y a la de menor cantidad se le llama soluto y es la sustancia disuelta. El
soluto puede ser un gas, un líquido o un sólido, y el solvente puede ser también un gas, un líquido
o un sólido. El agua con gas es un ejemplo de un gas (dióxido de carbono) disuelto en un líquido
(agua). Las mezclas de gases, son soluciones. Las soluciones verdaderas se diferencian de las
soluciones coloidales y de las suspensiones en que las partículas del soluto son de tamaño
molecular, y se encuentran dispersas entre las moléculas del solvente.
Algunos metales son solubles en otros cuando están en el estado líquido y solidifican manteniendo
la mezcla de átomos. Si en esa mezcla los dos metales se pueden solidificar, entonces serán una
solución sólida.
Propiedades físicas de las soluciones: Cuando se añade un soluto a un solvente, se alteran

algunas propiedades físicas del solvente. Al aumentar la cantidad del soluto, sube el punto de
ebullición y desciende el punto de solidificación. Así, para evitar la congelación del agua utilizada
en la refrigeración de los motores de los automóviles, se le añade un anticongelante (soluto).
Pero cuando se añade un soluto se rebaja la presión de vapor del solvente. Otra propiedad
destacable de una solución es su capacidad para ejercer una presión osmótica. Si separamos dos
soluciones de concentraciones diferentes por una membrana semipermeable (una membrana que
permite el paso de las moléculas del solvente, pero impide el paso de las del soluto), las moléculas
del solvente pasarán de la solución menos concentrada a la solución de mayor concentración,
haciendo a esta última más diluida. Estas son algunas de las características de las soluciones:
- Las partículas de soluto tienen menor tamaño que en las otras clases de mezclas.
- Presentan una sola fase, es decir, son homogéneas.
- Si se dejan en reposo durante un tiempo, las fases no se separan ni se observa sedimentación,
es decir las partículas no se depositan en el fondo del recipiente.
- Son totalmente transparentes, es decir, permiten el paso de la luz.
- Sus componentes o fases no pueden separarse por filtración.
Concentración de una solución: La concentración de una solución lo da el número de moléculas

que tenga el soluto de una sustancia y el número de moléculas que tiene el resto de la sustancia.
Existen distintas formas de decir la concentración de una solución, pero las dos más utilizadas
son: gramos por litro (g/l) y molaridad (M). Los gramos por litro indican la masa de soluto,
expresada en gramos, contenida en un determinado volumen de disolución, expresado en litros.
Así, una solución de cloruro de sodio con una concentración de 40 g/l contiene 40 g de cloruro de
sodio en un litro de solución. La molaridad se define como la cantidad de sustancia de soluto,
expresada en moles, contenida en un cierto volumen de solución, expresado en litros, es decir: M
= n/V. El número de moles de soluto equivale al cociente entre la masa de soluto y la masa de un
mol (masa molar) de soluto.
Soluciones acuosas: El agua es la biomolécula más abundante del ser humano, constituye un
65-70 % del peso total del cuerpo. Esta proporción debe mantenerse muy próxima a estos
valores para mantener la homeóstasis hídrica, por lo contrario el organismo se ve frente a
situaciones patológicas debidas a la deshidratación o la retención de líquidos. La importancia del
estudio de la biomolécula agua radica en el hecho de que la totalidad de las reacciones
bioquímicas se realizan en el seno del agua, todos los nutrientes se transportan en el seno del
agua.

UNIDADES FÍSICAS DE CONCENTRACION
1. Porcentaje en peso (% W)
Peso del soluto (g)
%W = ──────────── x 100
Peso solución (g)
2. Porcentaje en volumen (% V)
Volumen del soluto (mL)

%V = ────────────── x 100
Volumen solución (mL)
3. Porcentaje peso/volumen (% W/V)
Peso del soluto (g)

% W/V = ──────────── x 100
Vol de solución (mL)
UNIDADES QUÍMICAS DE CONCENTRACION
MOLARIDAD: La molaridad es la unidad química internacional que expresa la concentración en

una solución o mezcla, indica la cantidad de moles que se encuentran presentes en un
determinado volumen de solución el cual se ha establecido como un litro. La abreviatura que
expresa la molaridad es la letra M y la simbología de su unidad es mol/L
La fórmula esta dad por: M = n/v
Donde: n: es el número de moles y

V: es el volumen de la solución en litros.
El número de moles es la cantidad de veces que está contenido el peso molecular de una sustancia
en un determinado peso de la misma en condiciones de 100% de pureza, así el número de moles
(n) queda expresado por:
n = W/PM
Donde: W: es el peso de la sustancia y

PM: es el peso molecular de la sustancia referida.
NORMALIDAD: Es también una unidad de concentración química que indica concentración de un

soluto en una solución, teniendo en consideración su estado de oxidación o valencia de dicho
compuesto. La normalidad queda expresada por la letra N y se utiliza este símbolo después de la
expresión numeral.
N = Nº Eq / v
Donde: Nº Eq: es el número de equivalentes.

V: es el volumen de la solución en litros.
El número equivalente de un compuesto queda expresado por:
Nº Eq = W/P-Eq
Donde: W: es el peso de la sustancia y

P-Eq: es el peso equivalente.

El peso equivalente de un compuesto queda expresado por:
P-Eq = PM/EO
Donde: PM: es el peso molecular del compuesto correspondiente a la Sustancia

EO: es el estado de oxidación o valencia.
1.2 COMPETENCIAS
- Conceptuales: Al finalizar la practica el alumno reconoce los Materiales e instrumentos más
usados en el Laboratorio de Bioquímica y explica las características de las soluciones
- Procedimentales: Describe y manipula los principales materiales e instrumentos del

Laboratorio de Bioquímica. Resuelve problemas y Prepara Soluciones de uso más frecuente
en el Laboratorio Clínico.
- Actitudinales: Participa del cuidado del material, demuestra capacidad analítica, diligencia
y orden; coopera con el grupo respetando las reglas acordadas, brinda ayuda oportuna a sus
compañeros
1.2. MATERIALES Y EQUIPOS
- Beaker 100ml. - Baño maría

- Bureta 25ml. - Balanza analítica
- Matraz Erlenmeyer 250ml. - Potenciómetro portátil (Hanna)
- Fiola 100ml. - Gradillas de metal
- Pipeta serológica 10ml. - Tubos de ensayo 13x100
- Pipeta serológica 2ml. - Agar fosfato dipotasico
- Pera de decantación - Agar fosfato monopotásico
- Piceta 500ml. - Glucosa anhidra
- Espátula de metal - Sodio acetato anhídrido
- Gradilla de metal 15 x 160 - Sodio hidróxido (lentejas)
- Probeta 100ml. - Sodio tiosulfato pentahidratado
- Micropipeta (100 - 1000) - Amarillo de alizarina
- Micropipeta (10 - 100) - Safranina
- Pinza para bureta (de plástico) - Azul de metileno
- Espectrofotómetro
1.4. PROCEDIMIENTO
a) Reconocer los diferentes instrumentos.
b) Describir las partes de cada uno de ellos.
c) Realizar la manipulación de uso y transporte.
d) Experiencia I.
1) Pesar 5, 15 y 30 g de glucosa
2) Disolver en beakers por separado los 5,15 y 30 g del soluto con 50 mL de agua
destilada, obteniendo las soluciones A, B y C respectivamente.

3) Agregar 1gota de Amarillo de Alizarina al tubo A, 1 gota de Safranina al B y 1 gota de Azul
de Metileno al tubo C
4) Encuentre los volúmenes de cada una midiendo en una probeta.
5) Encuentre en cada caso la concentración de las soluciones en P/P, P/V, V/V.
e) Experiencia II.
1. Coloque en un tubo de ensayo 4 mL de la solución A.

2. Agrega inclinando el tubo y muy lentamente por las paredes, 1 mL de la solución C
3. Observe y explique.
f) Experiencia III: prepara un Buffer fosfato 0,5 molar pH: 7,5, volumen: 500 mL
1. A una fiola de 500 mL agregarle 200 mL de agua des ionizada, luego agregarle 11,5 g de
fosfato diácido de potasio y homogenizar. Luego agregar 28.85g de fosfato monoácido
dipotásico, disolver y completar con agua des ionizada hasta el aforo (500mL). Verificar
el pH con el potenciómetro.
2. Agregue hidróxido de sodio 1N 1mL y luego compruebe con el potenciómetro si el pH ha
cambiado. Agregue ácido clorhídrico 1N 2 mL y luego compruebe con el potenciómetro si
el pH a variado.
3. Explique.
1.5. RESULTADOS
- El alumno presenta los esquemas señalando las diferentes partes de los equipos e
instrumentos más usados en el laboratorio de bioquímica.
- Manipula correctamente las pipetas automáticas. Se obtendrán soluciones de

diferentes concentraciones y densidades y se observará la formación de capas, fases e
interfaces.
- Se obtendrá un buffer fosfato 0,5 molar pH 7,5.
1.6. CUESTIONARIO
a) ¿Cómo debe ser lavado el material de uso constante en el Laboratorio de Bioquímica?

b) ¿Qué sustancias son corrosivas para los equipos e instrumentos?
c) ¿Cuál es la composición química del material de vidrio utilizado en el laboratorio?
d) ¿Qué cuidado especial se debe tener con el material de vidrio nuevo, antes de usarlo por
primera vez?
e) ¿Cuál será la densidad, concentración en P/P, P/V y mol/L de una mezcla de:
- Solución a con solución b en partes iguales.
- Solución a con solución c en partes iguales.
- 5 mL de solución a con 3 mL de solución b
- 5 mL de solución c con 4 mL de solución b
f) Describir las Unidades Básicas del Sistema Internacional (SI).
g) Describir los múltiplos y submúltiplos utilizados con las principales medidas del SI
h) ¿Qué diferencia hay entre volumen y capacidad y cuáles son sus unidades?
i) ¿Qué es un buffer? ¿de qué está compuesto?

1.7. FUENTES DE INFORMACIÓN
- Baynes, John W, Dominiczack, Marek H. Bioquímica médica. 3a. ed. Barcelona: Elseiver
Mosby; 2011.
- Lodish, H, Berk, A, Matsudaira, P. Biología celular y molecular. 5a. ed. Buenos Aires:
Médica Panamericana; 2006.
- Villavicencio Nuñez, M. Bioquímica. 2a. ed. Lima: CONCYTEC; 2010.
- Voet, D, Voet, J. Bioquímica. 1a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 1992.
- http://www.quimicaweb.net/ciencia/paginas/laboratorio/material.html
- http://laboratoriopasteur.mex.tl/20239_equipo-y-material-de-laboratorio.html
- http://biblioteca.duoc.cl/bdigital/Documentos_Digitales/600/610/39593.pdf
- http://www.amschool.edu.sv/paes/science/concentracion.htm
- http://quimicamedusac.files.wordpress.com/2013/05/semana-09-2012-clase.pdf
- http://www.sc.ehu.es/sbweb/fisica/unidades/unidadMedida.htm

PRÁCTICA Nº 02
ESPECTROFOTOMETRÍA: FACTOR Y CURVA DE CALIBRACIÓN
2.1. MARCO TEÓRICO.
El análisis colorimétrico contempla al conjunto de métodos de análisis cuantitativo que se

fundamenta en la medición de la intensidad de la luz transmitida a través de una solución
coloreada, ya sea que se trate de sustancias naturalmente coloreadas o que se han hecho de
tal calidad mediante reacciones químicas adecuadas. Casi todas las sustancias en solución
tienen la capacidad de absorber en forma selectiva determinadas radiaciones luminosas
unas más que otras, dejándolas pasar. La longitud de onda en la que las moléculas de dichas
sustancias absorben con mayor intensidad la luz, se denomina longitud de máxima absorción
o lambda máximo. Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad
de luz, la intensidad de la luz transmitida por una solución disminuirá en relación con el
aumento del número de moléculas que se interpongan entre la fuente luminosa y el
observador. Este número varía de acuerdo a la concentración del soluto y al espesor del
recipiente que contiene la solución, estos factores están considerados en la LEY DE LAMBERT
Y BEER, que rige los principios de la colorimetría.
LEY DE LAMBERT: Expresa la proporcionalidad que existe entre la absorbancia de una solución
coloreada y la distancia que recorre el haz de luz monocromática en ella (sin variación de la
concentración).
LEY DE BEER: Expresa la proporcionalidad que existe entre la absorbancia de una solución
coloreada y la concentración de ésta en un haz de luz monocromática (sin variación de la longitud
que recorre el haz)
FÓRMULA: La expresión de relación de la ley de Lamber y Beer está dado por: DO = E = A = l. c. e
Donde: DO: es la densidad óptica.

E: es la extinción.
A: es absorbancia.
l: es la longitud que atraviesa el haz de luz.
c: es la concentración de la solución coloreada.
e: es el coeficiente de extinción molar.
RELACION ENTRE ABSORBANCIA Y TRANSMITANCIA:
A = Log Io / I1
Donde: A es absorbancia.
Io es la luz incidente.
I1 es la luz transmitida.
CURVA DE CALIBRACION
El método consiste en emplear soluciones de concentraciones conocidas y crecientes denominadas

estándares o patrones a las cuales se les determinará su absorbancia ya sea en un fotocolorímetro
o en un espectrofotómetro y pueden ser expresadas en absorbancia; en cualquier caso, los
resultados se grafican en un sistema de coordenadas donde en el eje "X" se gráfica las
concentraciones y en el "Y" la absorbancia. Los puntos resultantes en el sistema empleado se
traza una recta de tal manera que pase por el origen y que una en la medida posible a todos los
puntos o a la mayoría de estos.

La línea obtenida constituye la curva de calibración; también se le denomina curva estándar.
Por ejemplo:
Supongamos los estándares de 1, 2, 4, 6 y 8 g/dL y sus absorbancias son 40, 81, 161, 238 y 323
respectivamente; con estos puntos podemos construir la gráfica. Posteriormente leemos la muestra
de concentración desconocida y la lectura la llevamos al eje Y de la gráfica, extrapolamos y
ubicamos el punto de corte con la línea luego se ubica el punto de la recta que corresponde al
componente del eje X y esta será la concentración de la muestra analizada.
FACTOR DE CALIBRACION (Fc)
El factor de calibración es un término que relaciona la concentración de una sustancia con su

absorbancia. Tiene la característica de ser un número constante o muy aproximado entre sí, a lo
largo de la curva de calibración y se cumple sólo en la zona lineal de la misma. Matemáticamente
el factor de calibración es la inversa de la pendiente de la recta generada en la curva de calibración.
El factor de calibración es la relación entre la concentración del estándar (St) y la absorbancia del
mismo:
Fc [ ] = [St ] / DOSt
Si hay más de un estándar, entonces se obtendrá un promedio de los Fc.
CASO 1: Si la muestra problema (MP) y el estándar (St) son procesados de igual manera (diluciones,
tratamientos térmicos, centrifugaciones etc.) se podrá usar directamente la siguiente formula:
[MP] = DOmp. Fc [ ]
CASO 2: Si la muestra problema ha sido diluida previamente, se determinará el FACTOR DE

DILUCIÓN (Fd) que matemáticamente es la inversa de la dilución, o sea 1/dil de donde se
deduce:
Dil = Vol MP / Vol T
Donde:
Vol MP: es el volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilución.
Vol T: es el volumen total (volumen de la muestra más el volumen del diluyente).
Para este segundo caso, para conocer la concentración de una MP se aplicará la siguiente fórmula:
[MP] = AMP. Fc [ ]. Fd
Donde:
AMP: es la absorbancia de la muestra problema. Fc: es el factor de calibración.
Fd: es el factor de dilución.
[MP]: concentración de la muestra problema.
2.2 COMPETENCIAS
- Conceptual: Explica fórmulas de cálculo espectrofotocolorimétrico en las soluciones

problemas.
- Procedimental: Elabora una curva de calibración y encuentra la concentración de

muestras problemas.
- Actitudinal: Demuestra capacidad analítica, diligencia y orden; coopera con el grupo

respetando las reglas acordadas, brinda ayuda oportuna a sus compañeros.

2.3 MATERIALES Y EQUIPOS
- Beacker 100ml. - Espátula de metal

- Piceta 500ml. - Espectrofotómetro
- Pipeta serológica 2ml. - Gradillas de metal
- Pipeta serológica 5ml. - Tubos de ensayo13x100
- Pipeta serológica 10ml. - Cobalto (II) nitrato hexahidrato
- Micropipeta (100 - 1000) - Cobre (II) sulfato pentahidrato
- Micropipeta (10 - 100) - Permanganato de potasio
2.4 PROCEDIMIENTO
Preparación de las soluciones trabajo

a) Sulfato de Cobre (10mg/dL)
TUBO TUBO TUBO TUBO TUBO
1 2 3 4 5
Sulfato de Cobre (II) (10mg/dL) (uL) 200 400 600 1000 2000
Agua destilada (uL) 1800 1600 1400 1000 ----
Volumen final (mL) 2 2 2 2 2
Concentración final (mg/dL)
b) Nitrato de Cobalto (II) (5mg/dL)

TUBO TUBO TUBO TUBO
1 2 3 4
Nitrato de Cobalto (II) (5mg/dL) (uL) 400 800 1200 2000
Agua destilada (uL) 1600 1200 800 ----
Volumen final (mL) 2 2 2 2
c) Permanganato de Potasio (1g/dL)
TUBO TUBO TUBO TUBO

1 2 3 4
Permanganato de Potasio (1g/dL) (uL) 10 20 30 40
Agua destilada (uL) 1990 1980 1970 1960
Volumen final (mL) 2 2 2 2
Determinación de las concentraciones finales.

Por medio de cálculos matemáticos determinar las concentraciones obtenidas luego de diluir el
reactivo con agua destilada, utilizando la fórmula:
(Concentración inicial) x (Volumen inicial) = (Concentración final) x (Volumen final)
Determinación de la longitud de máxima absorbancia

Efectuar las lecturas de los tubos Nº2 de cada reactivo y leerlo a 400, 500, 600, 700 nm, y
anotar en que longitud se encuentra la mayor absorbancia, luego ajustar las longitudes para
hallar la longitud de onda de mayor absorbancia.
Determinación de las absorbancias

Efectuar las lecturas de los tubos en la longitud de onda máxima hallada según el reactivo
utilizado. Anotar los resultados.
Construcción de la curva de calibración:

Con los datos obtenidos anteriormente construir la curva de calibración en papel milimetrado.
Graficar concentración versus absorbancia.
Determinación del Factor de Calibración:

Halla el Factor de calibración de cada uno de los patrones o estándares construidos (que deben
ser muy cercanos entre sí) de acuerdo a cada reactivo utilizado, luego obtener el Factor de
Calibración promedio y utilizar este para los cálculos.
Determinación de la concentración de una muestra problema:

Efectuar la lectura de 3 muestras y determinar su absorbancia (si es necesario, realizar una
dilución a criterio del alumno. Hallar su concentración empleando la curva de calibración y
empleando la formula con el factor de calibración promedio.
Los resultados deben ser iguales o muy cercanos
2.5. RESULTADOS
- Gráfico del análisis para hallar la longitud de máxima absorbancia para cada reactivo
en papel milimetrado (Abs vs. Long de onda)
- Gráfico de la curva de calibración en papel milimetrado para cada reactivo (Abs vs
concentración)
- Obtención del factor de calibración promedio.
- Halla diferentes concentraciones en muestras problemas, usando la curva de calibración,
así como el factor de calibración.
2.6 CUESTIONARIO
a)
Transformar DO a T% Transformar T% a DO
0.050 15%
0.120 26%
0.230 38.5%
0.325 42.3%
0.420 30%
0.538 46%
0.756 54.5%
0.925 50%
1.062 63.2%
1.348 74.5%
1.426 87%
1.653 95.4%
b) Resolver:

- Una muestra obtuvo una absorbancia de 0.380, si el estándar de calibración tenía una
concentración de 50 mg/dl y obtuvo una absorbancia de 0.250, ¿Cuál será la concentración
de la muestra problema?
- Una muestra al procesarse por espectrofotometría se conoce que tiene 80mg/dl, si el

estándar obtuvo como DO 0.350 y la muestra una DO de 0.400 ¿Cuál es la concentración del
estándar?
- Una muestra al estar muy concentrada se diluyó al quinto, luego se obtuvo como
absorbancia 0.460, el estándar de 100mg/dL obtuvo 0.300 de DO. ¿Cuál es la concentración
de la muestra?
- Describir en que consiste el Espectro electromagnético
2.7 FUENTES DE INFORMACIÓN
- Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de

biomoléculas.
2.
- http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf
- http://electromagnetismo2010a.wikispaces.com/file/view/ESPECTRO+ELECTROMAGNETI
CO.p df/139152159/ESPECTRO+ELECTROMAGNETICO.pdf
- http://www.espectrometria.com/espectro_electromagntico
- http://www.espectrometria.com/espectrometra_ultravioleta-visible
- http://es.wikipedia.org/wiki/Espectro_electromagn%C3%A9tico

PRÁCTICA Nº 03
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA I: SUSTRATO Y PH
3.1. MARCO TEÓRICO
Las enzimas son en su gran mayoría proteínas que catalizan las reacciones biológicas que
tienen lugar en los seres vivos, sin alterar el equilibrio de la reacción. En general las
reacciones catalizadas por enzimas, son específicas y esenciales para las funciones
fisiológicas. La cinética enzimática se estudia midiendo la velocidad de una reacción.
Teóricamente la velocidad de una reacción puede determinarse por el consumo de sustrato
por unidad de tiempo (-dS/dt) o bien la velocidad de aparición de productos de la reacción
en el tiempo (+dP/dt). El estudio se realiza bajo condiciones de velocidad inicial, la cual se
define como la relación directa entre la velocidad de reacción y el tiempo. La velocidad de
reacción y por ende el consumo de sustrato o aparición de productos, está controlado por
las concentraciones de sustrato y enzima así mismo se modifica de manera variable por lo
cambios de pH y/o temperatura de reacción. La presencia de activadores o inhibidores en
también pueden afectar la velocidad de reacción.
En esta práctica se utilizará al sistema enzimático glucosa oxidasa – peroxidasa en el cual se
observa que su sustrato, la glucosa, es oxidada por la glucosa oxidasa a ácido glucónico y
peróxido de hidrógeno y en una segunda; la reacción es acoplada a la peroxidasa en presencia
de fenol y 4-amino fenazona formando un cromógeno coloreado que es la oxazona, de
color rojo cereza y se lee a 505 nm. De tal manera que la intensidad del color o y por lo
tanto la lectura, es directamente proporcional a la actividad enzimática.
3.2. COMPETENCIAS
- Conceptuales: Explica los efectos de sustrato y pH sobre la actividad de una enzima.
- Procedimental: Elabora una curva de Michaelis y Menten así como la curva del pH.
- Actitudinal: Demuestra capacidad analítica, diligencia y orden; coopera con el

grupo respetando las reglas acordadas, brinda ayuda oportuna a sus compañeros.
- Beaker 100ml. - Baguetas

- Beaker 250ml. - Espátula de metal
- Piceta 500ml. - Gradillas de metal
- Espátula de metal (pequeña) - Tubos de ensayo13x100
- Propipetas de jebe - Cronómetros.
- Probeta 100ml. - Ácido clorhídrico
- Micropipeta (100 - 1000) - Sodio hidróxido (lentejas)
- Micropipeta (10 - 100) - Glucosa anhidra (polvo)
- Micropipeta (5 - 50) - Reactivo Glucosa-Oxidasa
- Espectrofotómetro - Glucosa (estándar)
- Baño maría - Solución de azida de sodio
- Balanza analítica
3.4. PROCEDIMIENTO PREPARACION DEL SUSTRATO
Preparar 50mL de una solución de glucosa al 20mmol, tomando en cuenta su PM

PREPARACION DE LA ENZIMA
Enzima Glucosa-oxidasa marca Valtek.
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO
1. Preparar una batería de 4 tubos de ensayo según el siguiente esquema:
TUBOS 1 2 3 4
Solución de glucosa (20 mmol/L) (mL) 0.1 0.2 0.4 0.6
Agua destilada (mL) 3.9 3.8 3.6 3.4
Concentraciones Finales (mmoL/L)
2. En otro tubo colocar 3 mL de la solución de enzima y llevar los 5 tubos a pre-incubar en baño
María a 37°C por 5 minutos.
3. Agregar del tubo que contiene la solución de enzima 0,4 mL al tubo 1, mezcle y mantenga el
tubo en incubación a 37°C, después de dos minutos agregue 0,4 mL de la enzima al tubo dos,
agite e incube.
4. Espere dos minutos, es decir, después que hayan transcurrido 4 minutos desde la primera vez
que agregó la enzima al tubo 1, retírelo del baño María y añádale inmediatamente 2 gotas de
Azida de sodio y mezcle por inversión, dos minutos después de haber retirado el tubo 1 del baño
de agua, retire el tubo 2 y agregue inmediatamente 2 gotas de azida de sodio y mezcle.
5. Lleve a leer los tubos al espectrofotómetro a 505 nm.
6. Proceda de la misma forma que en el paso 3 y 4 con los tubos 3 y 4; de esta manera cada uno
tendrá 4 minutos exactos de incubación.
7. Leve a leer las absorbancias en el espectrofotómetro a 505 nm de cada tubo, calibrando a cero,
usando como blanco la solución de enzima.
EFECTO DEL pH
TUBOS 1 2 3 4 5 6 7
Sol. de HCl (0.05 mol/L) (mL) 0.8 0.4 0.2 ---- ---- ---- ----
Sol. de NaOH (0,05 mol/L) (mL) ---- ---- ---- ---- 0.2 0.4 0.8
Agua destilada (mL) 2.4 2.8 3 3.2 3 2.8 2.4
Sol. de glucosa (20 mmol/L) (mL) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
pH Final
2. Colocar en otro tubo de ensayo 5 mL de la solución de enzimas y llevar los 8 tubos a pre-
incubar en baño María a 37°C por 5 minutos.

3. Agregar del tubo que contiene la solución de enzima 0,5 mL al tubo 1, mezcle y mantenga el
tubo en incubación a 37°C, después de dos minutos agregue 0,5 mL de la enzima al tubo dos,
agite e incube.
4. Espere dos minutos, es decir, después que hayan transcurrido 4 minutos desde la primera
vez que agregó la enzima al tubo 1, retírelo del baño María y añádale inmediatamente 2
gotas de Azida de sodio y mezcle por inversión, dos minutos después de haber retirado el
tubo 1 del baño de agua, retire el tubo 2 y agregue 2 gotas de azida de sodio. Lleve a leer
los tubos al espectrofotómetro.
5. Proceda con los tubos 3, 4, 5, 6 y 7, de la misma forma que en el paso (3) y (4) de esta
manera cada uno tendrá 4 minutos exactos de incubación.
3.5. RESULTADOS
- Encuentre las concentraciones de sustrato en los tubos.

- Realizar el gráfico de Michaelis Menten: concentración de sustrato (eje X) versus
velocidad de reacción (eje Y), expresado como absorbancia.
- Hacer una segunda gráfica con las dobles recíprocas o gráfica de Lanewaever y Burk.
- Calcular el valor de velocidad máxima (Vmáx) y de la constante de Michaelis (Km).
- Encuentre el pH de cada uno de los tubos en la experiencia del efecto del pH

- Hacer una gráfica tomando como velocidad de reacción a la DO colocando los valore en
el eje “Y” y el pH en el eje “X”.
- Realice un comentario de la gráfica obtenida.
- Determinar el pH óptimo.
3.6. CUESTIONARIO
- Definir:
a) Sitio activo.
b) Co-enzima cite dos ejemplos.
c) Metaloenzima; cite dos ejemplos.
d) Activador, cite dos ejemplos.
- ¿Qué tipo de inhibición causa la Azida de sodio en el sistema usado en la práctica?
- ¿Qué le ocurre a la enzima cuando se le someta a altas temperaturas?
- ¿Qué mecanismos de control de la actividad enzimática se han propuesto?
- ¿Qué es Km, cuál es su importancia?
Mosby; 2011
Médica
- Panamericana; 2006.
- http://www.fmv-
uba.org.ar/grado/medicina/ciclo_biomedico/segundo_a%C3%B1o/bioquimica/Seminari
o%206-Enzimas.pdf
- http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm
- http://www.uhu.es/08007/documentos%20de%20texto/apuntes/2005/pdf/tema_08_en
zima s_2.pdf

PRÁCTICA N° 04
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA II: ENZIMA, TIEMPO,

TEMPERATURA
Las enzimas son en su gran mayoría proteínas que catalizan las reacciones biológicas que
tienen lugar en los seres vivos, sin alterar el equilibrio de la reacción. En general las
reacciones catalizadas por enzimas, son específicas y esenciales para las funciones
fisiológicas. La cinética enzimática se estudia midiendo la velocidad de una reacción.
Teóricamente la velocidad de una reacción puede determinarse por el consumo de sustrato
por unidad de tiempo (-dS/dt) o bien la velocidad de aparición de productos de la reacción
en el tiempo (+dP/dt). El estudio se realiza bajo condiciones de velocidad inicial, la cual se
define como la relación directa entre la velocidad de reacción y el tiempo. La actividad de la
enzima y por ende el consumo de sustrato o aparición de productos, está controlado por el
medio es decir por el pH, debido a que el estado de ionización de la enzima, del sustrato o
de ambos condiciona la velocidad con que puede ocurrir la reacción, de manera tal que cada
enzima tiene un pH adecuado en el que la actividad es máxima; a este valor se le considera
como el pH óptimo.
Así mismo, la actividad de las enzimas depende de la temperatura en las que se encuentren.
No todas las enzimas actúan a la misma temperatura; si bien muchas de ellas pueden actuar
en un rango más o menos amplio, existe una temperatura en la cual la actividad de la enzima
en máxima y por lo tanto su capacidad de interactuar con el sustrato; a este nivel térmico se
le denomina temperatura óptima. La velocidad de reacción y por ende el consumo de sustrato
o aparición de productos, está controlado por las concentraciones de sustrato y enzima y la
presencia de activadores o inhibidores en también pueden afectar la velocidad de reacción;
por ello en esta práctica se mantiene constante la concentración del sustrato y de la enzima,
en todos los experimentos. En los experimentos a desarrollar, se utilizará al sistema
enzimático glucosa oxidasa – peroxidasa en el cual se observa que su sustrato, la glucosa, es
oxidada por la glucosa oxidasa a ácido glucónico y peróxido de hidrógeno y en una segunda;
la reacción es acoplada a la peroxidasa en presencia de fenol y 4-amino fenazona formando
un cromógeno coloreado que es la oxazona, de color rojo cereza y se lee a 505 nm. De tal
manera que la intensidad del color o y por lo tanto la lectura, es directamente proporcional
a la actividad enzimática. En esta práctica, el tiempo es una variable crítica, de manera tal
que los experimentos que se realizarán deben ser hechos teniendo en cuenta EL CONTROL
EXACTO DEL TIEMPO. Así mismo, es IMPRESINDIBLE, que las pipetas no se mezclen y si no sabe
que pipeta corresponde al reactivo a usar, lávela previamente o use otro instrumento limpio.
4.2. COMPETENCIAS
- Conceptuales: Explica los efectos de concentración de enzima tiempo y temperatura

sobre la actividad de una enzima.
- Procedimental: Elabora una curva de efectos de la concentración de enzima tiempo

y temperatura sobre la actividad de una enzima.


- Beaker 100ml. - Espectrofotómetro
- Probeta 100ml. - Balanza analítica
- Pipeta serológica 2ml. - Baguetas
- Pipeta serológica 5ml. - Espátula de metal
- Pipeta serológica 10ml. - Pinza de madera
- Piceta 500ml. - Gradillas de metal
- Propipetas de jebe - Tubos de ensayo13x100
- Espátula de metal (pequeña) - Cronómetros
- Micropipeta (100 - 1000) - Glucosa anhidra (polvo)
- Micropipeta (10 - 100) - Reactivo de glucosa-oxidasa
- Micropipeta (5 - 50) - Glucosa (estándar)
- Olla de cocina - Solución de azida de sodio
- Trípode de metal
4.4. PROCEDIMIENTO
EFECTO DEL TIEMPO
1. Preparar una batería de 5 tubos de ensayo correspondientes al sustrato según el

siguiente esquema:
TUBOS 1 2 3 4 5
Solución de glucosa 20 mmol/L (mL) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Agua destilada (mL) 3,2 3,2 3,2 3,2 3,2
2. Lleve a pre incubación todos los tubos por 5 minutos a 37°C.
3. Sin retirar los tubos del baño maría, agregar 0,6 mL de enzimas al tubo 1 agitar y
controlar exactamente 1 min y añadir 2 gotas de azida de sodio. Mezclar y llevar a leer.
4. En el baño maría, agregar 0,6 mL de enzimas al tubo 2 agitar y controlar exactamente 2

min y añadir 2 gotas de azida de sodio. Mezclar y llevar a leer.
5. Agregar 0,6 mL de enzimas al tubo 3 agitar y controlar exactamente 3 min y añadir 2

gotas de azida de sodio. Mezclar y leer.

gotas de azida de sodio. Mezclar y llevar a leer.

gotas de azida de sodio. Mezclar y llevar a leer.
EFECTO DE LA TEMPERATURA
1. Preparar una batería de 4 tubos de ensayo correspondientes al sustrato según el

siguiente esquema:
TUBOS 1 2 3 4
Solución de glucosa 20 mmol/L (mL) 0.6 0.6 0.6 0.6
Agua destilada (mL) 3.2 3.2 3.2 3.2
2. Preparar otra batería de tubos de ensayo correspondientes a la solución de enzima

según el siguiente esquema:

TUBOS 1 2 3 4
Solución de Enzima (mL) 0.6 0.6 0.6 0.6
3. Lleve a pre incubación por 5 minutos a las siguientes temperaturas:

- En baño de hielo (4°C) los tubos 1 de sustrato y 1 de enzima.
- Deje a temperatura ambiente (20°C) los tubos 2 de sustrato y 2 de enzima.
- En baño maría a 37°C los tubos 3 de sustrato y 3 de enzima.
- En agua hirviendo (100°C) los tubos 4 de sustrato y 4 de enzima.
4. Luego mezcle la solución de enzima y sustrato correspondientes de cata tubo y mantenga
las mezclas de los tubos en las mismas temperaturas en que están por 4 minutos más.
5. Finalmente retire del baño y agregue inmediatamente 2 gotas de azida de sodio, mezcle
por inversión y proceda a leer las absorbancias.
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA
TUBOS 1 2 3 4 5
Solución de enzima (mL) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Agua destilada (mL) 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5
2. En otro tubo colocar 5 mL de la solución de glucosa (sustrato) y llevar los 6 tubos a

preincubar en baño María a 37°C por 5 minutos.
3. Agregar del tubo que contiene la solución de glucosa (sustrato) 0,8 mL al tubo 1, mezcle y
mantenga el tubo en incubación a 37°C, después de dos minutos exactos, agregue 0,8 mL
del sustrato al tubo dos, agite e incube.
4. Espere dos minutos, es decir, después que hayan transcurrido 4 minutos desde la primera
vez que agregó el sustrato al tubo 1, retírelo del baño María y añádale inmediatamente 2
gotas de Azida de sodio y mezcle y lleve a leer, dos minutos después de haber retirado el
tubo 1 del baño de agua, retire el tubo 2 y agregue 2 gotas de azida de sodio y lleve a leer
el tubo al espectrofotómetro.
5. Proceda de la misma forma que en el paso 3 y 4 con los tubos 3, 4 y 5; de esta manera cada
uno tendrá 4 minutos exactos de incubación.
4.5. RESULTADOS
- Obtener las gráficas correspondientes a los efectos de: Tiempo, Temperatura y
concentración de Enzima vs DO en papel milimetrado.
- Indicar su máxima actividad, resaltando el tiempo óptimo, la temperatura óptima y
la concentración de la enzima óptima.
4.6. CUESTIONARIO
¿Cuál es la clasificación general de las enzimas?

¿Cómo se nombran y clasifican las enzimas según su código enzimático?

Mosby; 2011.
- http://www.fmv-
uba.org.ar/grado/medicina/ciclo_biomedico/segundo_a%C3%B1o/bioquimica/Seminario
%206-Enzimas.pdf
- http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm
- http://www.uhu.es/08007/documentos%20de%20texto/apuntes/2005/pdf/tema_08_enz
ima s_2.pdf

PRÁCTICA N° 05
RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS
Los carbohidratos, conocidos también como hidratos de Carbono, glúcidos o azúcares

(sakcharon, azúcar), son compuestos orgánicos formados en su mayoría por Carbono,
Hidrógeno y Oxígeno, aunque en algunos, se encuentran también el azufre y nitrógeno. Los
carbohidratos o azúcares, son compuestos formados por Carbono, hidrógeno y oxígeno que
son sintetizados a partir de CO2 (bióxido de Carbono) y de H2O (agua) por los organismos
fotosintéticos mediante el aprovechamiento de la energía de la luz solar (fotosíntesis), o
bien por rutas sintéticas en los organismos heterótrofos, aunque el mayor aporte de los
mismos para estos organismos está dado por la dieta. El Carbono (C), es el elemento más
abundante en las biomoléculas constituye alrededor del 50 % del peso seco de los seres
vivos. El hidrógeno (H) es el elemento más pequeño. Su núcleo solamente contiene un protón
y tiene solo un orbital en el cual gira solo un electrón. El oxígeno (O), elemento muy
electronegativo, constituye entre el 25 y 30 % de las biomoléculas. Cabe señalar que el agua
está formada por O e H en una proporción 1:2, y en los carbohidratos, la relación de átomos
de C y moléculas de agua está en una proporción de 1:1, de ahí su nombre: hidratos de
Carbono. La palabra carbohidratos deriva de la condición empírica de sus fórmulas
moleculares:
Cn(H2O)n
Donde n  3 porque en sus fórmulas moleculares, no todos los átomos de Carbono están
"hidratados". En la siguiente Tabla se muestra la relación entre de algunas moléculas para
un hombre adulto y sano. En los seres vivos las funciones de los carbohidratos se pueden
generalizar en:
a) Energéticas (glucógeno en animales y almidón en vegetales, bacterias y hongos). La

glucosa es uno de los carbohidratos más sencillos comunes y abundantes; representa a la
molécula combustible que satisface las demandas energéticas de la mayoría de los
organismos. De reserva. Los carbohidratos se almacenan en forma de almidón en los
vegetales (gramíneas, leguminosas y tubérculos) y de glucógeno en los animales. Ambos
polisacáridos pueden ser degradados a glucosa.
b) Compuestos estructurales (como la celulosa en vegetales, bacterias y hongos y la

quitina en artrópodos). Los carbohidratos estructurales forman parte de las paredes
celulares en los vegetales y les permiten soportar cambios en la presión osmótica entre
los espacios intra y extracelulares. Esta, es una de las sustancias naturales más
abundantes en el planeta. En las grandes plantas y en los árboles, la celulosa, estructura
fibrosa construida de glucosa, cumple la doble función de carga y soporte. La celulosa es
de origen vegetal principalmente, sin embargo, algunos invertebrados tienen celulosa en
sus cubiertas protectoras. El polisacárido estructural más abundante en los animales es la
quitina. En los procariontes forma la pared celular construida de azúcares complejos
como los péptidoglicanos y ácidos teicoicos. A las propiedades de esta estructura se le
atribuyen muchas de las características de virulencia y antigenicidad. En algunos animales
como los insectos los carbohidratos forman la quitina, el ácido condroitín sulfúrico y el
ácido hialurónico, macromoléculas de sostén del aparato muscular.
c) Precursores. Los carbohidratos son precursores de ciertos lípidos, proteínas y dos

factores vitamínicos, el ácido ascórbico (vitamina C) y el inositol.
d) Señales de reconocimiento (como la matriz extracelular). Los carbohidratos intervienen

en complejos procesos de reconocimiento celular, en la aglutinación, coagulación y
reconocimiento de hormonas. Existen reacciones que permiten identificar a estos
carbohidratos, azúcares o glúcidos y son las siguientes:

REACIONES PARA IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS
REACCIÓN DE MOLISH: Se fundamenta en que el ácido sulfúrico deshidrata a los carbohidratos

para dar furfural o sus derivados, los cuales reaccionan con el alfa naftol de reactivo,
formando un complejo de color violeta.
REACCIÓN DE LUGOL: Los polisacáridos tienen la propiedad de formar complejos de

ADSORCIÓN con el yodo de manera que originan complejos de color. El almidón dará reacción
azul intenso con el yodo, el cual desaparece al calentamiento y reaparece por enfriamiento. El
glucógeno (polisacárido animal) da color rojiso en esta reacción.
REACCIÓN DE BENEDICT: Los carbohidratos reductores en medio alcalino, sufren fenómenos

de enolización formándose cuerpos fuertemente reductores los cuales, en caliente,
transforman el ión cúprico 8Cu+2) a ion cuproso (Cu+1), formándose oxido cuproso que tiene
color rojo ladrillo y es insoluble que precipita con el tiempo.
REACCIÓN DE SELIWANOFF: Por acción del ácido clorhídrico del reactivo, se obtiene furfurales
a partir de los carbohidratos, los cuales con el resorcinol presente en el reactivo generan un
compuesto color salmón. La reacción de Seliwanoff es positiva en presencia de cetosas y
negativa en aldosas.
REACCION DE BIAL: Por del dehidratante de los ácidos fuertes, las pentosas dan furfural, las
cuales, al reaccionar con el orcinol, dan compuestos de color verde. Esta reacción es negativa
con las hexosas, ya que estas al deshidratarse originan hidroximetiletilfurfural, el cual no
forma complejo coloreado con el orcinol. Por ello esta reacción se constituye como de
diferenciación entre hexosas y pentosas.
REACCION DE BARFOED: Es una reacción para identificar monosacáridos (5-7 min de reacción),
aunque algunos disacáridos (los reductores) dan positiva a la reacción, pero con más tiempo
(10-12 min), ya que se hidroliza el disacárido. El fundamento radica en la reducción del
acetato cúprico a oxido cuproso en los
5.2. COMPETENCIAS
- Conceptuales: Explica los fundamentos para la determinación y reconocimiento de

carbohidratos diferenciado monosacáridos, disacáridos de polisacáridos.
- Procedimentales: Realiza las pruebas de reconocimiento y clasificación de

carbohidratos.

- Beaker 100ml. - Olla de cocina

- Beaker 250ml. - Trípode de metal
- Pipeta serólogica 2ml. - Solución de glucosa 2%
- Pipeta serólogica 5ml. - Solución de fructuosa 2%
- Pipeta serólogica 10ml. - Solución de galactosa 2%
- Piceta 500ml. - Solución de ribosa 2%
- Espátula de metal (pequeña) - Solución de arabinosa 2%
- Propipetas de jebe - Solución de maltosa 2%
- Probeta 100ml. - Solución de sacarosa 2%
- Micropipeta (100 - 1000) - Almidón soluble 2%
- Micropipeta (10 - 100) - Solución de glucógeno 1%

- Espectrofotómetro - Etanol
- Baño maria - Lugol (solución)
- Balanza analítica - Reactivo Molish
- Baguetas - Reactivo Benedict
- Espátula de metal - Reactivo de Selliwanoff
- Gradillas de metal - Reactivo de Bial
- Tubos de ensayo13x100 - Reactivo de Barfoed
- Tubo de ensayo 16 x150 - Ácido Sulfúrico qp
- Pinza de madera
5.4. PROCEDIMIENTO
1. Realizar la reacción de Molish con cada una de las muestras colocando en un tubo de
ensayo 2 mL de ella con 1 mL de alcohol, agregar 3 a 4 gotas del reactivo de Molish y
mezclar; agregar en zona, por las paredes y con mucho cuidado 0,5 mL de ácido sulfúrico
concentrado. Observar e identificar las muestras. Separar las que sean identificadas
como no carbohidratos.
2. Con las muestras identificadas como carbohidratos realizar la reacción de Lugol

colocando en un tubo de ensayo 2 mL de muestra y agregar II gotas de reactivo de lugol
(si está muy concentrado, diluir 1/10), mezclar y anotar los resultados.
3. Con las muestras identificadas como no polisacáridos, realizar la reacción de Bénedict,

Seliwanoff, Bial
a. Técnica de Bénedict: Colocar en un tubo de ensayo 0,2 mL de muestra y agregar

0,5 mL de reactivo de Bénedict, llevar por 4 min. a baño maría hirviente. Anotar
los resultados.
b. Técnica de Seliwanoff: Colocar en un tubo de ensayo 0,2 mL de muestra y agregar

0,5 mL de reactivo de Seliwanoff, llevar por 4 min a baño maría hirviente. Anotar
los resultados.
c. Técnica de Bial: Colocar en un tubo de ensayo 0,2 mL de muestra y agregar 0,5 mL

de reactivo de Bial, llevar por 3 min a baño maría hirviente. Anotar los resultados.
d. Técnica de Barfoed: Colocar en un tubo de ensayo 0,2 mL de muestra y agregar 1

mL de reactivo de Bial, llevar por 5 y 7 min a baño maría hirviente. Si no se forma
el precipitado, dejar reaccionar por 10-12 min
5.5. RESULTADOS
- Verificación de polisacáridos.
- Identificación de monosacáridos y disacáridos
- Identificación de hexosas y pentosas
- Clasificación de azucares reductores de no reductores.
- Construcción de una tabla con los resultados obtenidos.
5.6. CUESTIONARIO
- Analizar los resultados obtenidos.
- Describir los fundamentos de cada prueba, colocando las estructuras químicas de cada
reactivo en su reacción correspondiente.

- Graficar las moléculas y los enlaces de los principales disacáridos y del almidón.
- Si tengo una muestra desconocida. ¿Cuáles serían las pruebas y en qué orden se realizarían
para reconocer los carbohidratos que posee?
Mosby; 2011.
- http://www.fsalazar.bizland.com/pdf/POLISACARIDOS.pdf
- http://www.uniquindio.edu.co/uniquindio/ntic/trabajos/10/davidyoscar/paginas/recc
arb
mol/pdfs/20%20REACCIONES%20COLOREADAS%20DE%20AZ%C3%9ACARES.pdf

PRÁCTICA N° 06
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN
6.1. MARCO TEÓRICO
Uno de los polisacáridos más comunes en la dieta del ser humano es el almidón, el cual se
encuentra en muchos alimentos de origen vegetal y en muchos productos elaborados como
pan, fideos, etc. En el organismo, las enzimas digestivas lo degradan hasta glucosa, la cual
es absorbida y utilizada por todos los tejidos o almacenada principalmente en el hígado y
músculos bajo la forma de glucógeno. El almidón estructuralmente está constituido por la
amilosa (cadena lineal) y la amilopectina (cadena ramificada). La cadena lineal o amilosa,
es la sucesión de unidades de 300 a 350 unidades glucosa unidas por enlaces alfa 1-4.
Las cadenas ramificadas de la amilopectina tienen enlaces alfa 1-4 y enlaces alfa 1-6, entre
cada
24 a 30 moléculas de glucosa. La digestión enzimática del almidón consiste en hidrolizar los
enlaces alfa 1-4 por la enzima amilasa ya sea salival o pancreática, originando dextrinas
límites, maltotriosa y hasta maltosa; posteriormente por acción de las enzimas intestinales
o la degradación total llega hasta glucosa. La alfa amilasa presente en la saliva y en
la secreción pancreática tiene un pH óptimo de 6,7 a 7,2.
6.2. COMPETENCIAS
- Conceptuales: Define y explica los fundamentos del proceso de digestión del almidón
por la amilasa salival.
- Procedimentales: Realiza las pruebas de reconocimiento de hidrólisis del almidón y
reconoce las reacciones involucradas.
- Beaker 250ml. - Olla de cocina

- Beaker 100ml. - Trípode de metal
- Pipeta serológica 2ml. - Baño maría
- Pipeta serológica 5ml. - Tubo de ensayo 13 x 100
- Pipeta serológica 10ml. - Ácido Clorhídrico
- Piceta 500ml. - Almidón soluble
- Espátula de metal pequeña - Lugol
- Propipetas de jebe - Reactivo Benedict cualitativo
- Micropipeta (100 - 1000) - Cloruro de sodio
- Micropipeta (10 - 100) - Buffer fosfato pH 6.8
- Pinza de madera
6.4. PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO I: Recolección de la saliva.
Uno de los alumnos procederá a enjuagarse repetidas veces la cavidad oral con abundante
agua; luego mantendrá la boca cerrada por un espacio de 7 minutos, evitando pasar la saliva.
La saliva acumulada se colectará en un beaker dejando caer por gravedad la saliva acumulada
para evitar la formación de espuma. Realizar una dilución de la enzima 1/7 con agua
destilada, agitar lentamente hasta lograr la homogeneidad.

PROCEDIMIENTO II: Preparar los siguientes tubos de digestión:
TUBOS DE DIGESTION 1 2 3
Solución de Almidón 1g/dL (mL) 1 1 1
Buffer Fosfato pH 6.8/0.1M (mL) 0.5 0.5 ----
Ácido Clorhídrico 0,5 N (mL) ---- ---- 1.2
Agua destilada (mL) ---- 1.2 0.5
Cloruro de Sodio 0,9 g/dL (mL) 1.2 ---- ----
Llevar los tubos a pre incubación a 37°C por 5 minutos y luego agregar 0,5 mL de saliva
diluida, agitar y mantener los tubos en incubación por 10 minutos más. Luego retirar todos los
tubos de digestión.
PROCEDIMIENTO III
REACCIÓN DE LUGOL: Identificar la presencia de almidón por la aparición de la coloración

azul oscura.
Prepare los siguientes tubos:
Tubos para la Reacción de Lugol 1 2 3

Mezcla del tubo de Digestión 1 (mL) 1 ---- ----
Mezcla del tubo de Digestión 2 (mL) ---- 1 ----
Mezcla del tubo de Digestión 3 (mL) ---- ---- 1
Ácido Clorhídrico 0.5 N (mL) 0.5 0.5 0.5
Solución de Lugol (mL) 1 1 1
PROCEDIMIENTO IV.
REACCION DE BENEDICT: El reactivo de Bénedict en su composición presenta ión cúprico (solución

de color celeste) en medio alcalino, el cual es reducido a ión cuproso en caliente por la presencia
de agentes reductores, en este caso azúcares reductores, observándose una coloración rojo
ladrillo característica. Prepare los siguientes tubos:
Tubos para la Reacción de Benedict 1 2 3

Mezcla del tubo de Digestión 1 (mL) 1 ---- ----
Mezcla del tubo de Digestión 2 (mL) ---- 1 ----
Mezcla del tubo de Digestión 3 (mL) ---- ---- 1
Reactivo de Benedict (mL) 1 1 1
Mezclar y colocar los tubos en baño de agua hirviente por 3 min.

6.5. RESULTADOS
- Evidenciar la coloración azulada de reacción lugol positiva.

- Observar la reacción amarilla de reacción de lugol negativa.
- Evidenciar la coloración de amarillo a rojo ladrillo de reacción Benedict positiva.
- Evidenciar la coloración celeste de reacción Benedict negativa.
6.6. CUESTIONARIO
- ¿Cuáles son los productos finales de la digestión del almidón por la α amilasa?
- ¿Rol del NaCl en el sistema de reacción?
- ¿Qué función cumple el HCl 0,5 N en el tubo 3 de digestión? Calcular el pH en este tubo.
- Fundamento de la reacción de Lugol y Benedict.
- Cite los disacáridos y monosacáridos que son reductores y no reductores e indique a que
se debe esta característica.
- Que hubiera pasado si el donante de saliva hubiera ingerido alimentos y no hubiera
realizado un buen enjuague bucal al colectar la saliva. Explique
Mosby; 2011.
- http://med.javeriana.edu.co/fisiologia/autoestudio/FISIOLOGIAPANCREAS.PDF

PRÁCTICA N° 07
AISLAMIENTO DE GLUCÓGENO HEPÁTICO - CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA
7.1. MARCO TEÓRICO
Los seres vivos almacenan hidratos de carbono en forma de polisacáridos, que sirven como
materiales de reserva. El almidón, la inulina en los vegetales superiores y el glucógeno en los
animales. El glucógeno consta de unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos alfa
(1-4) y cada 8 ó 10 unidades de glucosa se ramifica en enlace glicosídico alfa (1-6). El
glucógeno es especialmente abundante en el hígado y en músculo. Esta práctica consiste en
el aislamiento de glucógeno hepático de rata. La Extracción consiste en que el glucógeno
presente en una muestra de tejido hepático y posterior hidrólisis ácida que despolimeriza al
glucógeno y genera una disolución ácida de glucosa (hidrolizado). En esta Práctica el
glucógeno se libera de los tejidos que lo contienen por calentamiento con una base fuerte
(KOH) hasta la destrucción total del tejido. La separación del glucógeno del tejido se consigue
mediante la adición de etanol (precipita polisacáridos y elimina los monosacáridos solubles)
y sulfato de sodio (coprecipitante). Así, se produce un precipitado que contiene una mezcla
de glucógeno, proteínas y ácidos nucleicos, que han resistido el calentamiento anterior.
El tratamiento posterior con ácido tricloroacético (TCA) hace que precipiten las proteínas y
ácidos nucleicos de la mezcla. El glucógeno aislado se vuelve a precipitar con etanol,
obteniéndose una preparación con un alto grado de pureza. Entre los carbohidratos, la
glucosa es el que se usa principalmente en el metabolismo energético. Constituye el principal
componente de los productos de la digestión de almidones y otros hidratos de carbono. Se
trata de una molécula de seis carbonos, es una hexosa con que se encuentra en sus formas
aldehídica y enólica. Tiene un peso molecular de 180 y es muy higroscópica, siendo uno de los
principales componentes de la presión osmótica de la sangre. En la segunda parte de esta
práctica cuantificaremos la glucosa presente en el residuo obtenido del aislamiento del
glucógeno hepático, utilizando el método enzimático en cual consiste que la glucosa por
acción de la glucosa oxidasa produce ácido glucónico y peróxido de hidrógeno; este último por
acción de la peroxidasa oxida a la 4-aminofenazona generando la oxazona de color rosado,
color que es proporcional a cantidad de glucosa y medible a 505 nm.
7.2. COMPETENCIAS
- Conceptuales: Explica los mecanismos del metabolismo del glucógeno hepático y Explica
los fundamentos de la cuantificación de la glucosa en una muestra.
- Procedimentales: Realiza el aislamiento, cuantificación por peso del glucógeno hepático

y cuantificación glucosa en la muestra obtenida.
- Actitudinal: Demuestra capacidad analítica, puntualidad, diligencia y orden, interpreta

los cambios patológicos encontrados y coopera con el grupo respetando las reglas
acordadas, brinda ayuda oportuna a sus compañeros.
- Piceta 500ml. - Pinza de madera

- Balanza analítica - Pipeta serológica 10ml.
- Baguetas - Baño maría
- Olla de cocina - Espectrofotómetro
- Beaker 250ml. - Micropipeta (100 - 1000)
- Trípode de metal - Gradillas de metal
- Pipeta serológica 5ml - Micropipeta (10 - 100)
- Propipeta de jebe - Tubo de ensayo 13 x 100
- Tubo de ensayo 16 x150 - Material de disección

- Etanol - Tabla de cortar
- Reactivo de glucosa-oxidasa - Solución de sulfato de sodio (saturado)
- Ácido Tricloroacetico (TCA) - Hígado de res o de cerdo congelado o
- Glucosa (estándar) recién extraído
- Hidróxido de potasio
7.4. PROCEDIMIENTO HOMOGENIZADO:
1. Se ponen 3 mL de la solución de hidróxido potásico al 30% en un tubo de ensayo de vidrio

de 16X150.
2. Se pesan 4 g de tejido (hígado) y se introducen en el tubo anterior.
3. Se calienta en un baño de agua hirviendo, homogenizando con cuidado para acelerar el

proceso, durante 10 minutos (o hasta su digestión). USAR PINZAS DE MADERA PARA
MANIPULAR LOS TUBOS¡¡¡ PRECAUCION: ALCALI HIRVIENDO!!
4. Se enfría el tubo bajo el grifo una vez acabada la digestión.
PURIFICADO:
5. Una vez enfriado el tubo de ensayo, se añaden 0.2 mL de la solución saturada de Na2SO4
y se mezclan fuertemente. Reposar 5 minutos.
6. Se precipita el glucógeno que está en solución por adición de 7 mL de Etanol al 95%. Se

agita y deja en frío en un baño de hielo durante 5 minutos.
7. Se pasa la solución a 2 tubos de vidrio de 13x100 y se centrifuga a 4,000 rpm durante 5

minutos. Se desecha el sobrenadante y se coloca el tubo invertido sobre papel de filtro.
8. Se añaden 3 mL de la solución de TCA al 10% a cada tubo y se disuelve totalmente el

sedimento agitando fuertemente.
9. Se centrifuga de nuevo 5 minutos a 4,000 rpm
10. Se añade los 2 sobrenadantes obtenidos en la última centrifugación a un tubo de ensayo

de 16x150, al que previamente se han añadido 10 mL de etanol al 95%, desechando el
sedimento de la centrifugación. Se deja reposar 5 minutos para que se produzca la
precipitación del glucógeno.
11. Se traslada la solución 2 tubos de vidrio de 13x100 (previamente pesados), y se centrifuga

durante 5 minutos más a 4,000 rpm. Una vez acabada la centrifugación se descarta el
sobrenadante. El sedimento obtenido representa el glucógeno prácticamente exento de
sustancias contaminantes. Dejar secar en la estufa a 37°C y volver a pesar los 2 tubos.
12. Obtener la diferencia en peso de los tubos y sumarlas (este será el peso de glucógeno
aislado de 4 g de tejido (hígado)
13. Separar del producto anterior obtenido medio mililitro de muestra y trabajarlo como a
continuación se indica.
TUBOS B ST MP
Muestra (uL) ---- ---- 100
Solución estándar 100 mg/dL (uL) ---- 10 ----
Reactivo enzimático (mL) 1 1 1

Llevar los tubos a incubar en baño maría a 37°C por 5 min.
Retirar los tubos del baño de agua, mezclar y llevar a leer al espectrofotómetro a 505 nm.
Hallar el FC y la concentración de la muestra. Luego dividir entre 10
7.5. RESULTADOS
- Al finalizar cada grupo presentara los resultados obtenidos.

- Indicar el rendimiento total en glucógeno y calcular el contenido en glucógeno del
hígado, expresándolo en mg de glucógeno por g de tejido fresco.
- Expresar la concentración de glucosa que se pueda encontrar en la muestra.
7.6. CUESTIONARIO
- Además de la insulina y glucagón, que otras hormas tienen injerencia en el control de la

glucosa sanguínea.
- Existen plantas y/o productos naturales que regulan la glicemia, cuales son, que origen
tiene y como son administrados.
- ¿Qué otros métodos para determinación de glucosa existen?
- ¿Se excreta glucosa por la orina de manera normal? ¿Por qué?
Mosby; 2011
- http://www.fmv-
uba.org.ar/grado/medicina/ciclo_biomedico/segundo_a%C3%B1o/bioquimica/Seminario
10/sem10file2.pdf
- http://ocw.unican.es/ciencias-de-la-salud/bioqumica/material-de-clase-1/Tema17-
Glucogeno08-09.pdf
- http://www.uv.es/jcastell/2_Glucogeno_degradacion.pdf
- http://www.veoapuntes.com/MEDICINA/1/BIOQUIMICA%20METABOLICA/t7-
metabolismo- del-glucogeno.pdf
SEMANA N° 08
PRIMER EXAMEN ESCRITO

PRÁCTICA N° 09
HIDRÓLISIS DE LAS GRASAS POR ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA
9.1. MARCO TEÓRICO
Los lípidos o grasas, son un conjunto de compuestos orgánicos que se caracterizan por ser
apolares o tener muy poca solubilidad en agua, pero solubles en solventes orgánicos. Entre
los lípidos se encuentran triacilgliceroles, ceras, esteroles, fosfolípidos, glucolípidos; cada
uno con una función determinada en el organismo. Son esenciales, pues cumplen función
energética, de reserva, de defensa, hormonal, estructural, etc. Los triacilgliceroles
constituyen la principal forma de almacenamiento de los lípidos en el organismo, esto se
acumulan en el tejido formando inmensas vacuolas que llegan hasta desplazar el núcleo
hacia la zona periférica del citoplasma. Después de su ingestión, los lípidos son digeridos por
la lipasa, enzima esterhidrolasa presente fundamentalmente en el jugo pancreático,
requiriendo de la colipasa para realizar la hidrólisis de las grasas. Además, por su
característica apolar se requiere de un agente que reduzca la tensión superficial, esta
función la tienen las sales biliares que permiten la formación de micelas en un proceso de
emulsión y saponificación, de allí el rol de la bilis en la digestión. La lipasa pancrática
hidroliza los enlaces ester ya sea en posición 1 o 3 del triacilglicerol (TAG) obteniéndose
como productos a ácidos grasos libres (AGL) o 2-monoacilglicero (2-MAG). Este último puede
ser hidrolizado por medio de la transferencia del grupo acilo en posición 2 hacia la posición
1 o 3 por medio de la isomerasa lipasa y ser finalmente hidrolizado a glicerol y AGL. En la
práctica observaremos la digestión de un aceite comestible vegetal, para lo cual se
empleará una solución de pancreatina, la cual contiene disuelta un extracto de jugo
pancreático, en la cual se encuentra las lipasas. Así mismo se observará la acción de las
sales biliares. La medición de la digestión se realizará por medio de una titulación ácido
base, midiendo la acidez libre generada durante la hidrólisis utilizando una solución de
NaOH, y como indicador a la Fenolftaleína, la cual vira a rojo grosella por el exceso de
NaOH en la titulación.
9.2. COMPETENCIAS
- Conceptuales: Define e identifica los procesos de digestión de los lípidos y menciona

los fundamentos de la determinación.
- Procedimentales: Realiza las pruebas de medición y control para la hidrólisis de

los lípidos. Ejecuta una titulación y cuantificación de ácidos grasos.
- Actitudinal: Observa la importancia de la actividad enzimática de la lipasa en el

proceso de hidrólisis de las grasas.
- Baguetas - Soporte universal

- Beaker 250ml. - Tubo de ensayo 16 x150
- Pipeta serológica 5ml. - Aceite vegetal neutralizado
- Pipeta serológica 10ml. - Fenolftaleína
- Micropipeta (100 - 1000) - Hidróxido de Sodio
- Propipeta de jebe - Solución buffer fosfato pH 8.0
- Piceta 500ml. - Sales biliares
- Buretas 25ml. - Solución de pancreatina
- Mariposas

9.4. PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO I: HIDRÓLISIS.
Realizar el siguiente protocolo de trabajo.
TUBOS 1 B1 2 B2
Aceite Neutralizado (mL) 1 -- 1 --
Sol. Buffer Fosfato 0.1M pH:8 (mL) -- -- 2 2
Sales Biliares 1% en Buffer (mL) 2 2 -- --
Agua destilada (mL) 2 3 2 3
Sol. Pancreatina 1% en Buffer (mL) 5 5 5 5
Tapar, agitar los tubos y llevarlos al baño maría a 37°C por 60 min (agitar el tubo cada
10 minutos)
PROCEDIMIENTO II: TITULACIÓN.
1. Preparar la bureta, colocándola en el soporte universal y agregando NaOH 0,05 N,

de manera tal que la punta esté llena y la bureta enrazada a cero.
2. Retirar los tubos del baño de agua.
3. Titular cada uno de los tubos agitando constantemente, hasta obtener de manera
permanente un color rosado pálido o tenue.
4. Anote el gasto generado en cada tubo de ensayo.
9.5. RESULTADOS
- Obtener el gasto final del agente titulante.

- Calcular el número de miliequivamentes (mEq) de ácidos grasos libres: Este será igual
al número de miliequivalentes de NaOH utilizados para neutralizar los ácidos grasos
libres.
Normalidad del NaOH: Número de mEq

Volumen del NaOH gastado(mL)
- Calcular el porcentaje de ácidos grasos libres:
Porcentaje de Ácidos : Grasos libres

(Vol. del titulado en mL)(Normalidad del NaOH)(Nº de mEq) Cantidad de Muestra Problema (mL)

9.6. CUESTIONARIO
a) Qué función cumple las sales biliares en la presente práctica.
b) Qué es el aceite neutralizado, y por qué fue necesario usarlo de esta manera.
c) Que función cumple los tubos blancos B1 y B2 en la práctica. d) Para qué es necesario
agitar los tubos.
e) Expresar los miliequivalentes hallados en mEq por litro de sustrato. f) Por qué en el
tubo 1 hubo mayor gasto de NaOH.
g) Si se hubiera usado un NaOH de 0,15 mol/L, cuanto de este se hubiera gastado en la
titulación de cada uno de los tubos de la práctica.
h) Y si el NaOH hubiera sido 0,005 N que volúmenes se hubieran gastado.
Mosby; 2011.
- http://med.javeriana.edu.co/fisiologia/autoestudio/FISIOLOGIAPANCREAS.PDF
- http://www.sefh.es/fh/83_6.pdf
- http://www.odontochile.cl/archivos/segundo/fisiologia/pancreasdigestionyabsorcion.p
df
- http://www.fodonto.uncu.edu.ar/upload/metabolismo-de-lipidos-claudio-fader-
odonto.pdf

PRÁCTICA N° 10
LÍPIDOS: SOLUBILIDAD Y SAPONIFICACIÓN
10.1. MARCO TEÓRICO
Designamos con el nombre de Lípidos a una serie de Principios Inmediatos de naturaleza

química heterogénea, pero cuyo carácter común es su insolubilidad en agua, y su solubilidad
en disolventes orgánicos. A los de composición química más sencilla se les denomina lípidos
simples son compuestos ternarios formados por C, O y H y resultan de la unión de ácidos
grasos con alcoholes mediante un enlace tipo éster. Entre los lípidos simples merecen
destacarse los glicéridos que son triésteres de ácidos grasos con glicerol. Un ejemplo son las
grasas animales y los aceites vegetales.
Estos son líquidos a la temperatura de 20ºC debido a la presencia de ácidos grasos
insaturados (oleico, linolénico, araquidónico), mientras que en las grasas animales de
reserva predominan los ésteres palmíticos y esteáricos cuyo punto de fusión es superior
a 50ºC. En general, los lípidos se acumulan a modo de gotitas en el interior de las células
animales y vegetales, de donde pueden ser extraídos mediante los denominados disolventes
de grasa: éter, cloroformo, benceno, petróleo, sulfuro de carbón. En los animales pueden
acumularse en las células del cuerpo, en el hígado de muchos peces (hasta el 90% del peso
total), y en el tejido adiposo de los mamíferos. En los vegetales, las grasas se acumulan en
las semillas y son utilizadas para la germinación.
10.2. COMPETENCIAS
- Conceptuales: Describe las propiedades de los lípidos según los diferentes solventes
orgánicos utilizados y el concepto de saponificación.
- Procedimentales: Comprueba la solubilidad de los lípidos en disolventes orgánicos

y explica el concepto de saponificación y realiza la saponificación.
- Actitudinal: Demuestra capacidad analítica en el proceso de obtención de los productos

de la saponificación, demostrando los fundamentos de sus reacciones químicas
- Baguetas - Espátula de metal pequeña

- Beaker 100ml. - Tubo de ensayo 13 x 100
- Pipeta serológica 5ml. - Aceite vegetal
- Pipeta serológica 10ml. - Acetona
- Probeta 25ml. - Cloroformo
- Probeta 100ml. - Etanol
- Micropipeta (100 - 1000) - Hidróxido de Potasio
- Propipeta de jebe - Sales biliares
- Piceta 500ml. - Laurilsufato de Sodio
- Baño maría - Tween60
- Balanza analítica
10.4. PROCEDIMIENTO
1. Saponificación de las grasas: En un beaker de 100 mL, colocar 10 gramos de manteca

de cerdo, en otro 10 g de manteca de res y en otro 10 g de manteca de pollo, añadir
20 mL de Hidróxido de Potasio 50%, y 20 mL de Etanol 96º, calentar en Baño maría
durante al menos 30 minutos a 80ºC, observar.
2. Ensayo de la solubilidad: tomar 4 tubos de ensayo y enumerarlos del 1 al 4, luego:

TUBOS 1 2 3 4
Aceite Vegetal (gotas) 4 4 4 4
Agua destilada mL 2 --- --- ---
Etanol mL --- 2 --- ---
Acetona mL --- --- 2 ---
Cloroformo mL --- --- --- 2
3. Preparar 20mL de solución de Sales biliares al 1%, 20mL de solución de Laurilsulfato de

Sodio al 1% y diluir Tween 60 en 20mL de agua destilada.
4. Dispersión de Lípidos en Agua: Tomar 4 tubos de ensayo y enumerarlos del 1 al 4, luego:
TUBOS 1 2 3 4 5
Aceite Vegetal (gotas) 4 4 4 4 4
Agua destilada mL 4 4 4 4 4
Sol de sales Biliares 1% mL --- 4 --- --- ---
Sol de Laurilsulfato 1% mL --- --- 4 --- ---
Sol Tween 60 mL --- --- --- 4 ---
Jabón (obtenido de la saponificación) (gotas) --- --- --- --- 4
10.5. RESULTADOS
- Al finalizar cada grupo presentará los resultados obtenidos.
10.6. CUESTIONARIO
- Realice la fórmula del compuesto saponificable obtenido y explique la solubilidad de

los lípidos en cada solvente.

Mosby; 2011
- http://ucvvirtual.edu.pe/campus/HDVirtual/700426354/Teor%C3%ADa/7000001834/Te
cNoAl_08.pdf
- http://tuylaquimica.files.wordpress.com/2011/03/saponificacic3b3n-de-grasas-y-
aceites.pdf

PRÁCTICA N° 11
COLESTEROL OBTENCIÓN E IDENTIFICACIÓN
11.1. MARCO TEÓRICO
El colesterol es un lípido antipático que se encuentra en los tejidos y en las lipoproteínas

plasmáticas como colesterol libre o éster de colesterol. Es un componente esencial de las
membranas celulares. Es sintetizado en numerosos tejidos a partir de Acetil–CoA y
finalmente eliminado del organismo en la bilis, ya sea como colesterol o como sales biliares.
El nivel sérico de colesterol ha sido objeto de muchas investigaciones en individuos sanos
y enfermos. Su concentración en la sangre es variable con la edad, el tipo de dieta, el sexo
y en diversas condiciones clínicas. El colesterol es uno de los factores contribuyentes a la
formación de ateromas. Aproximadamente la mitad del colesterol que tiene el organismo,
resulta de la síntesis endógena y la otra mitad proviene de la dieta. El tejido hepático es
el principal formador de colesterol, seguido de los intestinos y la piel. Los niveles de
colesterol total en sangre varían desde 140 mg/dL en jóvenes, 200 mg/dL en adultos y
adulto mayor, sin embargo, existe bibliografía que indica el límite para los adultos mayores
de 250 mg/dL. Se sabe que el riesgo de enfermedad cardiaca coronaria es tres veces mayor
en varones adultos cuando los niveles son mayores de 230 mg/dL y aumenta a 6 veces en
individuos con más de 260 mg/dL de colesterol sérico; de aquí la importancia del control
de los niveles de colesterol sanguíneo. En la práctica el colesterol será extraído del tejido
cerebral de un animal (pollo) por diferencial de solubilidad y luego se determinará
empleando un método enzimático colorimétrico. Inicialmente los esteres de colesterol son
hidrolizados por el colesterol éster hidrolasa en colesterol libre y ácidos grasos. El colesterol
libre es oxidado por el colesterol oxidasa generando en el medio de reacción colest-4-en-3-
ona y peróxido de hidrógeno; este último por medio de la peroxidasa y en presencia de 4-
amino fenazona y fenol forma un complejo coloreado el p-benzoquinona monoimino
fenazona, que es de color rosado rojiso, directamente proporcional a la concentración de
colesterol que se mide a una longitud onda de 520 nm.
11.2. COMPETENCIAS
- Conceptuales: Explica los procesos de obtención de colesterol a partir de tejido cerebral

y relaciona los reactivos usados con la función de estos en la determinación
colorimétrica de colesterol.
- Procedimentales: Extrae colesterol de tejido cerebral, realiza las pruebas de medición
volumétrica y colorimétrica para la determinación de colesterol.
- Actitudinal: Demuestra interés en la obtención del colesterol en tejidos, observando
su importancia como componente importante en la constitución celular
- Baguetas - Espátula de metal pequeña

- Beaker 100ml. - Placa Petri 15x100
- Pipeta serológica 2, 5,10 mL - Tubo de ensayo 13 x 100
- Propipeta de jebe - Acetona
- Piceta 500ml. - Éter
- Baño maria - Etanol
- Espectrofotómetro - Colesterol (estándar)
- Balanza analítica - Reactivo de colesterol
- Centrifuga - Micropipeta (10 – 100)
- Material de disección - Micropipeta (100 - 1000)
- Tabla de cortar

11.4. PROCEDIMIENTO
1. Obtener un día anterior 10g cerebro de res y refrigerar para su conservación.
2. Pesar fracciones del cerebro de 2.5g cada uno
3. En un Beaker de 10 mL triturar el cerebro con una bagueta añadiendo acetona (1 mL

por cada 0.5 g de cerebro), hasta que quede desecho.
4. Verter el homogenizado en un tubo de ensayo y centrifugar a 3000rpm por 2 minutos.
5. Retirar con una pipeta pasteur todo el sobrenadante en otro tubo de ensayo y rotularlo
como “FRACCION I”.
6. Al homogenizado sedimentado agregar 2mL de Acetona, homogenizar en un vortex y

volver a centrifugar a 3000rpm por 2 minutos.
7. Extraer el sobrenadante con una pipeta pasteur y juntarlo con el primer sobrenadante
obtenido. Esta fracción contiene principalmente colesterol, pero también tiene en
menor cantidad grasas neutras.
8. Mantener el resto de cerebro sedimentado a temperatura ambiente dentro de la

campana de extracción, durante 5 minutos para que se evaporen los restos de acetona.
9. Adicionar 3 mL de éter al sedimento y agitar en vortex. Centrifugar a 3000rpm por 2

minutos.
10. Retirar con una pipeta pasteur todo el sobrenadante en otro tubo de ensayo y rotularlo
como “FRACCION II”.
11. Añadir al homogenizado sedimentado 2 mL de éter, homogenizar en vórtex. Centrifugar

a 3000rpm por 2 minutos
12. Retirar con una pipeta pasteur todo el sobrenadante y juntarlo con el sobrenadante de
la “FRACCION II” Esta fracción contiene fosfolipídos.
13. Adicionar 3 mL de etanol al 95% caliente (70°) al homogenizado sedimentado y agitar

con la bagueta. Centrifugar y colocar el sobrenadante en un tubo rotulado como
“FRACCIÓN III”, la cual consiste principalmente de glucolípidos. Repetir la extracción
con otros 3 ml de etanol y descartar el residuo. Finalmente descartar el sedimento.
14. De la FRACCION I tomar 0.1mL y verter en otro tubo para su medición de colesterol.
Desecar por circulación de aire.
15. Pesar 3 placas Petri y luego verter el contenido de las fracciones en cada una de las
placas. Luego desecar y volver a pesar las placas. La diferencia de peso corresponde
al peso del material extraído. Anotar los pesos.
16. Cuantificar la cantidad de colesterol en el tubo con 0.1mL de la FRACCION I,

agregando 1mL de Reactivo, y proceder según protocolo de trabajo:

TUBOS BLANCO ESTANDAR MUESTRA
Muestra desecada uL ---- ---- 100
Estándar (100mg%) uL ---- 10 ----

Reactivo para
mL 1 1 1
Colesterol
11.5. RESULTADOS
- Obtención de colesterol, describir los cristales blanquecinos en la placa “FRACCION I”.
- Determinación de la concentración de colesterol en el sobrenadante y en el tejido

encefálico.
- Calcule el porcentaje de cada una de las fracciones, colocando los datos en la siguiente
tabla:
RENDIMIENTO RENDIMIENTO
FRACCION
(g) (%)
COLESTEROL
FOSFOLIPIDOS
GLUCOLIPIDOS
11.6. CUESTIONARIO
1. Durante la extracción de los lípidos, ¿Qué ocurrió con las proteínas del tejido? Explique.
2. Haga una lista de disolventes orgánicos en orden decreciente de polaridad.
3. De los siguientes lípidos: colesterol, fosfolípidos y glucolípidos ¿Cuál es la de mayor
polaridad y cual la de menor polaridad?
4. ¿Qué otro tipo de moléculas lipídicas se deben encontrar en el tejido cerebral?
5. ¿Qué otros métodos se conocen para aislar y purificar lípidos?
Mosby; 2011

PRÁCTICA N° 12
IDENTIFICACIÓN Y VALORACIÓN DE LA VITAMINA C EN CÍTRICOS
El Perú es un país productor de frutas, uno de los principales frutos cultivados es la naranja,
los principales méritos nutritivos de esta fruta es el elevado contenido en vitamina C,
soluble en agua, que apenas se acumula en el organismo, lo que implica que debe ser
ingerida diariamente, de modo que la Cantidad Diaria Recomendada (CDR) de vitamina C es
de 60 mg. En esta práctica se va a determinar el contenido de vitamina C de un zumo de
naranja (obtenido a partir de naranjas de la zona) mediante una valoración (titulación)
redox utilizando disolución de tiosulfato de sodio como agente valorante (titulante). La
vitamina C (ácido ascórbico) es oxidada por un oxidante suave como una disolución de
yodo para dar lugar a ácido deshidroascórbico según la reacción.
El ácido ascórbico en presencia de iodo, se oxida, siendo el iodo el oxidante para la

realización de este proceso redox.
El proceso anterior lo realizamos con exceso de oxidante. El iodo en exceso se obtiene al
hacer reaccionar el iodato de potasio con el ioduro de potasio.
Cuando el ácido ascórbico se oxida en presencia de exceso de iodo, se transforma en
el ácido deshidroascórbico.
Se añada ioduro de potasio para que se produzca el iodo libre.
Se añade también ioduro de potasio en exceso sobre el iodato de potasio, para impedir que
el iodo escape.
Conocida la cantidad de iodo generada, procedemos a valorar el exceso de iodo que sobra
después de valorar el ácido ascórbico con una disolución de tiosulfato de sodio de
concentración conocida, es decir procedemos a la realización de una valoración por
retroceso.
IO3K + 6 HCl + 5 KI ▬▬▬► 3 I2 + 3 H2O + 6 XCl
Como indicador para esta reacción química redox, vamos a emplear una sustancia que
presenta actividad redox, la cual presenta distintos colores en su forma oxidada y
reducida, esta sustancia es el almidón.
En aquellos en que el reductor sea el yoduro de potasio y sobre él se haga reaccionar el

oxidante que se desea valorar, el yodo puesto en libertad y cuya cantidad es equivalente
a la del oxidante, se valora con una solución titulada de tiosulfato de sodio; esta solución
es de uso general en todos los métodos yodométricos en los que se pone yodo en libertad;
así pues, la reacción fundamental de estos procesos es la siguiente:
2 Na2S2O3 + I2 Na2S4O6 + 2 NaI

12.2. COMPETENCIAS
- Conceptuales: Explica los efectos de las vitaminas hidrosolubles en el cuerpo

humano, así como su déficit.
- Procedimental: Determina el contenido de ácido ascórbico de una naranja.
- Actitudinal: Demuestra capacidad analítica, diligencia y orden; coopera con el

grupo respetando las reglas acordadas, brinda ayuda oportuna a sus compañeros.
- Baguetas - Olla de cocina

- Beaker 100ml. - Tripode de metal
- Beaker 250ml. - Pinza de madera
- Micropipeta (10 - 100) - Tubo de ensayo 13 x 100
- Micropipeta (100 - 1000) - Gradillas de metal
- Probeta 25ml. - Solución de ioduro de potasio
- Probeta 100ml. - Solución de iodato de potasio
- Buretas 50ml. - Ácido clorhídrico concentrado
- Mariposas - Solución de tiosulfato de sodio
- Embudo mediano - Solución de almidón
- Soporte universal - Reactivo Benedict cualitativo
12.4. PROCEDIMIENTO
DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE LA VITAMINA C
1. Obtener el jugo de 1 naranja y colarlo con una gasa

2. Agregar 3mL del jugo de naranja en un Beaker de 250mL
3. Agregar 20mL de Ioduro de Potasio (KI) y 20mL de Iodato de Potasio (IO3K) al matraz
con el jugo de naranja.
4. Agregar 3mL de HCL concentrado
5. Agregar 0.5mL de solución de almidón (indicador).
6. En la Bureta agregar el Tiosulfato de Sodio hasta el ras que indica cero.
7. Dejar gotear el Tiosulfato de Sodio al matraz con la solución preparada homogenizando
con una bagueta hasta que desaparezca por 10 segundos el color violáceo producto de
la reacción del almidón con el exceso del Yodo que no reaccionó con la Vitamina C
8. Anotar el gasto de Tiosulfato de Sodio utilizado en la titulación.
DEMOSTRACION DE LA CAPACIDAD REDUCTORA DE LA VITAMINA C
1. Del jugo de naranja obtenido, tomar 2mL y colocarlo en un tubo de pyrex 13x100
2. Agregar 2mL del reactivo de Benedict
3. Calentar en baño maría hirviente por 2min
4. Observar y explicar la reacción.
12.5. RESULTADOS
1. Hallar el número de moles del Iodato de Potasio (IO3K)
2. Hallar el número de moles del Tiosulfato de Sodio (Na2S2O3)
3. Hallar el número de moles de yodo en exceso que ha sido reducido por el Tiosulfato
de Sodio, sabiendo que según la reacción yodométrica corresponde a la mitad del
número de moles del Tiosulfato de Sodio.
Número de moles del Yodo en exceso = ½ Número de moles de Tiosulfato de Sodio

2. Hallar el número de moles de Yodo generados en la reacción inicial, sabiendo que según
esta reacción corresponde al triple del número de moles del Iodato de Potasio.
Número de moles del Yodo generados=3xNúmero de moles del Iodato de Potasio
3. Hallar el número de moles del Yodo reducido por la Vitamina C, sabiendo que resulta
de la diferencia del Yodo generado al inicio y el Yodo en exceso que redujo con el
Tiosulfato de Sodio. Este número de moles hallado corresponde también al número de
moles de la Vitamina C en la muestra
4. Hallar la masa de la Vitamina C, sabiendo que su PM es 176.12
5. Expresar la concentración de vitamina C en mg/dL o mg%
12.6. CUESTIONARIO
- Explicar con gráficos el fundamento de la reacción ocurrida para determinar la

concentración de la vitamina C
- ¿Qué ocurre con el Benedict cuando reacciona con la vitamina C?
- ¿Qué relación presenta la vitamina C con el Cáncer?
Mosby; 2011
- http://pendientedemigracion.ucm.es/info/analitic/Asociencia/Vitamina%20C.pdf
- http://www.dgadp.uady.mx/salud/articulos/n18_15042010/La.Vitamina.C.como.Anti
oxidante.muchas.cosas.mas.pdf
- http://bvs.sld.cu/revistas/ali/vol14_1_00/ali07100.pdf

PRÁCTICA N° 13
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS: OVOALBÚMINA

El nombre Proteína proviene de la palabra griega “proteios” que significa lo primero. Son
sustancias orgánicas muy complejas presentes en toda la materia viva. Todas las proteínas
contienen además de carbono, hidrógeno, también nitrógeno y a menudo azufre y fósforo.
Además, las proteínas se componen básicamente de 20 unidades estructurales denominadas
aminoácidos unidos por enlaces peptídicos provocando características específicas en
cada una. Las propiedades de las proteínas se ven afectadas por modificaciones en el pH,
la absorción de proteínas mediante intercambio iónico depende del pH, es decir de valores
de pH por abajo del punto isoeléctrico la carga neta de la proteína es positiva y la molécula
se ve absorbida con mayor fuerza en intercambiadores catiónicos como la carboximetil
celulosa sódica. Esta propiedad permite la separación y la purificación de proteínas
mediante cromatografía de intercambio iónico. La movilidad de las moléculas de proteínas
en un campo electrostático también depende del valor de pH. Esta propiedad permitió
desarrollar la técnica de la electroforésis que es una de las más utilizadas en la
investigación de proteínas. Los métodos más utilizados para determinar los niveles de
proteínas en suero o plasma incluyen los fotocolorimétricos, como el método de Biuret,
de Lowry, etc. Los métodos de precipitación y digestión ácida con conversión de amoniaco
y cuantificación de nitrógeno proteico (Kjeldahl) son poco usados. También se pueden
determinar por la densidad óptica de sus diluciones a 280 nm midiendo el contenido de
tirosina y triptófano en las proteínas, pero puede ser utilizado solo en soluciones puras. En
la práctica de determinará de manera cualitativa (de coloración) sobre los grupos
funcionales a las proteínas y aminoácidos. El estudiante conocerá la prueba de Biuret el
cual se basa en que las Proteínas con sulfato cúprico en un medio alcalino dan una
coloración violeta, prueba característica para la identificación de proteínas. Así como La
reacción Xantoprotéica en el cual las proteínas en presencia de ácido nítrico concentrado
y en caliente forman un compuesto, nitroderivado, de color amarillo, que toma un color
anaranjado cuando se alcaliniza la solución. También se impartirá el conocimiento sobre la
desnaturalización de las proteínas al adicionarles sales de metales pesados, solventes
orgánicos, ácidos y bases entre otros y cono estos influyen en sus características físico-
químicas y biológicas
13.2. COMPETENCIAS
- Conceptuales: Explica los efectos de los agentes físicos químicos sobre las proteínas
y cómo influyen en su solubilidad.
- Procedimental: Elabora un cuadro sobre la agresividad de los agentes desnaturalizantes.
- Pipeta serológica 10ml. - Reactivo de Biuret

- Pipeta serológica 5ml. - Ácido nítrico concentrado
- Micropipeta (100 - 1000) - NaOH 20% y 40%
- Propipeta de jebe - Ac Acético glacial
- Piceta 500ml. - NaCl saturado
- Olla de cocina - Reactivo de Hopkins-cole
- Trípode de metal - Reactivo de Millon
- Pinza de madera - Naftol
- Tubo de ensayo 13 x 100 - Hipoclorito de sodio
- Gradilla de metal 15 x 160 - Acetato de plomo
- Reactivo de Ninhidrina

13.4. PROCEDIMIENTO
2 mL de Albumina
Prueba Ninhidrina 2 mL de Reactivo de Ninhidrina Observar y anotar
Calentar en Baño maría hirviente x 1 min
2 mL de Albumina
Prueba de Biuret Observar y anotar
1 mL de Reactivo de Biuret
2 mL de Albumina
10 gotas de Ácido Nítrico concentrado
Reacción Xantoproteica Calentar en Baño maría hirviente x 1 min Observar y anotar
Dejar enfriar
8 gotas de NaOH 20%
2 mL de Albumina
4 gotas de Ac Acético glacial 30%
Prueba de la Coagulación Observar y anotar
1 mL NaCl saturado
2 mL de Albumina
Prueba de Hopkins-Cole Observar y anotar
3 mL de Reactivo de Hopkins-Cole
2 mL de Albumina
Prueba de Millon Observar y anotar
4 gotas de Reactivo de Millon
2 mL de Albumina
5 gotas de NaOH 40%
Prueba de Sakaguchi 8 gotas de Naftol Observar y anotar
10 gotas de Hipoclorito de Sodio 2%
Mezclar bien
2 mL de Albumina
1 mL de NaOH 40%
Prueba para Grupos SH Observar y anotar
1 mL de Acetato de Plomo
13.5. RESULTADOS
- Observar las reacciones ocurridas e interpretar los resultados
13.6. CUESTIONARIO
- Explicar el fundamento de cada prueba realizada
- ¿Cuáles son las aplicaciones prácticas de cada prueba?
- Para la siguiente proteína cuya estructura es: ALA-VAL-GLY-GLU-LYS, ¿Qué prueba
utilizaría para identificarla y por qué?
- Defina usted el termino análisis cualitativo y análisis cuantitativo
- Grafique un enlace peptídico

Mosby; 2011.
- http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201103/201103/leccin_5_pruebas_cualitativa
s_y_cuantitativas_para_determinar aminocidos y_protenas_en_laboratorio.html
- http://lab-bioquimica2011.blogspot.com/2011/09/laboratorio-3-pruebas-de-
aminoacidos-y.html
- http://biokimik2011.blogspot.com/2011/09/objetivos-aplicar-pruebas-
cualitativas.html
- http://polimedia.upv.es/pub/visor/pub.swf?file=/ISANZ/P2_Aminoacidos_DVD_PAL_60
00

PRÁCTICA N° 14
DETERMINACIÓN DE ACIDO URICO
La determinación de ácido úrico en suero se practica muy comúnmente para el diagnóstico

de gota. También se encuentran niveles altos de ácido úrico en leucemia, policitemia,
hiperuricemia idiopática familiar y condiciones asociados con el decremento de la función
renal.
El ácido úrico es una sustancia que forma el hígado cuando ha procesado las purinas, es
decir, compuestos que contienen ciertos alimentos, como carne, pescado, vísceras,
mariscos, frutos secos, embutidos, principalmente. El referido ácido no tiene utilidad en
el organismo, por lo cual se desecha a través de la orina, pero cuando la eliminación no es
óptima, o si su producción es muy abundante, se acumula en las articulaciones con
consecuencias.
Hiperuricemia es la concentración elevada de ácido úrico en la sangre, que puede

depositarse poco a poco en las articulaciones hasta formar cristales, provocando inflamación
y dolor muy intenso, en otras palabras, la temible gota. La gota se produce cuando los
cristales de urato mono-sódicos se forman en las articulaciones, en los tendones y en los
tejidos circundantes. La metabolización de las purinas da lugar al ácido úrico, que
normalmente se elimina por la orina.
Es más probable que se formen cristales ante la presencia de ácido úrico, pero la presencia
en exceso de éste no implica necesariamente que se padezca de gota. Las purinas pueden
ser generadas por el cuerpo a través de las células de desecho o bien por la ingesta de
alimentos ricos en purinas, como, por ejemplo, el marisco. Los riñones son los responsables
de aproximadamente un tercio de la excreción de ácido úrico, mientras que el intestino
es responsable del resto. Es posible que defectos hereditarios en el riñón sean responsables
de la predisposición de las personas para el desarrollo de la gota. La gota es una forma de
artritis que afecta principalmente a hombres entre los 40 y 50 años de edad. Los altos
niveles de ácido úrico en la sangre son causados por alimentos ricos en proteínas.
14.2. COMPETENCIAS
- Conceptuales: Explica los fundamentos para la determinación de Ácido Úrico en sangre

y orina.
- Procedimentales: Realiza la extracción de la muestra, prepara muestras y rotula

convenientemente y determina la concentración de urea en suero.


- Beacker 250 ml - Ácido úrico (uod –pap)

- Pipeta serológica 5ml. - Ácido úrico estándar
- Propipeta de jebe - Guantes quirúrgico
- Micropipeta (10 - 100) - Algodón hidrófilo
- Micropipeta (100 - 1000) - Alcohol 70º
- Probeta 1l - Agujas y sistema vacuteiner
- Piceta 500ml. - Tubos vacuteiner sin aditivo
- Baño maria memmert - Ligadura
- Centrifuga - Puntas amarillas
- Gradilla de metal 15 x 160 - Puntas azules
- Tubo de ensayo 13 x 100
14.4. PROCEDIMIENTO
- Extraer una muestra de sangre sin anticoagulante, esperar a su coagulación (5min aprox.)
y luego centrifugar a 3500 rpm por 5 min. Separar el suero.
- Medir el volumen de orina recolectado en 24 horas, anote el resultado.
- Tomar una alícuota de la muestra de recolección de orina de 24 horas y centrifugar en un

tubo de ensayo 13x100 para trabajar con el sobrenadante.
- Precalentar el sobrenadante a 60ºC por 10 min y diluir la muestra 1/10 con agua
destilada.
14.5. FUNDAMENTO
El ácido úrico es oxidado por la enzima específica uricasa generándose alantoína y H2O2, el
cual en una reacción mediada por la enzima POD, reacciona con el Ac. 3-5-Dicloro-
2-Hidroxi-Bencensulfónico y 4-AAP (4-aminoantipirina) produciéndose un compuesto
coloreado con un máximo de absorción a 520 nm., en cantidad proporcional a la cantidad
de ácido úrico presente en la muestra.
UOD: Enzima Uricasa

POD: Enzima Peroxidasa
14.6 PROCEDIMIENTO
Preparar lo siguiente batería de tubos, realizando blanco, estándar, y la muestra de orina

o suero por duplicado.

14.7. RESULTADOS
- Encuentre la dilución de la muestra en el procedimiento

- Determinar el factor de calibración
- Obtención de la concentración de la muestra urinaria.
- Cálculo de la excreción de urea en 24 horas. (mg/24h)
14.8. CUESTIONARIO
1. ¿En qué otro(s) fluido(s) biológico(s) se determina el Ácido Úrico? ¿Cuál es su
significado?
2. ¿En qué casos se incrementa la formación de Ácido Úrico?
3. ¿Por qué se le conoce como ácido úrico, si no tiene la función acida COOH?
4. Expresar los valores de referencia en términos de mmol/L
5. Describa brevemente la enfermedad de la gota
6. Mencione los fármacos que varía los niveles de uricemia (aumenta, disminuye)
Mosby; 2011.
- http://biosalud.saber.ula.ve/db/ssalud/edocs/articulos/Acurico.pdf
- http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/tutorials/goutspanish/id2191s4.pdf
- http://acuricometabolismo.blogspot.com/
- http://www.binasss.sa.cr/revistas/rmcc/rmedica/478/art5.pdf
- http://cbs.izt.uam.mx/nacameh/v6n1/Nacameh_v6n1_015-024-Valenzuela_etal.pdf

PRÁCTICA N° 15
EXTRACCIÓN DE ADN.
El ácido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado ADN (y también DNA, del inglés

DeoxyriboNucleic Acid), es un ácido nucleico que contiene las instrucciones genéticas
usadas en el desarrollo y el funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos y
algunos virus. El papel principal de las moléculas de ADN es el de ser portador y
transmisor entre generaciones de información genética. El ADN a menudo es comparado
a un manual de instrucciones, ya que este contiene las instrucciones para construir otros
componentes de las células, como moléculas de ARN y proteína. Los segmentos de ADN
que llevan esta información genética se llaman genes, pero otras secuencias de ADN
tienen funciones estructurales, o están implicadas en la regulación del empleo de esta
información genética. Químicamente, el ADN es un largo polímero de unidades simples
llamadas nucleótidos, con un armazón hecho de azúcares y grupos de fosfato unidos
alternativamente entre sí mediante enlaces de tipo éster. Conectado a cada azúcar está
cada uno de los cuatro tipos de moléculas llamadas bases nitrogenadas. La disposición
secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la información.
Esta información es leída usando el código genético, que especifica la secuencia de los
aminoácidos de las proteínas. El código es interpretado copiando los tramos de ADN en un
ácido nucleico relacionado, el ácido ribonucleico (ARN), en un proceso llamado
transcripción. Dentro de las células, el ADN está organizado en estructuras llamadas
cromosomas. Estos cromosomas se duplican antes de que las células se dividan, en un
proceso llamado replicación de ADN. Los organismos Eukaryota (animales, plantas, y
hongos) almacenan la inmensa mayoría de su ADN dentro del núcleo celular y una mínima
parte en los orgánulos celulares mitocondrias, y en los cloroplastos en caso de tenerlos;
mientras que en procarióticas (las bacterias y archaeas) se encuentra en el citoplasma de
la célula. Las proteínas cromáticas como las histonas comprimen y organizan el ADN dentro
de los cromosomas. Estas estructuras compactas dirigen las interacciones entre el ADN y
otras proteínas, ayudando al control de las partes del ADN que son transcritas.
15.2. COMPETENCIAS
- Conceptuales: Define y explica los fundamentos para la extracción del ADN.
- Procedimentales: realiza la ruptura adecuada de la membrana plasmática de la célula

para liberar el núcleo, libera el ADN y lo extrae.

- Baguetas - Motor de licuadora

- Beacker 250ml. - Tabla de picar
- Pipeta serológica 5ml. - Cuchillo
- Pipeta serológica 10ml. - Espátula de metal
- Probeta 100 ml - Balanza digital
- Gradilla de metal 15 x 160 - Embudo de vidrio
- Propipeta de jebe - Cloruro de sodio en polvo
- Tubo de ensayo 16x150 - Bicarbonato de sodio
- Baño maría memmert - Solución de laurilsulfato de sodio
- Vaso de licuadora - Alcohol etílico frío

15.4. PROCEDIMIENTO
1. En primer lugar, cortamos la cebolla en trozos pequeños para poder triturarla con
facilidad en la licuadora.
2. Pesamos con la balanza 3 gramos de NaCl y 5 gramos de bicarbonato sódico. Depositamos

todo en el vaso de licuadora que contiene a la cebolla, agregamos 100 ml de agua
destilada y lo batimos todo.
3. Luego de batirlo en la licuadora, filtramos el contenido con una gasa contenida en un

embudo.
4. Agregamos 10mL de Laurilsulfato (1/6 del volumen de la mezcla), homogenizamos y

dejamos reposar 10 min a temperatura ambiente.
5. Agregamos 10 mL de Jugo de Piña (previamente filtrado con gasa) y homogenizamos

formar espuma, luego incubamos 15 min a 37ºC.
6. La mezcla obtenida se reparte equitativamente en 3 tubos de ensayo de 16x150.
7. Agregamos por las paredes (en zona) 3 mL de Alcohol Etílico frío a cada tubo y dejamos
reposar 5 min a temperatura ambiente.
8. Luego verificamos la aparición del ADN en la interfase y lo extraemos con una bagueta y
observamos.
15.5. RESULTADOS
- Romper la membrana plasmática de la célula eucariota para poder acceder al núcleo

de la célula
- Liberar al ADN
- Extraer el ADN de la cebolla
15.6. CUESTIONARIO
- ¿Qué sucede en cada paso de la extracción de ADN?
- ¿Qué utilidad tiene el Laurilsulfato?
- ¿Cuál es la finalidad de utilizar el jugo de la piña?
- ¿Por qué se utiliza alcohol etílico frío?

Mosby; 2011
- Médica Panamericana; 2006.
mol/pdfs/39%20AISLAMIENTO%20Y%20PURIFICACI%C3%93N%20DEL%20DNA%20DE%20UN%2
0PL%C3%81SMIDO%20RECOMBINANTE.pdf
- http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp4.pdf
- http://www.mdp.edu.ar/agrarias/grado/741_Intr_Biotecnologia/archivos/4_TPN1_Extr
accion_ADN_Vegetal.pdf
mol/pdfs/42%20AISLAMIENTO%20VISUALIZACI%C3%93N%20ACIDOS%20NUCLEICOS.pdf

Guia de Practicas Bioquimica 2019-I

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3B-2

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA

PAUTAS PARA INFORME DE LABORATORIO - NORMAS DE BIOSEGURIDAD 5

SEMANA N° 08 PRIMER EXAMEN ESCRITO

Uno de los cursos fundamentales en las carreras de la salud es la Bioquímica, el cual

La presente Guía de Prácticas de Bioquímica, está elaborada de acuerdo al Programa de

En cada práctica también se indicará la lista de reactivos y materiales de Laboratorio a

Los experimentos descritos son de fácil ejecución y permiten al estudiante desarrollar su

La presente Guía orienta el procedimiento de las prácticas que complementa el

Mg. Q.F. JOHANNA IVONNE REYES CASTILLO

Cada estudiante debe presentar el informe de la práctica, a la semana siguiente del

• Cada grupo de prácticas se responsabilizará del orden de su zona de trabajo y del

• Sustancias oxidantes (comburentes)

• Sustancias fácilmente inflamables

MATERIAL DE LABORATORIO, INSTRUMENTOS. USO CORRECTO Y MANIPULACIÓN

1.1. MARCO TEÓRICO

Materiales de soporte y sujeción: En cuanto a los materiales de soporte y sujeción, con

F-CV3-3B-2 8 Rev. Junio 2007

Las soluciones, son mezclas homogéneas de sustancias en iguales o distintos estados de

Bastantes propiedades de las soluciones dependen exclusivamente de la concentración. Su

Propiedades físicas de las soluciones: Cuando se añade un soluto a un solvente, se alteran

Concentración de una solución: La concentración de una solución lo da el número de moléculas

F-CV3-3B-2 9 Rev. Junio 2007

Volumen del soluto (mL)

3. Porcentaje peso/volumen (% W/V)

Peso del soluto (g)

UNIDADES QUÍMICAS DE CONCENTRACION

MOLARIDAD: La molaridad es la unidad química internacional que expresa la concentración en

La fórmula esta dad por: M = n/v

Donde: n: es el número de moles y

Donde: W: es el peso de la sustancia y

NORMALIDAD: Es también una unidad de concentración química que indica concentración de un

Donde: Nº Eq: es el número de equivalentes.

El número equivalente de un compuesto queda expresado por:

Donde: W: es el peso de la sustancia y

F-CV3-3B-2 10 Rev. Junio 2007

Donde: PM: es el peso molecular del compuesto correspondiente a la Sustancia

- Procedimentales: Describe y manipula los principales materiales e instrumentos del

1.2. MATERIALES Y EQUIPOS

- Beaker 100ml. - Baño maría

a) Reconocer los diferentes instrumentos.

b) Describir las partes de cada uno de ellos.

c) Realizar la manipulación de uso y transporte.

F-CV3-3B-2 11 Rev. Junio 2007

4) Encuentre los volúmenes de cada una midiendo en una probeta.

5) Encuentre en cada caso la concentración de las soluciones en P/P, P/V, V/V.

1. Coloque en un tubo de ensayo 4 mL de la solución A.

- Manipula correctamente las pipetas automáticas. Se obtendrán soluciones de

- Se obtendrá un buffer fosfato 0,5 molar pH 7,5.

a) ¿Cómo debe ser lavado el material de uso constante en el Laboratorio de Bioquímica?

F-CV3-3B-2 12 Rev. Junio 2007

F-CV3-3B-2 13 Rev. Junio 2007

ESPECTROFOTOMETRÍA: FACTOR Y CURVA DE CALIBRACIÓN

2.1. MARCO TEÓRICO.

El análisis colorimétrico contempla al conjunto de métodos de análisis cuantitativo que se

FÓRMULA: La expresión de relación de la ley de Lamber y Beer está dado por: DO = E = A = l. c. e

Donde: DO: es la densidad óptica.

RELACION ENTRE ABSORBANCIA Y TRANSMITANCIA:

El método consiste en emplear soluciones de concentraciones conocidas y crecientes denominadas

F-CV3-3B-2 14 Rev. Junio 2007

FACTOR DE CALIBRACION (Fc)

El factor de calibración es un término que relaciona la concentración de una sustancia con su