Informe 4 de Microbiologia

FACULTAD FARMACIA Y BIOQUIMICA
ASIGNATURA : MICROBIOLOIA GENERAL
DOCENTE : RUTH ZELADA
TEMA : MÉTODOS DE COLORACION
PRÁCTICA : Nº 4
SECCIÓN : FB7M1
GRUPO :B
INTEGRANTES : ANDÍA SÁNCHEZ VERÓNICA
BAZÁN ALFARO SANDRA
CARRILLO POMA MAYRA
FELIPE CHAVEZ ROSS
LÁZARO CARTOLÍN JOHANA
FECHA DE PRÁCTICA :
FECHA DE ENTREGA :
INTRODUCCIÓN
Las bacterias poseen diferentes características en su morfología, definida por el

tamaño, la forma y la estructura. Existen bacterias en forma redondeada
denominadas cocos, en forma cilíndrica, bacilos y otra morfología como son las
que tienen forma de espirales, denominadas espirilos. A su vez cada categoría
puede sub clasificarse.
Estas características pueden determinarse examinando muestras al

microscopio, se pueden teñir las bacterias para facilitar su visualización. Si se
tiñe una muestra del cultivo extendida y fijada en una lámina portaobjeto con un
colorante dado, las células adquirirán el color del colorante añadido y podrá
observarse la forma, tamaño de las mismas.
Para poder observar mejor sus características de las bacterias, se debe

recurrirse a tinciones diferenciales que involucran el uso de varios reactivos y
éstas pueden diferenciarse con base al color que retienen, como los que
trabajaremos en esta práctica: coloración GRAM, coloración acido resistente,
coloración de esporas, coloración negativa.
MARCO TEÓRICO
MÉTODOS DE COLORACIÓN
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles

de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el
contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir
entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados
constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes
celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna

afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con
frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con
intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como
los ácidos nucleícos y los polisacáridos ácidos.
Preparación
Las etapas preparatorias involucradas en una tinción van a depender del tipo de
análisis planeado; bajo estas premisas se puede considerar que algunos o todos
de los siguientes pasos podrían requerirse.
 Fijación: de por sí, esta etapa puede consistir en varios pasos. La fijación es
una modificación de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas que
forman una célula o tejido y que tiene por finalidad preservar las formas de
las células o tejidos tanto como sea posible. A veces se puede utilizar una
fijación por calor para matar, adherir y alterar un espécimen de modo que
acepte la tinción.
 Permeabilización este paso implica el tratamiento de las células con

un surfactante suave. Este tipo de tratamiento tiene como finalidad disolver
la membrana celular para permitir que las grandes moléculas de colorante
puedan acceder a las estructuras del interior de las células.
 Montaje frecuentemente implica adherir los cortes histológicos a

un portaobjetos de vidrio para su observación al microscopio o análisis. En
algunos casos, se puede cultivar a las células directamente sobre le
portaobjetos.
Sin Tinción
No se utiliza ningún tipo de colorante. Es el montaje directo húmedo o examen

en fresco: las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un
portaobjetos para su observación. El material que es demasiado espeso para
permitir la diferenciación de sus elementos puede diluirse con igual volumen de
solución salina fisiológica estéril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre
la superficie del material.
Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos móviles de

parásitos intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros
parásitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc
Tinción Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen
con la misma tonalidad.
La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes

derivados de las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que
proceden del alquitrán.
Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la

molécula está cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de
metileno son colorantes básicos. Otros colorantes de esta categoría utilizados
con frecuencia en bacteriología son safranina, fuchina básica y verde malaquita.
Tinción de ácido-alcohol resistencia
Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de

Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder
distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de
alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol resistente) de otros que no resisten la
decoloración (no ácido-alcohol resistente).
Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes

patógenos: Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae,
microorganismos responsables de la tuberculosis y la lepra respectivamente.
La tinción de GRAM
Aporta dos ideas básicas para la definición "taxonómica" de las bacterias: el color
que adquieren tras la tinción y la forma que presentan las células bacterianas.
Microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta

y de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.
Tinción negativa
No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes

con cromóforos, ni se lleva a cabo ninguna reacción entre estructuras celulares
y los colorantes. En este caso el frotis se hace con una gota de una solución de
nigrosina o tinta china, ambos son productos particulados, insolubles, que
formarán una película opaca a la luz. En este tipo de tinción se prescinde de la
fijación por calor, se deja secar la preparación y se observan los
microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.
Tinción de esporas (WIRTZ-CONKLIN)
Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus,

producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se
producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento
de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.)
formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de
esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior.
Fundamento
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a
los factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las
esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de
difícil tinción.
La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado

con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el
segundo colorante.
OTRAS TINCIONES DE USO HABITUAL
Rodamina-Auramina
Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen

afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a
las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo
verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la
fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes,
incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes.
Naranja de acridina
El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma

nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el
color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración.
El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una
fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos
modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se
inactivará poco tiempo después de la tinción.
El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los

hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de
estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina
es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos
positivos.
COMPETENCIA
Comprender la utilización de cada tinción

Realizar las diferentes tinciones
Observar la morfología bacteriana
MATERIALES Y EQUIPOS
Lamina porta objeto

Lamina cubre objeto
Asa de kolle
Microscopio
Mechero
Piceta
CULTIVO BACTERIANO
Cultivo de escherichia coli
REACTIVOS:
Azul de metileno
Cristal violeta
Lugol
Alcohol- acetona
Alcohol acido
Safranina
Tinta china
Aceite de inmersión
PROCEDIMIENTOS
1. COLORACIÓN SIMPLE
o Prepara un frotis a partir del cultivo

proporcionado.
o Fija al calor.
o Cubre el frotis con el colorante Azul de
Metileno y deja actuar por 3 a 5 minutos.
o Lava con agua y deja secar.
o Observa al microscopio con objetivo de
inmersión.
La tinción simple se basa en que la porción

cromógena del colorante tiene carga positiva,
estos van a tener afinidad por la superficie con
carga negativa de la bacteria tiñéndola.
La tinción simple tiene como propósito
general destacar el microorganismo completo
para que se vean las formas y las estructuras
básicas.
2. COLORACIÓN GRAM
-
o Prepara frotices de cultivos de E. coli
o Deja secar al aire y fija con calor.
o Cubre los frotices con reactivo de cristal violeta
durante un minuto.
o Lava los portaobjetos con agua corriente
durante 5 segundos.
o Cubre el frotis con la solución de lugol y deja actuar durante
2 minutos.
o Lava con agua corriente, y aplica lentamente el alcohol –
acetona y seguirá agregando hasta que la tintura ya no
fluya del frotis.
o Lava inmediatamente con agua corriente.
o Cubrirá el frotis con la solución de safranina durante 30
segundos.
o Lava con agua corriente y deja secar la preparación.
o Observa al microscopio utilizando el lente de inmersión.
Fundamento:
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las

células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram
negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un
compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro
de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para
solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el
cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la
célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un
complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta..
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para

realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el
complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no
se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen
3. COLORACIÓN ACIDO - RESISTENTE
o Cubre el frotis proporcionado con fucsina fenicada al 5% (carbolfucsina) y dejarlo

reposar de 30 a 60 segundos antes de
calentarlo
o Calienta la preparación con suavidad,
haciendo pasar el mechero de alcohol por
debajo del portaobjeto. Seguir calentando
hasta que se observe el desprendimiento
de vapores. Evitar que el colorante hierva.
Repetir 2 veces más.
o Enfría y lava con agua corriente.
o Decolora con alcohol – ácido hasta que no arrastre colorante.
o Lava con agua corriente.
o Cubrirá el frotis con azul de metileno, durante
1 minuto.
o Lava con agua corriente.
o Deja secar al aire.
o Observa al microscopio con lente de inmersión.
Las bacterias ácido – alcohol resistentes se
tiñen de rojo y los demás microorganismos de
color azul.
Fundamento
Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de
que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de
la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. La
coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante
atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar
con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante
ya no puede salir de las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color
rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de
contraste
4. COLORACIÓN ESPORAS
o Haga un frotis fino y fije a la llama.
o Cubre con azul de metileno y calienta hasta hervir en
forma intermitente por 1 minuto.
o Lava con agua destilada.
o Cubre con una mezcla de solución saturada alcohólica
de Eosina por 30 segundos.
o Lava con agua destilada y deja secar al aire.
o Examina al microscopio con lente de inmersión.
Fundamento
La envuelta de la endospora es más compleja e impermeable que

la envuelta de las células vegetativas en las que se forma. Sólo se
puede teñir el contenido de la espora alterando su envuelta. La
impermeabilidad de las cubiertas dificulta que las endosporas se
decoloren una vez teñidas.
El verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene

una carga positiva débil) y por tanto, se une débilmente a la
bacteria. Penetra en las células vegetativas. Cuando se calienta la
preparación también penetra las endosporas.
Durante el lavado con agua, el verde de malaquita se elimina

de las células vegetativas, pero no de la endospora.
El colorante de contraste (la safranina) solo puede teñir a las

células
5. vegetativas
COLORACIÓN (decoloradas por el agua).
NEGATIVA
o Coloca varias asadas de cultivo en un portaobjetos limpio,
cerca de uno de los bordes.
o Coloca un volumen igual de tinta china cerca del cultivo.
o Mezcla bien con el asa y luego extiende la mezcla a lo largo
del portaobjetos, utilizando la técnica del frotis sanguíneo.
o Deja secar el frotis.
o Cubre con safranina durante 10 segundos, luego enjuaga con
cuidado y deja secar al aire.
o Observa al microscopio con lente de inmersión. Al examinar
la preparación, la cápsula aparecerá como una zona
transparente que rodea a la pared celular.
Fundamento
Tinción negativa es una técnica de microscopía

que permite contrastar las muestras mediante
una sustancia opaca a los fotones (microscopía
óptica). se emplea nigrosina o tinta china; para
el caso de bacterias que esporulan, esta
técnica permite visualizar las esporas como
entes refringentes sobre un campo de fondo
oscuro.
KLEBSIELLA SP: Es un género de bacterias inmóviles, Gram negativas,
anaerobias facultativas y una prominente capsula de polisacáridos, es un
frecuente patógeno humano, los organismos bacteriales del género
klebsiella pueden encabezar un amplio rango de estadios infecciosos, sobre
todo neumonía.
ESCHERICHIA COLI:Es un bacilo que reacciona

negativamente a la tinción Gram (Gram negativo), anaerobio
facultativo, móvil por los flagelos peritricos, no forma
esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa.
STAPHYLOCOCCUS
AUREUS: Es una bacteria anaerobia facultativa, Gram positiva,
productora de coagulasa catalasa, inmóvil y no esporulada, además
posee capsula, una capa de polisacárido externo, el cual le transfiere una
capacidad de adherencia, evita también que sea reconocido, en el
metabolismo fermentan lentamente los carbohidratos (manitol), pero no
genera gas, posee una actividad catalítica que producen pigmentos que
varían desde un color blanco hasta un amarillo intenso.
PSEUDOMONA SP: Es un género de bacilo rectos y ligeramente

curvados, Gram negativos, oxidasa positivos, con ausencia de formación
de gas, aeróbicos estrictos, aunque en algunos casos puede utilizar el nitrato
como aceptor de electrones, es común la presencia de plásmidos y no
forman esporas, son móviles gracias a uno o más flagelos polares que
posee, catalasa positivos, algunas sintetizan capsulas de exopolisacáridos,
son hemolíticas, prueba de indol negativas y rojo de metilo negativas.
ESTREPTOCOCOS: Grupo de bacterias formado por cocos Gram positivos,

son bacterias acido lácticas y oxidasa y catalasa negativos, la mayoría de estas
bacterias son anaerobias facultativas, no esporulada y poseen capsula.
MESA 1:
COLORACION SIMPLE STAFILOCOCCUS AERIUS 100X
FUNDAMENTO:
Las células esféricas se denominan cocos

y suelen ser redondeadas aunque pueden
ser ovoides o elípticas.
Coloración simple: coco
Foto de :gianina gonzales

COLORACION GRAM STAFILOCOCCUS AERIUS 100X
FUNDAMENTO:
 GRAN:+
 MORFOLOGIA: RACIMOS
IRREGULARES
 ANTIBIOTICO + EFICAZ:
AMOXICILINA
 CRECE EN AGAR MANITOL-SAL
Coloración gran: positiva

COLORACIÓN ACIDO-RESISTENTE STAFILOCOCCUS AERIUS 100X
FUNDAMENTO:
En este método de tinción, el colorante

primario, fucsina ácida, se formula con
fenol para permitir el paso a través de las
paredes celulares de las micobacterias. El
portaobjeto se calienta para facilitar la
penetración y se utiliza alcohol etílico Coloración acido resistente:negativo
como decolorante. Sin embargo, el
reactivo se prepara con ácido clorhídrico Foto de :gianina gonzales
para ayudar a la decoloración de las
células que no son ácido – resistentes.
COLORACION DE ESPORAS STAFILOCOCCUS AERIUS 100X

FUNDAMENTO:
El colorante penetro la pared de la

espora, la cual es relativamente
impermeable.
Coloración de esporas: negativo
COLORACION NEGATIVA STAFILOCOCCUS AERIUS 100X
FUNDAMENTO:
En este tipo de tinción se prescinde de la

fijación por calor, se deja secar la
preparación y se observan los
microorganismos brillantes sobre un
fondo oscuro.
Coloración negativa: positivo

MESA 2:
COLORACION SIMPLE ESCHERICHA COLI 100X
FUNDAMENTO:
Permite observar la forma, tamaño y
agrupamiento de las bacterias usando un
único colorante (normalmente básico).
Se denominan colorantes básicos si el
cromóforo (porción coloreada) de la
molécula está cargada positivamente, por
ejemplo, cristal violeta y azul de metileno
Coloración simple: bacilo
son colorantes básicos.
Foto de : mayra carrillo
COLORACION GRAN ESCHERICHA COLI 100X

 La tinción de Gram divide a las
bacterias con pared del Dominio
Bacteria en dos grandes grupos:
bacterias con pared de tipo gram
positiva y bacterias con pared de
tipo gram negativa.
 que agrupa a las bacterias en dos
grandes bloques, bacterias
grampositivas y bacterias
gramnegativas
Coloración gran: negativa

COLORACION ACIDO ESCHERICHA COLI 100X
RESISTENTE
FUNDAMENTO:
Permite poder distinguir aquellos
microorganismos cuya coloración resiste
la acción de alcoholes y ácidos suaves
(ácido-alcohol resistentes) de otros que
no resisten la decoloración (no ácido-
alcohol resistentes).
la tinción de micobacterias. Coloración de acido resistente:
negativo
COLORACION DE ESPORAS ESCHERICHA COLI 100X
FUNDAMENTO:
Las endosporas aseguran la
supervivencia de estas bacterias en
condiciones desfavorables (altas
temperaturas, desecación, radiaciones
ultravioletas, gamma y agentes
químicos), durante largos periodos de
tiempo. La morfología y disposición de la
endospora en el interior del
microorganismos tiene valor taxonómico
la mayoría presentan una disposición Coloración de esporas: negativo
central o subterminal.
COLORACION NEGATIVA ESCHERICHA COLI 100X
FUNDAMENTO:
 MORFOLOGIA CELULAR:
BACILO PEQUEÑO NO
ESPORULADO
 AGRUPACIONES:CADENAS
 MOVILIDAD: MOVIMIENTO
ONDULANTE
 ANTIBIOTICO +
EFICAZ:AMOXICILINA
Coloración negativa: positivo
 CRECE EN AGAR ENTERICO
EKTOEN FERMENTA LACTOSA Foto de : mayra carrillo
MESA 3:
COLORACION SIMPLE PSEUDOMONAS AERUGINOSA 100X
FUNDAMENTO:
Bacilos gram(-), con pseudocápsula

llamada limo.
Flagelo polar, con fimbrias que actúan

como adhesinas o pillis sexuales.Poseen
pigmentos: piocianina(azul) y pioverdina
o fluoresceína(amarillo-verdoso). Algunas
cepas hacen pigmentos
hidrosolubles(piorrubina, piomelanina).
Coloración simple: bacilo
Foto de : erika menacho

COLORACION GRAM PSEUDOMONAS AERUGINOSA
FUNDAMENTO:
El cristal violeta (colorante catiónico)

penetra en todas las células bacterianas
(tanto Gram positivas como Gram
negativas) a través de la pared
bacteriana. El lugol es un compuesto
formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI
(yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los
cuales están presente para solubilizar el Coloración gram: negativo
yodo, y actúan de mordiente, haciendo
que el cristal violeta se fije con mayor Foto de : erika menacho
intensidad a la pared de la célula
bacteriana. El I2 entra en las células y
forma un complejo insoluble en solución
acuosa con el cristal violeta. La mezcla de
alcohol-acetona que se agrega, sirve para
realizar la decoloración, ya que en la
misma es soluble el complejo I2/cristal
violeta.
COLORACION DE ESPORAS PSEUDOMONAS AERUGINOSA
FUNDAMENTO:
Se coloreó fácilmente la pared de la espora.
Coloración de espora: negativo

COLORACION NEGATIVA PSEUDOMONAS AERUGINOSA
FUNDAMENTO:
Es una técnica de microscopía que

permite contrastar las muestras mediante
una sustancia opaca a los fotones
(microscopía óptica) o a los electrones
(microscopía electrónica).
Coloración negativa: positiva
MESA 4:
COLORACION SIMPLE Streptococcus 100 x
FUNDAMENTO:
Se utiliza un solo tinte, la coloración se da por

afinidad de carga con los compuestos de la
superficie de la célula.
Coloracion simple: coco
Foto de :arenia chavez

COLORACION GRAM Streptococcus 100 x
FUNDAMENTO:
La coloración Gram, se desarrolla por una serie de

coloraciones, los cuales se fundamentaran de la
siguiente manera.
Primero (coloración): colorante básico que en

contacto con las células cargadas negativamente
reaccionan con ellas coloreándolas. (Cristal
violeta)
Segundo (mordiente): fija la tinción y aumenta la

afinidad entre el colorante y la célula.
Tercero (decolorante): se adiciona un disolvente

orgánico (alcohol-acetona)
Cuarto (contraste): colorante básico distinto al

primero (safranina), los dos grupos bacterianos
difieren en el color. Coloracion gram: positivo
COLORACION ACIDO-RESISTENTE Streptococcus 100 x
FUNDAMENTO:
Los microorganismos acido resistentes se

caracterizan por tener una pared celular gruesa de
cera (lipoidal) que contiene acido micólico.
TINTE PRIMERO: carbolfucsina-tinte

rojo fenolico (5%), puede penetrar la pared
celular de las micobacterias.
AGENTE DECOLORIZANTE: Alcohol-
acido (5% HCl + 95% alcohol etílico)
CONTRATINTE: Azul de metileno, se
utiliza para teñir de azul las bacterias que
quedaron incoloras.
Los organismos que son decolorados por el
alcohol acido no son acido resistentes. Azules, no
son acido resistentes (no tienen el acido micólico
en la pared)
Coloracion acido-resistente:
Negativo
COLORACION DE ESPORAS Streptococcus 100 x
FUNDAMENTO:
La esporogénesis y la germinación no son

medios de reproducción, son mecanismos de
supervivencia de la célula.
La composición lo hace resistente al calor
extremo o excesivo, congelación, radiación,
desecación y agentes químicos. Coloracion de esporas: Negativo
Tinte primario: requiere calor para la
penetración de este tinte. Foto de :arenia chavez
Agente decolorante: Agua remueve el
exceso de tinte, decolora la célula negativa.
Contratinte: safranina, tiñe la célula
vegetativas.
COLORACION NEGATIVA Streptococcus 100 x
FUNDAMENTO:
La capsula es una estructura gelatinosa

secretada por algunas bacterias.
Capa de polisacárido o proteína que

reviste el exterior de una bacteria, tiene por Coloración negativa: Positivo
función la adherencia y formación de Foto de :arenia chavez
biopeliculas, capa de crecimiento bacteriano
y protección contra fagocitosis de
macrófagos, sistema inmunológico
MESA 5:
COLORACION SIMPLE KLEBSIELLA 100X
FUNDAMENTO:
Se observo la morgologia del

microorganismo.Es
un género de bacterias inmóviles, Gram-
negativas, anaerobias facultativas y con
una
prominente cápsula de polisacáridos.
Coloracion simple: bacilo
Foto de :henry chavez
COLORACION GRAM KLEBSIELLA 100X

FUNDAMENTO:
Las bacterias Gram+ poseen grupos

sulfhidrilos susceptibles de formar
enlaces estables con el violeta de
genciana y el violeta de metilo previo
tratamiento con lugol . El compuesto
resultante se resiste a salir a través de la
Coloracion gram: negativa
pared celular de las bacterias gram +, no
pasa lo mismo con las bacterias gram - , Foto de :henry chavez
de pared celular más fina y diferente
estructura.
COLORACION ACIDO RESISTENTE KLEBSIELLA 100X
Todo el género de las micobacterias

presentan gran dificultad mediante la
técnica de Gram porque poseen una
gruesa cápsula protectora , de
composición lipídica fundamentalmente ,
que impide la penetración del colorante
Coloracion acido resistente: negativo
COLARACION DE ESPORAS KLEBSIELLA
FUNDAMENTO:
Para la observación de esporas, es

necesario que el colorante penetre la
pared de la espora, la cual es
relativamente impermeable, razón por la
que se necesita el calentamiento.
ciertos tipos de bacterias producen

esporas de resistencia cuya pared
celular es característica. La tinción de
esporas permite detectar este tipo de
células lo que tiene utilidad en la
identificación del microorganismo en Coloracion de esporas: negativo
estudio. Foto de :henry chavez
COLORACION NEGATIVA KLEBSIELLA 100X
FUNDAMENTO:
Bacilos gram - anaerobios facultativos.
Móviles(muchos), no esporulados,.
Patógenos oportunistas(pocos
estrictos).
Crecen en todos los medios(agar

sangre, chocolate.)
Coloracion negativa: positivo

DISCUSION
1. En esta práctica se realizó, la mayoría de métodos que se utilizan para

la caracterización de la morfología y estructura de las bacterias, por
eso es necesario seguir los pasos detallados de la guía de práctica, ya
que algunas son lábiles al calor, al agua, y otros factores que
participen, en el proceso de coloración.
2. La tinción simple, se utilizo un solo colorante, la cual tiene como

función caracterizar el tamaño, arreglo y forma, por otro lado está la
tinción diferencial, que tiene como función separar y clasificar los
microorganismos observados de acuerdo a sus características, lo cual
es para identificar estructuras como son las capsulas, flagelos y
ensoparas.
3. Los resultados, de la tinción acido resistente, solo se da para algunas

bacterias como son las especies de Las familias mycobateriae y
nocardiceae, los cuales son acido resistentes, esto debido a que
estructuralmente en su capa externa presentan una macromolécula
que los diferencia de las bacterias que estudiamos, en este caso estas
especies presentan una pared celular gruesa de cera (lipoidal) que
contiene ácido micólico, que es inerte a la tinción acido resistente.
4. La tinción de las endosporas, en la cual las bacterias que trabajamos,

ninguna de ellas presenta endosporas, ya que esta clase de estructura
es característica de algunos géneros como son los Bacillus,
Clostridium, Esporolactobacillus, thermoantinomyces.
5. Finalizando con la práctica, las demás tinciones que se realizó, fueron

diferenciales, ya que cada microorganismo tiene característica propia
en su estructura y morfología.
CONCLUSIÓN
Los métodos de coloración nos permiten distinguir la presencia de determinados

constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes
celulares, etc.
La mayoría de los colorantes empleados en la práctica son compuestos

orgánicos que tienen cierta afinidad por determinados microorganismos. Muchos
colorantes son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con
intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, así
tenemos los colorantes azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros
colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con
los constituyentes celulares cargados positivamente, estos colorantes incluyen
la eosina, la fucsina ácida.
Durante el desarrollo de la práctica se realizaron: coloraciones simples las

cuales permiten identificar la forma y estructura de la escherichia coli, estos
tenían forma de bastoncitos muy pequeños; en la tinción Gram el cristal violeta
penetra en las células bacterianas tanto Gram (+) como Gram (-) por ello se
evidencio que las Gram (+) se teñían de color morado mientras que las Gram (-
) estaban teñidas de color rosado; la tinción acido resistente permite penetrar
la pared bacteriana por ello se muestra una coloración rosada y; en la tinción
de esporas esta es más compleja debido a la impermeabilidad de las cubiertas
y ello dificulta que las endosporas se decoloren cuando están teñidas para ello
se debió usar el verde de malaquita que permite penetrar en las endosporas sin
embargo se empleo solución alcohólica saturada de eosina que vista al
microscopio no se observaron las endosporas es probable que el reactivo
empleado no permitió su identificación; en la tinción negativa por poseer
partículas grandes permiten identificar microorganismos sin teñir en presencia
de un fondo oscuro por lo que se logra observar agrupaciones en cadena
TÉCNICAS DE SIEMBRA
ESCHERICHIA COLI
Tipo de Gram: Gran positiva
Metabolismo: Hetrotrofo: porque obtienen el CO2 a partir de la

fermentación de la glucosa
Organotrofo: porque obtienen sus equivalentes reductores
a partir de compuestos orgánicos
Quimiotrofos: porque obtienen su energía a partir de
compuestos químicos externos
Móviles o inmóviles: Inmóviles

Tipo de medio de cultivo ¿por qué?:
Liquido: caldo TSB (tubos), se emplea porque es un medio de
enriquecimiento y cultivo de microorganismos aerobios
Solido: agar TSA (placas petri) es empleado por ser amplio y nutritivo
para varios tipos de microorganismos
Semisólido: agar SIM (Tubo) y agar TSA (pico de flauta-tubo). El agar
SIM es importante porque permite verificar la movilidad de las cepas
Método de siembra: Liquido: inoculación

Solido: por agotamiento
Semisólido: por agotamiento (pico de flauta-tubo)
y por punción (en tubo)
Observación: Liquido: se observa turbio, opalescente en el fondo del

tubo lo que indica el crecimiento bacteriano
Solido: desarrollo de pocas colonias
Semisólido: desarrollo de gran cantidad de colonias (tubo-
pico de flauta) y en tubo hay presencia de colonias pero
suspendidas en la parte superior del tubo lo que indica que
son aérobicas
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Tipo de Gram: Gran negativo

Móviles o inmóviles: moviles


Observación: Liquido: se observa color verdoso oscuro, lo que indica el
crecimiento bacteriano
Solido: desarrollo de muchas colonias
pico de flauta) y en tubo hay presencia de colonias pero
suspendidas en la parte inferior del tubo lo que indica que
son anaérobicas
KLEBSIELLA PNEUMONIAE
Tipo de Gram: Gram negativas

Móviles o inmóviles: inmoviles


Observación: Liquido: se observa turbio, opalescente en el fondo del
tubo lo que indica el crecimiento bacteriano
Solido: no hubo desarrollo de colonias por agotamiento
pico de flauta) no presento agotamiento
ESCHERICHIA COLI
Coloración simple: Es positivo ya que se identifica la forma y

estructura de la E.coli
Coloración Gram: Es positivo, pues penetra en las células bacterianas.
Gram (+) color morado resiste la decoloración mientras que las Gram(-)
tiñen color rosado
Coloración acido resistente: Es positivo penetra la pared bacteriana
por lo que se observa coloración rosada
Coloración de esporas: La tinción de esporas es impermeable a sus
cubiertas lo que dificulta que las endosporas se decoloren cuando están
teñidas para ello se debió usar el verde de malaquita que permite
penetrar en las endosporas sin embargo se empleo solución alcohólica
saturada de eoscina que vista al microscopio no se identificaron las
endosporas es probable que el reactivo empleado no permitió su
observación
Coloración negativa: Es positivo La tinción (-) por poseer partículas
grandes permiten identificar microorganismos sin teñir en presencia de
un fondo oscuro por lo que se logra observar la bacteria en forma
agrupadas como cadenas
Observación morfológica: cepa inmóvil, bacilo corto, flagelos
peritricos, no forma esporas
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Coloración simple: Es positivo, se observa la forma de cocos

Coloración Gram: Es positivo, forma de racimos
Coloración acido resistente: Es negativo
Coloración negativa: Es positivo
Observación morfológica: Es una bacteria anaerobia facultativa, Gram
positiva, productora de coagulasa catalasa, inmóvil y no esporulada,
además posee capsula, una capa de polisacárido externo, el cual le
transfiere una capacidad de adherencia, evita también que sea
reconocido, en el metabolismo fermentan lentamente los carbohidratos
(manitol), pero no genera gas, posee una actividad catalítica que
producen pigmentos que varían desde un color blanco hasta un amarillo
intenso.
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Coloración simple: Es positivo, se observa la forma de bacilos

Coloración Gram: Es negativo
Observación morfológica: bacilos rectos y ligeramente curvados, Gram
negativos, no forman esporas, son móviles gracias a uno o más flagelos
polares que posee.
KLEBSIELLA PNEUMONIAE
Coloración simple: Es positivo, se observa la forma de bacilos

Coloración Gram: negativo
Coloración acido resistente: negativo
Observación morfológica: bacterias inmóviles, Gram negativas,
anaerobias facultativas y una prominente capsula de polisacáridos.
Streptococcus
Coloración simple: Es positivo, se observa la forma de cocos
Coloración Gram: positivo
Coloración acido resistente: negativo
Observación morfológica: bacterias formado por cocos Gram positivos,
la mayoría de estas bacterias son anaerobias facultativas, no esporulada
y poseen capsula
CUESTIONARIO
1. ¿Qué importancia tiene la pared celular bacteriana en la coloración

Gram?
La pared externa de la envoltura celular de una bacteria Gram positiva tiene

como base química fundamental el peptidoglicano, que es un polímero de N-
acetil-2-D-glucosamina, unido en orientación ß-1,4 con N-acetil murámico, a éste
se agregan por el grupo lactilo cuatro o más aminoácidos. Esta molécula
se polimeriza gran cantidad de veces, de modo que se forma una malla especial,
llamada sáculo de mureína. Dicho compuesto es de vital importancia para
conservar la forma y darle rigidez a la célula bacteriana (si este compuesto no
existiese, la célula reventaría debido a su gran potencial osmótico).
2. ¿Cuáles son los fundamentos de los diversos colorantes

empleados?,
COLORACION GRAM
La diferenciación de Gram se basa en el color que adquieren las bacterias

cuando se tratan con el colorante cristal violeta seguido por una solución yodo
yodurada de potasio, para luego someterlas a una decoloración después de la
cual se usa una coloración de contraste, casi siempre safranina. Las bacterias
Gram positivas (coloración azul morada) son resistentes a la decoloración y
conservan el complejo cristal violeta-yodo, los microorganismos Gram negativos
toman una coloración de contraste (coloración rosa o roja).
COLORACION NEGATIVA
es una técnica de microscopía que permite contrastar las muestras mediante una
sustancia opaca a los fotones (microscopía óptica) o a los electrones
(microscopía electrónica). En el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china;
para el caso de bacterias que esporulan, esta técnica permite visualizar las
esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro. 1 En caso de
microscopía electrónica de transmisión, se emplean sustancias de alto número
atómico que, por tanto, resultan opacas a los electrones transmitidos.
Típicamente, estas sustancias son acetato de uranilo, citrato de plomo o
molibdato de amonio. Al electrónico, esta técnica permite visualizar virus,
flagelos, bacterias y otros entes de escaso tamaño.
COLORACION SIMPLE:
Aquella coloración en la que se utiliza solo un colorante, el cual va a permitir

visualizar la morfología de los microorganismos.Se utiliza un solo colorante, por
lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta
china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de

hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por
ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las
paredes celulares de los hongos.
COLORACION DE ESPORAS
Para la observación de esporas, es necesario que el colorante penetre la pared

de la espora, la cual es relativamente impermeable, razón por la que se necesita
el calentamiento.
Ciertos tipos de bacterias producen esporas de resistencia cuya pared celular es

característica. La tinción de esporas permite detectar este tipo de células lo que
tiene utilidad en la identificación del microorganismo en estudio.
3. ¿Cuáles son las diferencias químicas importantes que explican el
estado ácido- resistente?
COLORACION ACIDO-RESISTENTE (coloración de ZiehlNeelsen):
En este método de tinción, el colorante primario fucsina acida se formula con

fenol para permitir el paso a través de las paredes celulares de las mico
bacterias. El portaobjeto se calienta para facilitar la penetración y se utiliza
alcohol etílico como decolorante. Sin embargo, el reactivo se prepara con ácido
clorhídrico para ayudar a la decoloración de las células que no son acido
resistente.
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos

(ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les
confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de
la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol
resistente. Las mico bacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos
coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-
alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere
calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene
ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva
solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de
las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las
moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias.
4. Que son endotoxinas bacterianas?
Endotoxinas
Parte integral de la pared celular de bacterias gran (-).Liberadas al morir la
bacteria, y en parte durante el crecimiento. A veces no necesitan liberarse
para mostrar su actividad biológica.
Sólo se encuentran en bacterias gran (-)
Lipopolisacáridos complejos. La porción lípido A tal vez confiere la
toxicidad.
Relativamente estable; resiste el calor a temperaturas mayores de 60ºC
durante horas sin perder su toxicidad. Pueden resistir al autoclave.
Débilmente inmunógena; los anticuerpos son antitoxina y protectores. La
interrelación entre los títulos del anticuerpo y la protección de la
enfermedad es menos clara que con las exotoxinas.
No se convierte en toxoide.
Moderadamente tóxica; mortal para animales en cantidades de 10 a 100
microgramos. Dosis letal muy grande.
No se encuentran receptores específicos sobre las células.
En general produce fiebre en el hospedero por liberación de interleucina-1
y otros mediadores.
Síntesis dirigida por genes cromosómicos.
Varios efectos pero principalmente síntomas
FUENTES BIBLIOGRAFICAS
1. Madigan M, Martinko JM, Parker JB. Biologia de los microorganismos.

10ed. Prentice Hall Iberia. Madrid. 2000.
2. Aulton Michael E., Ciencia y diseño de formas farmacéuticas, 2° edición,
Ed. Elsevier España, 2004.
3. Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994).
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Lippincott
Williams & Wilkins. ISBN 0-683-00603-7.
4. Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of

Microorganisms (10th ed.). Lippincott Williams &Wilkins. ISBN 0-13-
066271-2.
5. Søgaard M, Nørgaard M, Schønheyder H (2007). "First notification of

positive blood cultures: high accuracy of the Gram stain report (Epub
ahead of publication)". J ClinMicrobiol 45: 1113.
6. http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/labt/garcia_d_p/capitul
o4.pdf
7. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
8. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
9. http://revistareduca.es/index.php/biologia/article/viewFile/819/834

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FACULTAD FARMACIA Y BIOQUIMICA

ASIGNATURA : MICROBIOLOIA GENERAL

DOCENTE : RUTH ZELADA

TEMA : MÉTODOS DE COLORACION

Las bacterias poseen diferentes características en su morfología, definida por el

Estas características pueden determinarse examinando muestras al

Para poder observar mejor sus características de las bacterias, se debe

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna

 Permeabilización este paso implica el tratamiento de las células con

 Montaje frecuentemente implica adherir los cortes histológicos a

No se utiliza ningún tipo de colorante. Es el montaje directo húmedo o examen

Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos móviles de

La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes

Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la

Tinción de ácido-alcohol resistencia

Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de

Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes

Microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta

No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes

Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus,

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado

OTRAS TINCIONES DE USO HABITUAL

Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen

El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma

El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los

Comprender la utilización de cada tinción

Lamina porta objeto

Cultivo de escherichia coli

o Prepara un frotis a partir del cultivo

La tinción simple se basa en que la porción

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para

o Cubre el frotis proporcionado con fucsina fenicada al 5% (carbolfucsina) y dejarlo

La envuelta de la endospora es más compleja e impermeable que

El verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene

Durante el lavado con agua, el verde de malaquita se elimina

El colorante de contraste (la safranina) solo puede teñir a las

Tinción negativa es una técnica de microscopía

ESCHERICHIA COLI:Es un bacilo que reacciona

PSEUDOMONA SP: Es un género de bacilo rectos y ligeramente

ESTREPTOCOCOS: Grupo de bacterias formado por cocos Gram positivos,

Las células esféricas se denominan cocos

Coloración simple: coco

Foto de :gianina gonzales

Coloración gran: positiva

Foto de :gianina gonzales

En este método de tinción, el colorante

COLORACION DE ESPORAS STAFILOCOCCUS AERIUS 100X

El colorante penetro la pared de la

Coloración de esporas: negativo

Foto de :gianina gonzales

COLORACION NEGATIVA STAFILOCOCCUS AERIUS 100X

En este tipo de tinción se prescinde de la

Coloración negativa: positivo

Foto de :gianina gonzales

COLORACION GRAN ESCHERICHA COLI 100X

Coloración gran: negativa

Foto de : mayra carrillo

Foto de : mayra carrillo

COLORACION DE ESPORAS ESCHERICHA COLI 100X

Bacilos gram(-), con pseudocápsula