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N OTA TÉCNICA

OTA

METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DE CIANOBACTÉRIAS EM


CÉLULAS/ML. UM NOVO DESAFIO PARA O ANALISTA DE LABORATÓRIO

METHODOLOGY TO CYANOBACTERIA CELLS COUNT IN CELLS/ML. A NEW


CHALLENGE FOR THE LABORATORY ANALIST.

FERNANDO ANTÔNIO JARDIM


Mestrado em Saneamento Meio Ambiente e Recursos Hídricos pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG); Biólogo,
formado pelas Faculdades Metodistas Integradas Izabela Hendrix; coordenador do setor de Biologia do Laboratório Metropolitano
(L.M.) da COPASA

SIMONI DE OLIVEIRA CAVALIEREI


Bióloga, formada pelas Faculdades Metodistas Integradas Izabela Hendrix, Belo Horizonte - MG; analista de laboratório do setor
de Biologia do L. M. da COPASA.

PATRÍCIA CASTANHEIRA GALLINARI


Bióloga, formada pela Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, Belo Horizonte - MG; analista de laboratório do setor de
Biologia do L. M. da COPASA e mestranda do curso de Saneamento Meio Ambiente e Recursos Hídricos da Escola de
Engenharia da UFMG.

LENORA N. LUDOLF VIANNA


Mestrado em Microbiologia pela Universidade Federal de Minas Gerais; Bióloga, formada pela Universidade Federal de Minas
Gerais, Belo Horizonte - MG; pesquisadora autônoma do setor de Biologia do L. M. da COPASA.
Recebido: 04/02/02 Aceito:07/08/02

RESUMO ABSTRACT
O trabalho apresenta uma metodologia para a contagem de The paper presents a methodology to cyanobacteria cells count in
cianobactérias (Cyanophyceae) em número de células por mililitro number per millilitre sampled due to real necessity demanded by new
de amostra face à real necessidade exigida pela portaria no. 1469 Brazilian drinking water regulation edict n. 1469 from Health
do Ministério da Saúde (12/2000) aos laboratórios de Ministry 2000/12 to Brazilians sanitation company
hidrobiologia das companhias de saneamento e institutos de hydrobiological departments and research institute, aiming the
pesquisa no Brasil. Com o objetivo de se padronizar a contagem standardisation the cyanobacteria´s cells counting and improve the
das células de cianobactérias e facilitar a execução dos trabalhos laboratory routine work. An adaptation to Area Standard Unit
rotineiros do laboratório, realizou-se uma adaptação ao cálculo (ASU), internationally accepted, was carried out. After the standard
da Unidade Padrão de Área (UPA), aceita internacionalmente. cells counting, this technique was then valued across the direct
Após a padronização dessa contagem, a técnica foi então avaliada application in routine works with good results.
através da aplicação nas análises de rotina, com resultados
satisfatórios.

PALAVRAS-CHAVE: Cianobactérias, metodologia de contagem KEYWORDS: Cyanobacteria, cells counting procedures.


de células.
INTRODUÇÃO das toxinas produzidas por linhagens de se realizavam as análises hidrobiológicas,
algumas espécies desses organismos. Essa as unidades utilizadas para a expressão
A partir da edição da portaria no. exigência legal trouxe um grande do quantitativo eram aquelas já
1469 do Ministério da Saúde em 12/ desconforto às companhias estaduais de padronizadas e propostas por órgãos
2000 passou-se a exigir o monitoramento saneamento, aos serviços autônomos e às competentes. Para tanto, pode-se citar a
das cianobactérias em águas de prefeituras pois, aliada à carência de setores expressão dos resultados em organismos
abastecimento, com o objetivo de que hidrobiológicos nos laboratórios desses por mililitro de acordo com A.P.H.A.
fossem implantados monitoramentos órgãos existia uma falta de padronização (1998) ou por Unidade Padrão de Área
sistemáticos para a tomada de ações das metodologias utilizadas para a (UPA/mL), cujo cálculo é didaticamente
preventivas e corretivas que visassem enumeração do fitoplâncton. De uma explicado pela CETESB (1978). Para
minimizar os impactos à saúde humana, maneira geral, naqueles laboratórios onde ambos os casos a contagem era realizada

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Jardim, F.A. et al

segundo o critério da contagem por con- aplicou nos seus trabalhos rotineiros no colônias de Microcystis ou outras
A TÉCNICA

juntos ou clump counting (BRANCO, laboratório metropolitano da companhia cianobactérias da família Chroococcaceae,
1986), entendendo-se por conjunto a de saneamento de Minas Gerais com contou-se quantas células estavam
unidade característica do gênero, isto é: resultados satisfatórios. contidas num quadrado maior do retículo
uma célula, no caso de seres unicelulares de Whipple (R.W) ao se sobrepor pelo
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livres; uma colônia, no caso de METODOLOGIA menos 30 colônias encontradas


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unicelulares coloniais; um filamento ou aleatoriamente no aumento de 200 vezes.


tricoma no caso de cianobactérias JARDIM (1999) levou em Calculou-se a seguir uma média aritmética
filamentosas. A referida portaria em consideração para aplicar o novo método do número de células contadas. Durante
questão mencionava que o resultado para o extenso intervalo da margem de erro a contagem, utilizando o mesmo aumento,
as cianobactérias passasse a ser expresso proposta pela metodologia da contagem contou-se quantos quadrados maiores do
em número de células por mililitro estimativa (A.P.H.A., 1998) que possui RW se sobrepunham às colônias
amostrado. Além disso, um pouco antes um limite de confiança de 95 ± 20% encontradas e para se estimar o número
da publicação da legislação brasileira que quando se contam 100 organismos da de células, bastou multiplicar o número
substituiu a portaria no. 036 (01/90), espécie predominante. Sendo que esse de quadrados maiores contados, pela
CHORUS & BARTRAM (1999) erro cai para 10% quando se contam 400 média do número de células contadas
elaboraram uma série de recomendações indivíduos da espécie predominante de anteriormente. Já para as cianobactérias
operacionais para se monitorar a presença acordo com a distribuição de Poisson, cuja filamentosas (tricomas) contou-se a
de cianobactérias na água aonde a fórmula é apresentada na equação 1: quantidade de células em pelo menos
expressão dos resultados é dada em trinta tricomas encontrados
número de células por mililitro ou pelo aleatoriamente na amostra. Em ambos os
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biovolume. Criou-se o seguinte impasse: (100% ) (1)
casos, tanto para a contagem do número
como manter toda uma rede de N de células nas colônias quanto nos
monitoramento e tomar medidas tricomas, procurou-se contar um número
operacionais se os resultados das análises onde: N é o número de organismos total por volta de 400 células, pois dessa
não eram expressos em número de células contados da espécie predominante. forma, de acordo com a distribuição de
por mililitro? JARDIM (1999) fez uma Poisson, o limite de confiança foi de ±
adaptação ao cálculo da unidade padrão Os passos para a utilização da 10%. A contagem das células para a
de área, aceita internacionalmente e metodologia foram os seguintes: para as padronização foi realizada por três
diferentes analistas de laboratório. Na
Figura 1 observa-se um desenho
esquemático da sobreposição de uma
colônia em forma de cocos no retículo de
Whipple.

RESULTADOS
A aplicação da metodologia gerou o
seguinte procedimento descrito na Tabela
1.
Após a realização de vários
experimentos verificou-se que o número
de células nos tricomas ou nas colônias
(enumeradas dentro de um dos quadrados
maiores do RW) não sofria grande
Figura 1 - Retículo de Whipple com uma colônia de alteração e além disso, o grau de liberdade
cianobactéria sobreposta do intervalo proposto era muito amplo
Tabela 1 - Procedimento operacional padrão para a contagem do número de células
de cianobactérias em amostras de água.

Etapas Colônias de Cianobactérias Tricomas

Média do número de células (em 30 colônias Média do número de células em 30 tricomas


Antes da contagem
aleatórias) contadas no quadrado maior do RW. aleatórios.

Contar quantos quadrados maiores do RW se


Durante a contagem Contar os tricomas
sobrepõem às colônias encontradas.

Multiplicar a média do número de células


Estimativa do Multiplicar o número de quadrados maiores
por tricoma pelo número de tricomas
número de células contados pela média do número de células.
contados.

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Contagem de cianobactérias

seca e fria e outra na estação quente e chu-

A TÉCNICA
Tabela 2 - Cianobactérias catalogadas com a média do número de célula encontrada
vosa, para países de clima predominante-
± 10% em microscópio invertido no aumento de 200 vezes por ocalidade.
mente tropical como o Brasil.
Localidades em
Cianobactérias Média do número de células encontrada ± 10% CONCLUSÕES
Minas Gerais

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Anabaena planctonica Pitangui 25 por tricoma A metodologia proposta é passível
de ser aplicada em laboratórios de
Anabaena circinalis São Simão 98 por tricoma hidrobiologia podendo sofrer modifica-
ções de acordo com as condições de cada
Anabaena spiroides Pitangui 102 por tricoma laboratório, mas sugere-se a observação
das considerações feitas acima, pois atra-
Radiocystis fernandoi Betim 20 por quadrado maior do RW vés delas, foi possível uma adaptação rá-
Microcystis panniformis Betim 40 por quadrado maior do RW pida ao que é exigido pela portaria no.
1469 do Ministério da Saúde ou seja,
Cylindrospermopsis expressar os resultados em número de
Pedra Azul 10 por tricoma células por mL e promover as medidas
raciborskii
cabíveis de freqüência de monitoramento
Aphanizomenon sp. Três Marias 13 por tricoma e ações operacionais preventivas a fim de
se minimizar os efeitos causados pelas
cianotoxinas em águas de abastecimento.
(± 20% para as análises de rotina). Atra- O aumento utilizado para a conta- REFERÊNCIAS
vés dos resultados das contagens entre os gem das células no presente trabalho foi BIBLIOGRÁFICAS
três analistas de laboratório obtiveram-se de 200 vezes, mas para a contagem de
as médias aritméticas do número de célu- células menores como de algumas AMERICAN PUBLIC HEALTH
las por tricomas ou colônias apresentadas Chroococcaceae utilizou-se aumentos ASSOCIATION. Standard methods for the
na Tabela 2. maiores, mas para isso, as contagens das examination of water and wastewater. 20. ed. Wa-
shington: APHA/WEF/AWWA, 1998.
amostras nos trabalhos de rotina foram
DISCUSSÃO realizadas no mesmo aumento utilizado BRANCO, S. M. Hidrobiologia aplicada à engenha-
ria sanitária. 2. ed. São Paulo: CETESB, 1986. 620
para se contar as células nas colônias. O p.
Apesar do extenso intervalo de con- mesmo procedimento foi utilizado para
fiança permitido pela metodologia (± se contar as células das formas tricomiais BRASIL. Ministério da Saúde - Portaria no. 36/GM
- 01/90 - Diário Oficial, 23/01/1990.
10%) alguns cuidados devem ser toma- (filamentosas) com células mais largas que
dos para se evitar que haja a extrapolação longas (que lembram botões de camisa BRASIL. Ministério da Saúde - Portaria no. 1.469 -
desse intervalo. De preferência, a conta- sobrepostos) de algumas Oscillatoriaceae, 12/2000 - Diário Oficial, no. 35-E, 19/02/2001.
gem das células para a padronização, de- mas nesse caso, depois que foi feita a pa- CETESB, NT 06: L5. 303. Determinação de
verá ser feita sempre que possível com o dronização do número de células por fitoplâncton de água doce - métodos qualitativo e
quantitativo. São Paulo, 1978.
material in vivo, pois em amostras fixa- tricoma, a dimensão do aumento utiliza-
das ou coradas as células modificam a sua do não interferiu em nada ao se contar os CHORUS, I., BARTRAM, J. Toxic Cyanobacteria
forma e o tamanho podendo assim ocor- tricomas nas amostras dos trabalhos de in water: a guide to public health consequences,
monitoring and management. World Health
rer uma superestimação no momento da rotina. Outro fator que interferiu muito Organization. London and New York, 1999. 416
contagem de amostras nos trabalhos roti- durante a contagem das células para a p.
neiros. O contrário também pode ocor- padronização foi a sobreposição das mes- JARDIM, F. A. Implantação e realização de análises
rer, quando se contam indivíduos de mas, mas quando se contou somente o de cianotoxinas com avaliação do potencial tóxico em
amostras cultivadas, onde as células apa- que estava dentro do quadrado maior do estações de tratamento da COPASA MG. Belo
recem em número e tamanho maiores do RW, essa interferência foi menor. Horizonte, 1999. Dissertação de Mestrado -
Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental
que as de amostras naturais, nesse casso, Durante a contagem das amostras - Escola de Engenharia - Universidade Federal de
pode ocorrer uma subestimação no mo- de rotina, desde que tenha-se realizado Minas Gerais.
mento da contagem das amostras de roti- um exame qualitativo à contento, é pos-
na. sível contar separadamente espécies de um
As amostras deverão ser sempre mesmo gênero, cuja diferença entre o Endereço para
coletadas na superfície dos mananciais, número de células ultrapasse os ± 10%, correspondência:
devendo-se evitar a coleta em profundi- permitido pela metodologia, caso contrá-
dade ou após a saída de estações elevatórias rio o resultado poderá ser expresso em Fernando Antônio Jardim
de água bruta (EEAB), essas amostras, ao gênero. Observou-se também durante o Companhia de Saneamento de
microscópio, apresentaram colônias im- trabalho que as células podem modificar Minas Gerais - COPASA
Br 356 - Km 4 - Cercadinho
pregnadas de partículas, o que dificulta a de tamanho e quantidade nas colônias CEP: 31950-640
contagem das células. Além disso, a pre- ou nos tricomas de acordo com variações Belo Horizonte - MG
sença de tricomas já partidos ou até mes- sazonais, por isso, recomenda-se que a Tel.: (31) 3250-2340
mo hormogônios interferem no resulta- padronização proposta seja realizada pelo fjardim@copasa.com.br
do final. menos duas vezes ao ano, uma na estação

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