ESTUDIO AISLADO DE PERFUSION HEPATICA

Isolated liver perfusion study

■ Brevemente, después de la inyección intraperitoneal de pentobarbital a una dosis

De 0,25 mg / kg a las ratas, el conducto biliar se canuló con un tubo de polieti.

■ La vena porta fue canulada.con el tubo.

■ Inmediatamente el perfundido que contenía 10% de eritrocitos bovinos fue

suministrado al hígado mediante una bomba peristáltica.

■ La vena cava inferior se ligó y luego se cortó justo debajo de la vena. Después de la incisión
del tórax, se canuló la vena cava inferior a través de la aurícula derecha con un tubo de
vinilo.

■ Finalmente, se ligó la arteria hepática. La perfusión consistió. del 10% del eritrocito bovino
lavado, el 3% de BSA, el 2% de dextrano-70 y el 0,1% de d-glucosa en tampón de
bicarbonato de Krebs-Ringer, que se amortiguó a pH 7,4 y se equilibró con el 95% de
oxígeno y el 5% de Dióxido de carbono a lo largo de los experimentos y mantenido a 37 °C.
La tasa de perfusión se mantuvo a aproximadamente 10 ml / min, el perfusado de
"sangre" de flujo de salida se recogió a intervalos de 5 min durante 60 min, y se recogió la
bilis a intervalos de 10 min para verificar la viabilidad del hígado perfundido.

■ Después de la perfusión de "sangre" recogida se centrifuga a 3000 r.p.m. Durante 10 min a

4 ° C,el “plasma perfusado” obtenido se usa para determinar la concentración de
cilostazol. El valor medio del hematocrito (Hct) de perfusate fue de 0.077 ± 0.003 y la
partición de cilostazol para los eritrocitos se calculó como 2.84 ± 0.03%.

ESTUDIO DE PROTEINA LIGADA

La técnica de ultrafiltración se utilizó para examinar la fracción libre de cilostazol en el

suero y perfusato. Se transfirieron quinientos microlitros de muestras de perfusado de
suero o "plasma" mantenidas a 37 ° C a Microcon Ultracel (YM-30, 30,000 MWCO;
Millipore, Billerica, MA) tratadas previamente con metanol y agua. Después de la
centrifugación a 13,000 r.p.m. Durante 1 minuto, se sometieron a análisis 20 μL de los
efluentes recogidos.

METABOLISMO IN VITRO

Los microsomas preparados a partir de células de insecto infectadas con baculovirus que
expresan la rata CYP1A2, CYP2C11, CYP2C12, CYP2C13, CYP2D1, CYP2D2, CYP3A1, CYP3A2,
citocromo b5 y citocromo P450 reductasa se adquirieron de Becton Dickinson Gentest.
Rata CYP2C11, 2C12, 2C13, 3A1, 3A2 se coexpresaron con el citocromo b5. El microsoma
de control se preparó a partir de células de insecto infectadas con baculovirus de tipo
salvaje. Se compraron microsomas de hígado de rata Wistar macho y hembra de Japón
Charles River. Una mezcla de incubación típica contenía microsomas, EDTA 0,1 mM,
tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,4), sistema generador de NADPH (0,5 mM
NADP +, 2 mM glucosa-6-fosfato, 1 UI / ml de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y 4 mM
MgCl2) y cilostazol. La reacción se inició mediante la adición del sistema generador de
NADPH después de una incubación previa de 1 minuto a 37 ° C. Después de 10 minutos de
incubación, que proporcionó la cantidad de metabolitos generados proporcional al tiempo
de incubación, la reacción se terminó mediante la adición de t-butil metil éter con
estándar interno. Luego, las mezclas se centrifugaron a 3000 r.p.m. Durante 5 min y las
capas orgánicas se evaporaron a sequedad. Los residuos obtenidos se sometieron a
análisis por cromatografía líquida (LC) - espectrometría de masas (MS) / MS como se
describe más adelante.

Análisis farmacocinético
Los parámetros farmacocinéticos in vivo después de la administración oral o intravenosa
fueron calculados por WinNonlin (versión 5.2; Pharsight, Mountain View, CA).
Concentración sérica: los perfiles de tiempo de cilostazol después de la administración se
analizaron mediante el modelo de intravenosa dos compartimentos.
donde Cin y Cout significan las concentraciones de cilostazol en la perfusión de “plasma”
de entrada y salida, respectivamente. Rb representa la relación de concentración de
"sangre" a "plasma" de perfusión, que se determinó que era de 0.952 ± 0.045 de 50 a 100
ng / mL (n = 8). Qh, la sangre expresa el flujo de perfusión de "sangre".
Sobre la base del modelo bien agitado, el aclaramiento hepático intrínseco, CLh, int, se
calculó en el estudio aislado de perfusión hepática y el aclaramiento hepático in vivo fue
deducido basado en la concentración en sangre por la siguiente ec. (13).

Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar de más de tres

experimentos. La significación estadística en la diferencia de las medias se determinó
mediante un análisis de varianza de una vía seguido por Student’s or Welch’s t-test.