SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA

EN CAPA FINA
Delgado, Samuel1 González, Karina2
4-799-917 4-797-2380
Curso de Química Analítica II (Qm 228), Escuela de Química, Facultad de Ciencias Naturales y
Exactas, Universidad Autónoma de Chiriquí, David Chiriquí, República de Panamá.

samuel131198@hotmail.com 1 Karinamichelle231998@hotmail.com 2

RESUMEN:
Este laboratorio tiene el objetivo general de aplicar la técnica de cromatografía en capa fina
para la separación e identificación de aminoácidos sobre sílica gel. La cromatografía en
capa fina es un caso de cromatografía de reparto en la que los componentes de una mezcla
se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes. Los elementos del
sistema cromatográfico son: soporte, fase estacionaria (disolvente A), y fase móvil o
eluyente (disolvente B). Es una técnica simple en cuanto al equipamiento necesario (placa
y tanque cromatográfico) y de fácil desarrollo. El parámetro experimental asociado a la
técnica es el Rf (coeficiente de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un
compuesto entre la fase estacionaria y fase móvil, y que depende de su estructura química
y su hidrosolubilidad/liposolubilidad. Entre los resultados más relevantes(Rf), en cercanía a
su valor teórico que se obtienen en las tres cámaras como lo fueron la que contenía (H2O y
EtOH) fue de 0.39 para la Prolina y 0.66 para el Triptófano; para la que contenía
(HAc/H2O/butanol) un 0.36 del Triptófano y 0.31 para la Prolina y en la última cámara con
(n-propanol/ NH4OH), 0.49 para la Prolina y 0.69 la Glicina. Es importante aclarar que estos
Rf son de la mezcla de los diferentes aminoácidos, los demás Rf para los otros aminoácidos
fueron con mucho grado de error. Concluimos que, el volumen de muestra a aplicar es
crítico, ya que se vio afectado a la resolución (separación de los componentes de una
mezcla compleja), y depende de la concentración

PALABRAS CLAVES:
Fase móvil, soluto, eluyente, capilaridad. MARCO TEÓRICO:
OBJETIVOS: La Cromatografía en Capa Fina (TLC) es
una técnica altamente versátil y
 Aplicar la técnica de cromatografía económica para ensayos analíticos y
en capa fina para la separación e preparativos. Ampliamente utilizada en
identificación de aminoácidos numerosos campos científicos, la
sobre silica gel. cromatografía TLC es particularmente
 Revelado de los aminoácidos popular para el monitoreo de reacciones,
mediante la reacción coloreada la purificación de muestras y la
con la ninhidrina identificación de compuestos y
 Calculo del valor de Rf para cada contaminantes en mezclas.
uno de los aminoácidos. (Freifelder,2009).
MATERIALES Y REACTIVOS: PROCEDIMIENTO:
Esquema No 1: aplicación de la
Material Capacidad Cantidad
muestra
Cámara
- 3
cromatografica
Regla 10 cm 1 Placa de silica gel
Placas de
20x20 cm 3
cromatografía
marcar en la
Guía de marcar 10 cm a
parte inferior de
partir del punto de
aplicación - 1 la placa el punto
partida
múltiple de partida

Microjeringuilla 50μL 1
10 mL 1 guia de
inyectar
Probetas aplicación
muestra
5 mL 1 multiple
Papel filtro - 3
Atomizador 50 mL 1 Esquema No 2: Desarrollo de la
cromatografía.
Guantes de
- 1
látex
2 100 mL camara 100 mL de
Vasos químicos cromatografica solvente
2 250 mL

colocar papel filtro en la camara

(satura la camara )
Reactivo Cantidad Concentración
introducir placa al solvente
en forma recorrer 10 cm,
Etanol 30 mL 98% vertical retirar la placa
butanol 80 mL -
Hidróxido de 30 mL - Esquema No 3: visualización de las
amonio
manchas en la placa.
Ácido acético 20 mL Concentrado.
n-Propanol 70 mL - aplicar un rocio de
Glicina 10 mg 0,2μg/μmL secar la placa
ninhidrina
Prolina 10 mg 0,2μg/μmL
Cistina 10 mg 0,2μg/μmL llevar al horno observar
Triptófano 10 mg 0,2μg/μmL dut¡rante 15 mnts manchas

Esquema No 4: evaluación cualitativa;

Equipo Capacidad Cantidad marcar los
delinear las manchas centros de
Balanza 10 mg 1 la mancha
Horno - 1
Cámara de
extracción
- 1
punto de partida
medir distancia
hasta el centro de
de migración
la macha
RESULTADOS: Cuadro No 4: Recorrido de mezclas de
aminoácidos en la placa con etanol y agua
Cuadro No 1: Recorrido de aminoácidos
empleando como solventes n- propanol e Mezcla No 1
hidróxido de amonio Recorrido % de
Aminoácido Rf
(cm) error
Aminoácido
Recorrido
Rf
% de Cistina 0.7 0.07 82.5
(cm) error Prolina 3.9 0.39 11,4
Cistina1 5.5 0.55 103 Triptófano 6.6 0.66 1.53
Cistina 2 5.4 0.54 100 Glicina 8.6 0.86 100
Prolina1 5.8 0.58 53.7 Mezcla No 2
Prolina2 5.7 0.57 54.1 Recorrido % de
Aminoácido Rf
Triptófano1 6.9 0.69 25.4 (cm) error
Triptófano2 7.0 0.70 27.2 Cistina 0.7 0.07 82.0
Glicina1 5.8 0.58 100 Prolina 4.1 0.41 17.1
Glicina2 5.7 0.57 96.5 Triptófano 6.7 0.67 3.1
Glicina 8,6 0.86 100

Cuadro No 2: Recorrido de mezclas de

aminoácidos en la placa con n-propanol e Cuadro No 5: Recorrido de aminoácidos
hidróxido de amonio. empleando como solventes butanol, ácido
acético y agua
Mezcla No 1 Recorrido % de
Recorrido % de Aminoácido Rf
Aminoácido Rf (cm) error
(cm) error Cistina1 0.9 0.09 900
Cistina 5.3 0.53 96.2 Cistina 2 0.8 0.08 788
Prolina 4.9 0.49 32 Prolina1 3,6 0.36 157
Glicina 5.8 0.58 100 Prolina2 3,5 0.35 150
Triptófano 6.9 0.69 25.45 Triptófano1 6.9 0.69 46.8
Mezcla No 2 Triptófano2 6.9 0.69 46.8
Recorrido % de Glicina1 3.1 0.31 72.2
Aminoácido Rf
(cm) error Glicina2 3.1 0.31 72.2
Cistina 5.3 0.53 96.2
Prolina 4.7 0.47 27.0
Glicina 6.9 0.69 25.4 Cuadro No 6: Recorrido de mezclas de
Triptófano 5.8 0.58 100 aminoácidos en la placa con butanol, ácido
acético y agua
Mezcla No 1
Cuadro No 3: Recorrido de aminoácidos
Recorrido % de
empleando como solventes etanol y agua Aminoácido Rf
(cm) error
Recorrido % de Cistina 0.7 0.07 677
Aminoácido Rf Prolina 3.1 0.31 121.4
(cm) error
Cistina1 0.8 0.08 79.5 Triptófano 3.6 0.36 23.4
Cistina2 0.9 0.09 76.9 Glicina 6.9 0.69 283
Mezcla No 2
Prolina1 6,9 0.69 97.1
Recorrido % de
Prolina2 6,9 0.69 97.1 Aminoácido Rf
(cm) error
Triptófano1 8,7 0.87 33.8 Cistina 0.8 0.08 788
Triptófano2 8,6 0.86 32.3 Prolina 3.1 0.31 121.4
Glicina1 4,3 0.43 0 Triptófano 3.6 0.36 23.4
Glicina2 5.7 0.57 96.5 Glicina 6.9 0.69 283
Cuadro No 7: Rf teórico para cada Reacción: Ninhidrina con Aminoácidos
aminoácido en distintas mezclas de
solventes.

Mezcla de
Aminoácido Rf
solvente
Cistina n-propanol/NH4OH 0,27
Prolina n-propanol/NH4OH 0,55
DISCUSIÓN:
Triptófano n-propanol/NH4OH 0,37
En la cromatografía en capa fina, CCF o
Glicina n-propanol/NH4OH 0,29 TLC ("thin-layer chromatography, en la
Cistina etanol/agua 0,39 terminología inglesa) se puede utilizar
como soporte cualquier sustancia que
Prolina etanol/agua 0,65
pueda dividirse en partículas finas y
Triptófano etanol/agua 0,35 distribuirse uniformemente en forma de
Glicina etanol/agua 0,43 láminas. Esto incluye sustancias
inorgánicas (gel de sílice, óxido de
n-Butanol/ácido
Cistina 0,009 aluminio, tierra de diatomeas, silicato de
acético/agua
n-Butanol/ácido magnesio, etc) y orgánicas (celulosa,
Prolina 0,47 poliamida, polietileno, etc). (Shandon
acético/agua
n-Butanol/ácido Scientific Company Ltd.,1996).
Triptófano 0,14
acético/agua
La utilización de soportes hidrófobos
n-Butanol/ácido
Glicina 0,18 facilita la separación de compuestos no
acético/agua
polares (lípidos, por ejemplo). En la CCF,
la fase estacionaria es una lámina de
NOTA: las pruebas se realizaron por 0,25-0,50 mm de espesor, extendida de
duplicado por cada aminoácido y mezcla forma uniforme sobre la superficie de una
de los mismo. Se colocaron todos los placa de vidrio o plástico. Aunque muchas
resultados en los respectivos cuadros. casas comerciales suministran placas ya
preparadas, éstas pueden hacerse en el
CÁLCULOS:
laboratorio con aparatos especiales que
Fórmula para calcular el Rf permiten extender sobre la placa de vidrio
o plástico la “papilla” formada por la
𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑅𝑓 = suspensión del material en un disolvente
𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚𝑜𝑣𝑖𝑙 adecuado (generalmente agua). La placa
Calculo de Rf para la muestra el ha de dejarse secar antes de su
triptófano utilización. (Luisot , 1982).

7.0 Para el desarrollo de la cromatografía, las

𝑅𝑓 = = 0.7 muestras, en un disolvente adecuado, se
10 aplican puntualmente con la ayuda de
𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 jeringas, micropipetas o capilares en un
% 𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑥100
𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜 extremo de la placa. El volumen de
muestra a aplicar es crítico, ya que va a
afectar a la resolución (separación de los
0.55 − 0.7 componentes de una mezcla compleja), y
% 𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑥100 = 27.2% depende de la concentración del
0.55
compuesto o compuestos de interés en la
muestra. Es importante recalcar que, si no
se da la preparación adecuada, esto se
convierte en un factor que afecta la
separación y se obtienen porcentajes de
error elevados en comparación con sus
valores teóricos. (Smith, 1965).
Para soluciones concentradas bastará
una cantidad muy pequeña (rango de µl)
para aplicar suficiente cantidad de los
solutos a separar sin llegar a saturar la
capacidad de resolución de la placa
cromatográfica. Para soluciones muy
diluidas, deberá aplicarse un volumen
suficiente (de hasta varios ml) para
asegurar una cantidad detectable de
soluto o solutos de interés. En este caso
conviene hacer la aplicación en pequeños
volúmenes fraccionarios, no
procediéndose a una nueva adición hasta
haberse secado totalmente la precedente
(de lo contrario la superficie de aplicación
se haría muy grande, distando mucho de
la situación ideal de concentración de la
muestra en un solo punto de aplicación).
Este fue otro factor importante por el cual
se obtuvieron porcentajes de error
elevados. (Bermúdez, 2004)
Una vez aplicada y seca la muestra, la
placa se introduce en un recipiente
cerrado (tanque cromatográfico) y uno de
los extremos (el más próximo a la línea de
aplicación) se sumerge en un disolvente
apropiado (fase móvil), cuyo nivel en el
fondo del tanque debe quedar por debajo
de la línea de aplicación. El solvente se
desplaza a través del soporte por
capilaridad provocando un reparto de los
solutos entre él y la fase estacionaria de
acuerdo con sus solubilidades relativas
(coeficientes de reparto). Una vez que el
solvente haya alcanzado un punto
próximo al otro extremo de la placa, ésta
se saca del tanque y se seca. (Valcarcel,
1988).
Las manchas correspondientes a cada
compuesto, si 3 no son visibles, se
pueden revelar mediante técnicas
analíticas concretas. Se determina la
posición de cada mancha relativa al frente
alcanzado por el solvente, calculándose el
correspondiente valor de Rf. La detección
de los compuestos una vez realizada la
cromatografía se puede llevar a cabo en
base a sus propiedades
espectroscópicas, fluorimétricas,
haciéndolos reaccionar con reactivos
específicos, radioisotópicamente, etc.
(Pasto, 1981).
La identificación de tales compuestos se
suele realizar comparando sus Rf con los
de compuestos de referencia (patrones)
de naturaleza química conocida.
Alternativamente, los diferentes
compuestos, una vez localizada su
posición por un método no destructivo,
pueden eluirse de la placa raspando las
zonas correspondientes y extrayendo el
polvo obtenido con un solvente adecuado.
(Laitinen, 1982).
Uno de los factores más críticos en este
tipo de cromatografías es la elección de la
fase móvil, que, básicamente, suele estar
formada por una mezcla de un solvente
orgánico con agua y algunas sustancias
adicionales tales cómo ácidos, bases,
agentes acomplejantes, etc., cuya
finalidad es aumentar o disminuir la
solubilidad de algunos compuestos.
Además de en una sola dirección, la CCF
puede también realizarse
bidimensionalmente. (Bolaños, 2003).
En este caso sólo se aplica una única
muestra, que se dispone en uno de los
vértices de la placa y se eluye dos veces,
normalmente con solventes diferentes, y
en direcciones perpendiculares. La CCF
presenta una serie de ventajas respecto a
cromatografías alternativas, como es la
de papel, tales como las siguientes: i) Una
mayor resolución, obteniéndose por lo
general manchas más pequeñas. ii) Una
mayor velocidad de separación. iii)
Pueden utilizarse un gran número de
materiales como soportes y disolventes.
iv) Los compuestos pueden ser
detectados con facilidad y su
recuperación es muy simple. La mayor
resolución obtenida por CCF se debe a
que pueden formarse partículas muy finas
del soporte, por lo que la relación
superficie/volumen es muy elevada,
proporcionando una gran área superficial
por unidad de longitud. Esto se traduce en
que la cantidad de muestra que se puede
aplicar es mayor y la difusión es mucho
menor. La ventaja respecto a la
cromatografía en papel es que éste tiene
una estructura fibrosa y la capilaridad
asociada a las fibras tiende a aumentar la
difusión de las moléculas. (Christian,
2009).
Reacciones coloreadas de aminoácidos
Los métodos colorimétricos de
determinación de aminoácidos se basan
en la reacción específica de éstos con
determinados compuestos, dando
derivados coloreados. La formación de
color se toma como resultado positivo e
indica su presencia, mientras que el no
desarrollo de color es indicativo de que no
está presente. (Skoog et all, 2005).
De todos los métodos reseñados, el más
general y utilizado es el de la reacción con
la ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de
tricetohidrindeno) reacciona con
aminoácidos que tengan el grupo amino
libre, dando lugar a la formación de
amoniaco y anhídrido carbónico, con
reducción del reactivo (ninhidrina) a
hidrindantina. (Higson, 2007).
La hidrindantina reacciona a su vez con el
amoniaco y otra molécula de ninhidrina
para dar un compuesto de adición doble
que presenta una coloración azul-
púrpura, con la excepción de la prolina
que da una coloración amarillenta
(recordar que en la prolina el grupo amino
está sustituido). El derivado coloreado
presenta máximo de absorción en torno a
570 nm. La reacción se lleva a cabo en
caliente y a valores de pH comprendidos
entre 4 y 8. (Harvey, 2000).
Las aminas primarias (R-CH2-NH2) dan
también positiva la prueba de la
ninhidrina, aunque en este caso no se
libera CO2. La técnica es muy sensible,
por lo que es ideal para detectar
concentraciones bajas de aminoácidos,
utilizándose para revelar su presencia en
cromatogramas y fracciones procedentes
de otras técnicas de separación. La
presencia de aldehídos resultantes de la
degradación de la ninhidrina por reacción
con los aminoácidos modifica, bajo ciertas
condiciones, el color formado, lo que sirve
para identificar el tipo de aminoácido.
(Moore, 1978).
CONCLUSIONES:
 Concluimos que, mediante la
aplicación de la técnica de
cromatografía en capa fina, se
pudo identificar el recorrido de los
diferentes aminoácidos sobre
sílica gel.
 Identificamos que, mediante la
reacción de la ninhidrina con los
aminácidos, esta se reduce a
hidrindantina reacciona a su vez
con el amoniaco y otra molécula
de ninhidrina para dar un
compuesto de adición doble que
presenta una coloración azul-
púrpura.
 Comprobamos que, mediante los
cálculos de Rf para cada
aminoácido variando la fase móvil,
se obtuvo que estos valores
tuvieron un porcentaje de error de
100% en comparación con su
 valor teórico como fue el de  Christian, G. (2009). Química
triptófano en n-propanol/NH4OH. Analítica. (6ta edición). México:
 Determinamos que el volumen de McGraw-Hill.
muestra a aplicar es crítico, ya que  Skoog, D., West, D., Holler, J.,
se vio afectado a la resolución Crouch, S., (2005). Fundamentos
(separación de los componentes de Química Analítica,
de una mezcla compleja), y Internacional Thompson Editores,
México.
depende de la concentración del
 Higson, S. (2007). Química
compuesto o compuestos de
Analítica. 1ª ed.
interés en la muestra.
 Harvey, D. (2000). Química
BIBLIOGRAFÍA: Analítica Moderna. Ed. McGraw
Hill.
 Luisot P (1982). “Bioquímica  Moore W. (1978). Química Física.
Estructural”, 2ª Ed. Editorial AC. Segunda edición. España.
Excelente libro de bioquímica
estructural. En el capítulo de
aminoácidos se describen con
detalle sus propiedades físicas y
químicas.
 Smith I, Feinberg JG (1965)
“Paper & Thin Layer
Chromatography and
Electrophoresis”. Shandon
Scientific Company Ltd. (1996).
Desarrollo histórico de la técnica y
aplicaciones.
 Bermúdez A, Bernal J, Espinosa
E, Cornejo W, Briceño I, Prieto JC,
Arrieta L (2004). Propuesta para
un protocolo de diagnóstico de
homocistinuria.
http://med.javeriana.edu.co/publi/
vniversitas/serial/v44n3/0023%20
propuesta .pdf
 Valcarcel, M. (1988). Técnicas
analíticas de separación. Editorial
Reverté. España. pp 335-336,
597-613.
 Pasto, D & Johnson, R. (1981).
Determinación de estructuras
orgánicas. Reverté, Madrid
 Laitinen, H & Harris, W. (1982).
Análisis químico. (4ta ed.)
España. Editorial Reverté.
 Bolaños, V. (2003). Química
analítica cuantitativa, (2da ed.).
México.