sao CAPITULO 29 Tecnologia do DNA Recombinante Este capitulo fal descreve uma tecnologia que ¢ agora funda mental para 0 avango das madernas ciencias biologicas, deti- nindo as fronteiras bioquimieas presentes e faruras ustrando snuitosprincpios importantes da biogmica. A ucidaao das Ieisque governam a catliseenzimdtia, a estrututa macromole- «ular, ¢ metabelismo celular eas vias da informagio permitern 420 pesquisador esta drigindo para os mais complexos proces- sshioguimicos. A diviste celular, imuricade,a embriogénese, 4 vitdo, 0 gosto, a oncogtnese, a cognicio, todos si0 orquestra dos numa elaborada sinfonia de interagdes moleculates e ma cromoleculares, a quais etae sendo entendida com aumenta- dlaclarera. As reais implica da jomada biogulniea,comesa- das po século XIX, aumentaram com incensa fog para entender e alert os sistemas vives. asa entender um process biolégico complex, um biog rico iolaeestuda os componcnts individuais in vitro, a sepui junta as partes para obter um quadeo eosrente do proceso total “Tale a fonte mais fértl de idias molecular estja no prdprio umazenamento da informagio celult, no seu DNA. O meto ta rmanho dos cromassomas, entretant um enorme dese. Como encontrar eestudar um gene partici Jae envte outros 100.000 genes espathads eatcehiloes de pares de bases do genoa hua? As solugoes comecaram a aparecer durante os anos 1970 Decades de avanges¢ milharesde cientitastraballando em genética, bioguiimica, biologia cellar e Gsivo-quimiea chegs- ram juntos os laboratérios de Paul Berg, lerbert Boyer e Stan~ ley Cohen, produzinco tgenias para localiza, ola, preporar © estudar pequenes segmentos de DNA, derivados de cromosso mos muito maiores. Técnicas para clonager do DNA abriram ‘oporcunidades nao imaginaves para identiticar estudar os ge- nes enolices em quase todas as pracessos bil6gicos coneci- dios Bses rows meters esto transformmanda a pesquisa bis ‘2,0 azricultura.a medicina, a ecologia, » medicina legal e mui {0s outtos campos, enquanto, a0 mesmo tempo, apreseatann 9 socieade eacolhas desconcettantes ¢sétos dilemes &ticos, ‘As primeiras das partes deste capitulo esbogam esses prin cipios bioquimicos fundameatas que suportam essa revolacio naria tecnologia, recorrendo ao nosso entendimiento do mate Til cisctido nos cinco capitulos anteriores. A seezao genetica €0 rastreamento (“screening”) se120,entao, considerados no fi nal da seca deste capitulo que asta a watiagao das aplieacoes 0 potencial dessa tecnologia apresenta-se a nos como Clonagem do DNA: 0 Basico Clonarsignitica fazer c6piasidénticas, ssc termo,otiginalmente aplicado ao procedimento de isolar uma célula, permite enti, va reproducio, criando a populagdo de células idénticas para estado. A clonagem do DNA envolve a separagio de um gene aul Be19 Heroert gover Suantey M Cohen cexpecifico ou segmento de DNA do seu cromossome maion a sua ligogdo a ume molécula de DNA transportedora pequena ¢ depois a replicagao desse DNA modificado, milhares ou mesmo rilhoes de vezes, por meio de um aumento no numero de celulas cea crc de miltiplascopias em cada célula de DNA clonado, 0 resultado € uma ampiiicagzo seetiva de um gene ou segmento de DNA particular & clonagem de DNA a parir de qualquer orga ismo baseia-se em cinco procedimentos gerais: 1. Cortar 0 DNA em localizapses precisa, Endomucleases de se ‘quencias especificas (endonucleases de restrigao) fornecem as tesouras moleculares necessias, 2, Unir dois fragmentos de DNA covalentemiente, A DNA ligase faz iss. 3. A sclegao de uma pequene molécula de DNA eapar de auto- replicagic. Segmentos de DNA a serem clonades podem se unira DNAs plasmidiais ou virais (vetores de clonagem um vetor € um agente de entroga). Essas moléculas de DNA com ppostas, contend segmentos covalentemente ligados, deriva dos de dus ou mais famtes, sao chamadas de DNAS recombi- nantes, 4. Transferir o DNA recombinante do tubo de ensaio para uma célula hospedeira, que pode fornecer a maquinavia enzinati «a para a replicagao do DNA, Selecionar ou identificar aquclas células hospedeiras que con tenham © DNA recombinianteOs métodos usacos para realizar esses tarefas ¢ outa relaciona: las sto coletizamente referides como tecnologia do DNA recom binante, ou, mais informalmente, como engenharia genética Nesta discussao inicial, concentraremo-nos na clonagem de DNA na bactéria £. coli, que foi o primeira erganismo usado para o trabalho co DNA recorbinante e ainda ¢ a céhula hospe- eira mais comum. A & coli possui muitas vantagens: 0 Seu -ietabolismo de DNA (e muitos outros processos bioguimicos) hem entendidos muitos vetores de clonagem que evortemt na- turalmente, como os bacteri6fagos ¢ 0s plasmids associacos com a cof sio bem caracterizados; € téenicas efetivas esto disponiveis para transferir o DNA de uma célula bacteriana para ‘outea. A clonagem do DNA em outros organismos ser tratada mais adiante neste capitulo, ‘As endonucleases de restricao e a DNA ligase produzem o DNA recombinante Pacticularmente importante para a tecnologia do DNA reeom- binante & um conjunto de enzimas tornedo disponivel gracas a décadas de pesquisa no metabolismo dos acidos nuckéicos (Te~ bela 29-1), Duas classes de enzimas encontram-se ne centro cia abordogem geral paca gerar e propagar uma molécula de DNA recombinante (Fig, 29-1) Primeica, as endonucleases de restr «40 do tipo If clivarn 0 DNA em sequencias especifcas para ge- rar um conjanto de Fragmentos menores. Segunda, o feagmenta de DNA a ser clonalo pode ser isolado & clonagem apropriada, usando a DNA ligase para selar as molé- cules de DNA. vetor recombinanteg,entao,inteoducido numa <élula hospedeira que o amplitica, 8 medida que a élula realiza -mitas geragdes de divises eclulars. Endonucleases de restrigao sto encontradas num largo es pectro de espécies bacterianas, Werner Arber descobriu que sua fungao biol6gica é reconhecer e clivar DNA estranho (por cexemplo, 0 DNA de um virus infectance)s tl DNA, ciz-s, deve ser rerio. No DNA da céluls hospedira, a sequéncia reconhe- cida pela endonuclease ce resrigao protegida da clivagem pela metilagao do DNA, catalsda por uma DNA metilase expecif- ca. N endonuclease de restrigao e a sua metilase correspondente ‘numa bactéviasio algunas Yezesreferides como um sistema de restrigito-modificagio, ‘Ho tres tipos de endonucleases de restrigio, designados[, Ih €11-0s tips Il sao geralmente complexes grandes de subu: nidades mltipla, contendo tanto as atividades de endonuclea- se como as de metilase. A endonuclease de restrigao do tipo 1 clivao DNA em locaisaleatrios que podem estar | 000 pares de bases ou mais distantes da seqténcia de reconhecimento. Enzi= mas tipo IIT clivam 0 DNA cerca de 25 pares de bases distanies da seqigneia de reconhecimento, Ambos os tipos de enzimas movem-se ao longo do DNA numa resgio que requer a energie nico a um vetor de a1 Vevor de slanagem |plasniciod oa ane Sey ‘elena de See ‘beget e ra TER i fue e YVetor rcombinante ranma | case ‘ite /) Sa Figura 29-1 ~ lustracdo esquemética da clonagem do DNA. Uri fragmento de ONA de imeeresse do pesquadar ¢ atid pela dusgem 6e um cromossems oucaistea com uma endonuclease oe rests Depots de soar e igar fragmento num vetor de conagem Que tar bem enna sdo civad com a endanudease da renga, © DNA room binante restante ¢infrodveido numa ctlla hoipedera onde ee possa ser prcpiaedo (clonic) Note que tamnanho.a romossema da E caf rejatwamente a um vor de Conagem pc, cernoum pli, ert menor que @ deserhede aati ‘Tabela 29-1 Algumas das enzimas usadas na tecnologia do DNA recombinante Enaima(e) Fungso Erderclestes de retigie Go ipo 1 clvar@ DNA em Saquendar Ge baie biped NA ligase Ln duas molecdas oy ragmentos ds ONE DNA polrerase (Eco) Tamerptase revorss Palnuceotdea quince Terminal transfers Exonuxiease i Exonuxiease do bacteisfago folate acaina Preencherwazos nos dupex pels adi sucesiva de nucloteos nas exetidades 3° Siniebzar ura cpa de DNA ce uma moigeula de RNA, ‘Aciconat ur fostato a extremidade 57.04 do um poinuclecideo para marc 1 ou permit hgacSa “adiconar caus homepolimoreat 2 extremidads 3-0H ge um dex neat Rerroxao de restos de nuceotteos apart das exremidates 3° de uma fia de ONS Remaxio de nucleotkiees a partir das exveridades 5° de um deplex, para excorextemydaes 3 ‘oe ita sirglos Rerncxao de fosftos tera pat das exerci 8° o4'3 lau armas)do ATP. As enzimas de resteigzo do tipo II, primeiramente isola das por Hamilton Smith, s40 mais simples, ro requerem ATP e clivam 0 DNA dentro da propria seqténcia de recanhecimente, por Daniel Nathans, que primeiro as usou para desenvolver novos :étodos para mapeamento ¢ analise de genes e ges Milhares de endonucleases de restrigao foram descobertas em diferentes especies bacterianas, Mais de 104 sequénciss espe. cificas diferentes sio reconhecidas por uma ou mais dessas enzi mas. As seqiéncias de reconhecimento sao usualmente de qua tro seis pares de bases em comprimento e palindrdmicas (veja, Fig. 10-20), Umas poucas seqiiéncies de reconhacimento, por algurnas endonucleases de restriggo do tipo 1, slo apresentadas na Tabela 29-2. Em alguns casos. a interagao entre uma endomi cease de restripdo ¢ sua seqiiénciz-alvo foi elucidada com um. detalhamento molecular refinado. O complexo, eompreenden- do a endonuclease de restrigto do tipo ll, EcolV,e sua sequen. cia-alo, ¢iustrada na Figura 29.2, ‘Algumas endonucleases de restrigzo realizam cortes contua dentes sabre as duas ftas do DNA, deixando dois a quatro nu cleocideos de uma fita na0-pareado em cada extremidade resul- tante, Pssas extremidades sd freqUentemente chamadas de ex tremidades coesivas (Fig, 29-3a) porque eas podem base-parear ‘com outra ou com extremidades coesivas de um outro fragmento ‘de DNA. Outras endonucleases de restrigdo clivam anes asf tas do DNA nas ligaOes fosfatodiéster opostas, néo deixando bbases despareadas em cade extremidade; estas sio freqlentemen te chamadas de extremidades cegas (Fig. 29-36}. ‘O tamanho médio dos fragmentos de DNA produsides pela clivagem do DNA gendmico com uma endonuclease de rest (fo depend da freqaéncia com que um sitio de resteigao parti ular ocorre numa longa molécula de DNAs ss9, por outro lado, depende intensamente do tamanho da seqiléncia de reconheci= ‘mento, Numa molécula de DNA com uma seqiéncia aleatéria, fem que todos 0s quatro nucleotideos estao igualmente abun- dantes, ums seqiéncia de 6 pares de bases reconhecida por uma, endonuclease de cestrigio como a Baral ocorreré em média uma veza cada 4° (4.096) pares de bases. Enzimas que reconhe: Acxtraordiniria utilidade dessas enzimas foi demonstra w) Figura 29.2 ~ a Intoracao da endonuclease de rstrigdo EcoRV com sua seqiéncia-alvo, ia) A eraima dmérca (corn sues dias subridade fem cnza e aaubtnlhante) & mosvada lgada a0s croditos da clvagem do DNA ra sequinoa reconhaca pala arcenuloare EcoRV, O esque ‘te do DNA 6 mosrado em cuastonaldades de a2u! pare cistingur o: segmentos separa pea lve. Cb Nesta vi apres 1 rero- ee © 0 DNA grado 180°, Os pontas de clvagem estBo contundertes sobre as duas fits do DNA, sendo asin, a eri prod eateries Cegas. A ligago de ens magneso, mestiada em lara, dosempenhs uma func na cats da reagbo de civagem ‘Tabela 28-2 ~ Seqiéncias de reconhecimento para algumas endonucleases de restngi0 do tipo i begs Hel GaaGetT a) Bert eccatécay TTCGAA ecTAGs + nas i 4 tw (1 ecesccece) om warcodray ceceagce TAGETA + at ty Pst wocrstacey ett ei caatrcor Gacare eTTAAS. + t + 4 pai @) cascrs@) son caTarcay GT CGac CTATAG + 1 be mmr G9 GACNNNGT COD Hoe racecar ETGNNNCAS cess ‘! ci 2 ‘assatas rca a pages festatodesiers cada pels endonuclees de rexrgaa, Os arenes rear bam ones quando conhecidas) Nees quale bare. Observe que o nome de cada era co se wetladas pes metas: coreapon ‘em ura goreviaio des tes de espe bacteria onde 3 enchne ol isoladsfeerel, Bap pata Baca ayfouefaces, Ec fa Fs kha cs. Ox romero tant nis nos tomes das ens (os eagle, fant surquem erconudeases de restbes erates Sadas das mens aipéoes baterarae, em vez do bpe de ena de estrecho