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Depleção da microbiota prejudica a termogênese de Tecido Adiposo Marrom e

escurecimento do Tecido Adiposo Branco

Na última década, foi demonstrado que os seres humanos adultos têm depósitos ativos de tecido adiposo
marrom (BAT) e que o tamanho e a atividade de tais depósitos é reduzido em pessoas com obesidade. Isto
reabasteceu a especulação de que a obesidade pode ser causada pela diminuição da atividade de BAT (Speakman,
2013), como foi originalmente especulado na década de 1970 (Rothwell and Stock, 1979). Uma comunidade
microbiana diversa reside no trato alimentar de todas as espécies de mamíferos, compreendendo principalmente
bactérias, mas também incluindo fungos, vírus, archaea e protozoários. Normalmente, microbiota intestinal
refere-se a bactérias anaeróbias, que são numericamente dominantes. O intestino do hospedeiro fornece um
habitat adequado para determinados grupos bacterianos e, por sua vez, a microbiota intestinal contribui com
nutrientes e energia para o hospedeiro.
Relatórios recentes indicaram que a composição da microbiota intestinal se altera durante o desafio do
frio, e a transferência de “microbiota fria” aumenta o escurecimento do tecido adiposo branco (WAT), o gasto de
energia e a tolerância ao frio. O mesmo grupo também relatou que tanto os camundongos tratados com
antibióticos quanto os camundongos livres de germes têm um fenótipo de escurecimento em seu WAT em
temperatura ambiente (22 C) e em termoneutralidade (30 C), sugerindo que a depleção da microbiota aumenta a
capacidade termogênica. Eles concluíram que a eliminação da microbiota aumentava a infiltração de eosinófilos
e aumentava a sinalização de citocinas tipo 2 e a polarização de macrófagos M2 no WAT, que impulsiona o
processo de escurecimento. A maioria dos estudos anteriores se concentrou no escurecimento do WAT, mas o
impacto da microbiota na BAT interescapular tem sido menos estudado.
Esta é uma omissão séria porque a BAT é a principal fonte de produção de calor termogênico adaptativo
(Cannon e Nedergaard, 2004). Isso levanta a questão óbvia de se a termogênese da BAT é responsiva à
composição da microbiota e qual o impacto da microbiota na BAT e na WAT sob diferentes desafios de
temperatura (Wang et al., 2016). Essa questão torna-se ainda mais importante porque trabalhos recentes
questionam se os macrófagos sintetizam catecolaminas e concluem que eles não afetam a termogênese adaptativa
(Fischer et al., 2017).
No entanto, este foi o mecanismo primário sugerido anteriormente para ligar a microbiota ao
escurecimento adaptativo. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi reavaliar os efeitos da microbiota
intestinal na termogênese adaptativa de camundongos e avaliar melhor o papel da sinalização da citocina tipo 2
na regulação da atividade dos adipócitos marrom e bege. Mostramos que a depleção da microbiota não promove
o escurecimento do WAT à temperatura ambiente; inversamente, a capacidade termogênica adaptativa de BAT e
WAT sob desafio frio é prejudicada quando a microbiota está depledada.
RESULTADOS
A depleção da microbiota intestinal prejudica a termorregulação
Para explorar o efeito da depleção da microbiota intestinal na termogênese em camundongos,
administramos um coquetel de antibiótico (ABX) na água de bebida por 3 a 4 semanas. Imediatamente após o
tratamento com antibiótico, o peso corporal caiu e, em seguida, uma semana depois, recuperou lentamente
(Figuras S1A e S1B). A depleção da microbiota alterou significativamente a morfologia do intestino delgado,
ceco e cólon (Figura S1C).
Esses componentes dos intestinos de camundongos ABX foram significativamente mais longos (2-way
ANOVA, F1,21 = 55,43, p <0,0001) e o ceco foi altamente aumentado (2-way ANOVA, F1,21 = 55,43, p <0,05)
(Figura S1D). A morfologia das pelotas fecais também foi significativamente alterada (Figura S1E). Para
determinar os impactos na função termogênica, conduzimos um experimento de resposta fria. Comparados aos
camundongos livres de patógenos (específicos) alojados em condições convencionais (controle), os camundongos
ABX tiveram a termorregulação comprometida quando expostos temperatura ambiente de 4 °C (Figura 1A).
Os ratos do controle foram capazes de manter a temperatura corporal a um nível significativamente mais
elevado do que os indivíduos tratados com ABX (2-way ANOVA, F12,72 = 8,863, p <0,0001). À temperatura
ambiente, os camundongos ABX também apresentaram temperaturas corpóreas significativamente mais baixas
(teste Mann-Whitney bicaudal, p = 0,027) (Figura 1B).
Isso foi consistente com a expressão do gene Ucp1, que foi significativamente menor tanto no BAT (2-
way ANOVA, F1,22 = 54,98, p <0,0001) quanto no subcutâneo WAT (scWAT) (2-way ANOVA, F1,22 = 8,938,
p = 0,0068) de camundongos ABX sob estimulação a frio por 48 h (Figuras 1C e 1D).
Em contraste com um estudo anterior (Sua rez-Zamorano et al., 2015), não observamos qualquer efeito
do tratamento com ABX na expressão do gene Ucp1 em ambos os BAT (2-way ANOVA, F1,37 = 13,18, p>
0,9999) e scWAT (2-way ANOVA, F1,42 = 8,817, p> 0,9999) a temperatura ambiente (22 C) e termoneutralidade
(30 C) (Figuras 1E e 1F). Os níveis de proteína de desacoplamento da proteína 1 (UCP1) também não foram
significativamente elevados no scWAT (2-way ANOVA, F1,18 = 0,8266, p = 0,603) de camundongos ABX em
comparação com camundongos controle a 22 C (Figuras 1G e 1J).
Além disso, os níveis de proteína da UCP1 foram significativamente menores em camundongos ABX
após estimulação fria tanto na BAT (2-way ANOVA, F1,20 = 8,212, p = 0,0037) quanto na scWAT (2-way
ANOVA, F1,18 = 0,8266, p = 0,0079) (Figuras 1H e 1K), o que é consistente com a capacidade prejudicada de
manter a temperatura corporal sob desafio a frio (Figura 1A). Estes dados indicam que a depleção da microbiota
prejudica a capacidade termogênica adaptativa tanto da BAT quanto do scWAT. Também não observamos
diferenças na expressão de um conjunto nuclear de genes termogênicos no tecido adiposo visceral perigonadal
(pgVAT) a 22 C e 4 C entre os grupos controle e ABX (Figura S1F). No entanto, a expressão de alguns genes no
pgVAT foi maior em ABX a 30 C (Figura S1F).
Consistente com relatos anteriores, os níveis de expressão de Ucp1 em diferentes tecidos indicaram que
o BAT é o tecido chave para a termogênese em comparação com o scWAT e o pgVAT (Cannon e Nedergaard,
2004) (Figura S1G).
Os níveis de sulfóxido de metionina, frutose 2,6-bisfosfato, monofosfato de guanosina cíclico (GMPc)
(Hoffmann et al., 2015) e ácido pantotênico (vitamina B5) no soro foram significativamente maiores nos
camundongos controle em 22 C e 4 C em relação aos indivíduos ABX . Em contraste, a 11β-prostaglandina F2α
foi significativamente menor nos camundongos controle, tanto a 22 C como a 4 C.
Um estudo anterior relatou que a microbiota intestinal pode regular o metabolismo do triptofano através
da triptofano hidroxilase e promover a biossíntese da serotonina (Yano et al., 2015). Ambos os camundongos
sem germes (GF) e ABX apresentaram concentração de triptofano periférica e serotonina deficiente. Consistente
com estudos anteriores, também descobrimos que o triptofano estava significativamente elevado em
camundongos tratados com ABX (Figura S1H; Tabela S1). Nossos resultados sugerem que a depleção da
microbiota reprime a expressão de Ucp1, e a UCP1, portanto, prejudica a termogênese adaptativa em BAT e em
scWAT tanto a 22 C como a 4 C.
A Depleção da Microbiota no Intestino Reduz o Metabolismo Energético do Anfitrião

Muitos estudos relataram anteriormente que a microbiota intestinal pode influenciar diversos fenômenos
biológicos (...) Para avaliar se o comprometimento da termogênese da BAT e da SCWAT, mediado pelo ABX,
contribui para o gasto energético de todo o corpo, usamos a calorimetria indireta. Aos 22 C, os camundongos
ABX apresentaram 13% menor consumo de oxigênio (VO2) (Figuras 2A e 2C) em comparação aos camundongos
controle (2-way ANOVA, F2,35 = 23,34, p = 0,0304) sem diferenças significativas na relação de troca
respiratória. (RER) (2-way ANOVA, F2,31 = 0,1243, p = 0,5681) (Figuras 2D e 2F) ou atividade física (2-way
ANOVA, F2,29 = 1,333, p> 0,9999) (Figuras 2G e 2I).
Em comparação com 22 C, a exposição ao frio (4 C) aumentou o gasto de energia em camundongos
controle e ABX, o que provavelmente reflete a ativação da termogênese induzida pelo frio. No entanto,
camundongos ABX tiveram 17% menor consumo de oxigênio (Figuras 2B e 2C) em comparação com ratos
controle a 4 C (2 vias ANOVA, F2,35 = 23,34, p <0,0001), novamente, sem impacto no RER (Figuras 2E e 2F)
(2-way ANOVA, F2,31 = 0,1243, p = 0,8186) e atividade física (2-way ANOVA, F2,29 = 1,333, p = 0,7487)
(Figuras 2H e 2I).
Ao mesmo tempo, os camundongos ABX apresentaram menores alterações metabólicas em resposta ao
ciclo circadiano em comparação com os ratos controle a 4 C (Figura 2B). Avaliar se a menor massa corporal após
o tratamento inicial com antibiótico influenciou o processo de termogênese (Figuras S1A e S1B),
Nós geramos um novo grupo de camundongos que foi alimentado em pares (PF) para combinar com a
absorção de energia do grupo ABX a cada dia. O padrão semelhante de alteração no peso corporal entre ABX e
PF ratinhos (Figura S2A) indicou que esta alimentação em pares era eficaz. Os grupos ABX e PF tiveram menor
peso corporal em comparação aos controles (medidas repetidas de 2 vias ANOVA, F59,1,593 = 125,9, p <0,0001)
(Figura S2A) e massa gorda de diferentes sítios anatômicos (Figuras S2E - S2G). Com base na diferença na
ingestão diária de energia (Figura S2B) e nas perdas de energia fecal (Figura S2C), os ratos ABX tiveram uma
eficiência de assimilação significativamente menor (2-way ANOVA, F17,442 = 8,617, p <0,0001) (Figura S2D).
Aos 22 C, não houve diferença significativa na taxa de consumo de oxigênio entre os camundongos PF e
ABX (2-way ANOVA, F2,35 = 23,34, p> 0,9999) (Figuras 2A e 2C). No entanto, os ratos PF tiveram um gasto
de energia significativamente maior induzida pelo frio (25% maior) em comparação com camundongos ABX (2-
way ANOVA, F2, 35 = 23,34, p <0,0001) (Figura 2C). Durante o dia, o RER do grupo PF foi menor (1-way
ANOVA, F5,295 = 126, p <0,0001) do que os grupos controle e ABX, em parte porque eles comeram sua ração
de comida durante a noite e, portanto, não tinham comida disponível no dia. A atividade física de camundongos
PF também apresentou comportamento alimentar antecipado às 16:30 h (1-way ANOVA, F5,50 = 11,53, p
<0,0001), que foi de 30 minutos antes das 17: 00h (Figuras 2G e 2H), mas a atividade física total não foi
significativamente diferente (2-way ANOVA, F2,29 = 1,333, p = 0,2794.
Além disso, comparamos a expressão dos genes termogênicos centrais em BAT e scWAT e descobrimos
que os camundongos PF tiveram uma expressão significativamente maior de Ucp1 em comparação com os
camundongos ABX (Figuras 2J, 2K e S2H). Esses dados para camundongos PF sugeriram que a ingestão de
energia e o peso corporal temporariamente reduzido observado em camundongos ABX não foram a causa de
menor gasto de energia e capacidade termogênica. Em vez disso, os dados sobre o gasto energético total (Figuras
2A-2C) e expressão de proteína UCP1 em BAT e SCWAT (Figuras 1G-1L) apoiaram a ideia de que a depleção
da microbiota prejudicou a termogênese de BAT e scWAT.

Os macrófagos alternativamente ativados não afetam Energia do metabolismo e termogênese no


ABX Mice

De acordo com estudos prévios, a sinalização de citocinas tipo 2 e a ativação alternativa de macrófagos
(M2) desempenham um papel fundamental no processo de escurecimento do scWAT ao longo da faixa de
temperatura de 30 C a 4 C e podem mediar o impacto da microbiota sobre a termorregulação. Portanto, medimos
a expressão gênica dos marcadores M1 e M2 (CD274, Nos2, Arg1, Mrc1, Clec10 e Ccr3), um marcador de
eosinófilos (SiglecF) e os perfis de algumas citocinas tipo 2 (interleucina-4 [IL-4 ], IL-5 e IL-33) utilizando
qPCR. Não observamos diferenças significativas entre esses genes em BAT, scWAT e pgVAT entre
camundongos controle e ABX em diferentes temperaturas ambientes (Figuras 3A, 3B e S3A).
Usando citometria de fluxo (Figuras S3B e S3C), também não encontramos evidências para o aumento da
população de eosinófilos e de macrófagos ativados alternativamente em BAT, scWAT e pgVAT dos
camundongos controle após a estimulação a frio (Figuras 3C-3E). Por outro lado, notamos que a porção de
macrófagos M2 em células imunes totais estava significativamente diminuída em BAT (2-way ANOVA, F120 =
0,5253, p = 0,0008) e scWAT (2-way ANOVA, F1,20 = 0,1078, p <0,0001) em camundongos controle a 4C
comparados aos 22C. No entanto, camundongos ABX tiveram um aumento de macrófagos ativados alternativos
em BAT (2-way ANOVA, F1,20 = 0,5253, p <0,0001), scWAT (2 vias ANOVA, F1,20 = 0,1078, p = 0,0006) e
pgVAT (2-way ANOVA, F1,20 = 0,6391, p = 0,0168) (Figuras 3C – 3E) a 4ºC em comparação com 22ºC. A
22ºC, ABX camundongos tiveram menos macrófagos M2 em BAT (2-way ANOVA, F120 = 0,5253, p <0,0001),
scWAT (2-way ANOVA, F1,20 = 0,1078, p <0,0001), e pgVAT (2-way ANOVA, F1,20 = 36,86, p <0,0001) em
comparação com ratinhos de controlo (Figuras 3C e 3D). Consistente com um estudo anterior (Sua ´rez-Zamorano
et al., 2015), descobrimos que os ratos ABX tinham significativamente mais eosinófilos no scWAT (2-way
ANOVA, F1,20 = 0,8922, p = 0,0085) e pgVAT (2- maneira ANOVA, F1,20 = 16,77, p = 0,0012) em comparação
com camundongos controle a 22 C (Figuras 3D e 3E).
Após a exposição ao frio, no entanto, a população de eosinófilos em camundongos ABX diminuiu e foi
significativamente menor na BAT em comparação com camundongos controle (2-way ANOVA, F1,20 = 3,385,
p = 0,0077) (Figuras 3D e 3E). Nós medimos ainda várias citocinas tipo 2, incluindo IL-4 (2-way ANOVA, F1,43
= 0,3194, p = 0,5749), IL-5 (2-way ANOVA, F1,43 = 2,809, p = 0,1010), e IL-33 (2-way ANOVA, F1,43 =
2,125, p = 0,1524) em scWAT por ELISA, mas novamente, não detectou diferença significativa entre os grupos
controle e ABX (Figura 3F). Para avaliar ainda mais a função da IL-4 no metabolismo energético, avaliamos o
efeito metabólico do tratamento com IL-4 crônica em camundongos controle e ABX alojados a 23 ° C ± 1 ° C.
Administramos IL-4 (50 mg / kg) diariamente por 5 dias. A medição do gasto energético diário (DEE) durante
este período não revelou nenhum efeito diferencial causado pela IL-4 em comparação com a PBS no grupo
controle (2-way ANOVA, F3,9 = 2,960, p = 0,7155) ou na ABX ( Grupo ANOVA de 2 vias, F3,9 = 2,960, p =
0,9713) (Figura 3H); também não houve influência no RER e atividade física (Figuras S3D e S3E).
Ao mesmo tempo, a IL-4 poderia induzir a polarização M2 no BAT e no scWAT no grupo controle,
confirmando que a IL-4 funciona bem, mas não aumentou a expressão da Ucp1 tanto no BAT quanto no scWAT
de ambos os grupos (ANOVA de 2 vias , F3, 30 = 70,75, p> 0,9999) (Figuras S3F-S3H). Estes resultados sugerem
que a sinalização imune tipo 2 e a ativação de macrófagos alternativos provavelmente não contribuem diretamente
para a termogênese adaptativa, o que é consistente com outro estudo recente (Fischer et al., 2017).
Para investigar se a depleção da microbiota induziu massa gorda na parte inferior do corpo (Figuras S2E-
S2G), levando à diminuição da liberação de ácidos graxos livres (o principal substrato para a termogênese da
BAT), medimos o ácido graxo livre (AGL) e triglicerídeos (TG) níveis. Não houve redução significativa nos
AGL circulantes (2-way ANOVA, F1,43 = 0,03571, p = 0,8518) e triglicérides (2-way ANOVA, F1,40 = 0,8681,
p = 0,3571) quando a microbiota estava esgotada (Figura 3I) . Ao mesmo tempo, insulina (2-way ANOVA, F1,17
= 6,463, p = 0,0210) e leptina (2-way ANOVA, F1,18 = 11,58, p = 0,0032) de camundongos ABX foram
significativamente menores do que ratos controle ( Figura 3I). Portanto, era potencialmente o caso que a depleção
da microbiota poderia ter impedido a síntese de noradrenalina, que é importante para a lipólise e a termogênese.
Medimos o conteúdo de noradrenalina no scWAT, e não houve diferença significativa entre os camundongos
controle e ABX (2-way ANOVA, F1,17 = 2,674, p = 0,1204) (Figura 3G).
Em resumo, não conseguimos demonstrar qualquer relação significativa entre a termogênese e a
sinalização de citocinas tipo 2 e a ativação alternativa de macrófagos. Além disso, a depleção da microbiota não
promoveu o escurecimento por meio do aumento da sinalização de citocinas tipo 2 no scWAT. Embora em
camundongos 22 C ABX houvesse mais eosinófilos em scWAT e pgVAT que em camundongos controle, não
observamos diferença na expressão de Ucp1. Nossos dados são consistentes com o recente relato de que as
citocinas do tipo 2 não têm função na termogênese (Fischer et al., 2017).

O Metabolismo Energético Característico dos Ratos GF

Para avaliar se nossos resultados poderiam ser explicados pelos efeitos de toxicidade de antibióticos na
termogênese, usamos camundongos GF para verificar nossos resultados.
Os resultados do núcleo em ratos GF foram consistentes com os dados que obtivemos dos ratos ABX. À
temperatura ambiente, os camundongos GF apresentaram uma temperatura corpórea significativamente mais
baixa (35,88 ± 0,25 C) em comparação com camundongos livres de patógenos específicos (36,83 ± 0,12 C) (teste
de Mann-Whitney bicaudal, p = 0,0041) (Figura 4A) sem uma diferença de condutância térmica (1-way ANOVA,
F2,10 = 50,15, p = 0,9888) (Figura S4A). Usando a técnica de água duplamente marcada (DLW) (Speakman,
1997), medimos o metabolismo energético de camundongos GF e descobrimos que camundongos GF tiveram
DEEP menores que camundongos SPF, apesar de serem substancialmente mais pesados (teste de Mann-Whitney
bicaudal, p < 0,0001).
Entre os indivíduos SPF, a massa corporal média de 26,22 ± 0,27 g e DEE média de 42,50 ± 1,24 kJ / dia
(n = 16). Nos camundongos GF, os valores equivalentes foram 34,04 ± 1,02 ge 18,61 ± 1,27 kJ / dia (n = 12)
(Figura 4B). Além disso, não observamos nenhum efeito benéfico da ausência de microbiota em camundongos
GF no escurecimento em scWAT por qPCR (2-way ANOVA, F1,16 = 17,79, p> 0,9999) ou análise de Western
blot (2-way ANOVA, F1 , 16 = 12,55, p = 0,1584) em comparação com murganhos SPF (Figuras 4C e 4D). Estas
observações contrastam o estudo anterior, que sugeriu que os ratos GF têm mais Ucp1 em SCWAT (Sua rez-
Zamorano et al., 2015). Não observamos diferenças significativas nos perfis de expressão de marcadores de
diferenciação de adipócitos ou genes transportrelados de elétrons mitocondriais no scWAT de camundongos GF
(Figura 4C).
Além disso, a expressão da UCP1 na BAT foi significativamente reduzida (55%) (2-way ANOVA, F1,16
= 12,55, p = 0,0307), mas não houve alteração nos níveis de lipase hormônio-sensíveis (teste Mann Whitney
bicaudal, p = 0,1508) (Figura 4D). Notavelmente, apesar da significativa regulação positiva de IL-4 (teste de
Mann-Whitney bicaudal, p = 0,0003), IL-5 (p = 0,0047) e IL-33 (p = 0,003) no scWAT de camundongos GF,
Não houve diferenças na expressão de genes termogênicos, sugerindo que as citocinas tipo 2 não são os principais
impulsionadores do processo de escurecimento no modelo GF (Figura 4E). Em vez disso, a regulação positiva
dessas citocinas pode ser uma compensação para o comprometimento do sistema imunológico de camundongos
GF (Arpaia et al., 2013; Brestoff e Artis, 2013; Hill et al., 2012).
Os niveis de noradrenalina tambem foram mais elevados no scWAT de ratinhos GF (teste de Mann-
Whitney bicaudal, p = 0,0648) (Figura 4E). Isto sugeriu que scWAT de ratinhos GF foi resistentes ao
escurecimento induzido por noradrenalina. Para demonstrar se este era o caso, administramos camundongos SPF
e GF com CL-316243 (1 mg / kg) (agonista beta 3-adrenérgico altamente seletivo) por 2 dias. A dose de CL-
316243 que cada camundongo GF recebeu foi significativamente maior do que para camundongos SPF com base
em seu maior peso corporal, mas notavelmente, a quantidade de proteína UCP1 no scWAT de camundongos GF
pós-tratamento foi significativamente menor (1 via ANOVA F1,6 = 5,98, p = 0,04) (Figura 4F). Após o
tratamento com CL-316243, mais adipócitos de gotículas lipídicas multiloculares apareceram nos ratos scWAT
de SPF do que nos ratos GF, que é um fenótipo clássico de "escurecimento" (Figura 4G).
O escurecimento do WAT induzido por CL-316243 aumenta o uso de ácidos graxos como substrato
metabólico. O peso de scWAT (2-way ANOVA, F1,20 = 1,092, p = 0,0212) e pgVAT (2-way ANOVA, F1,20 =
1,648, p = 0,0032) diminuiu significativamente no grupo SPF (Figura S4B), e o conteúdo de AGL foi reduzido
(ANOVA 2-way, F1,21 = 14,59, p = 0,0003) mas não em camundongos GF (2-way ANOVA, F1,21 = 14,59, p>
0,9999) (Figuras 4H e S4C). Triglicerídeos diminuíram tanto no grupo SPF (2-way ANOVA, F1,21 = 103,5, p
<0,0001) quanto no grupo GF (2-way ANOVA, F1,21 = 103,5, p = 0,0008). Com a diminuição da massa gorda,
o conteúdo de leptina também foi reduzido em camundongos SPF, mas os níveis de adiponectina permaneceram
inalterados (Figura 4H). Estes resultados apoiam ainda mais a nossa conclusão de que as citoquinas do tipo 2 não
podem promover o escurecimento do scWAT. Apesar dos níveis mais elevados de citocinas tipo 2 e
noradrenalina, a depleção da microbiota não promoveu o escurecimento do scWAT em camundongos GF.

Depleção da microbiota por diferentes protocolos ABX tem efeitos fisiológicos similares
Nós exploramos se o ABX afetou a ativação do adrenorreceptor b3. O consumo de oxigénio em resposta
ao CL-316243, à temperatura ambiente e foi significativamente elevada rapidamente em ratinhos de controlo em
comparação com o tratamento de PBS (ANOVA de 2 vias, F22,22 = 12,39, p <0,0001). No entanto, esta indução
foi severamente atenuada em ratinhos ABX (2-way ANOVA, F22,22 = 12,39, p = 0,2178) (Figura 5A). Não
houve diferença no RER (2-way ANOVA, F22,22 = 1,256, p> 0,9999) (Figura 5B) ou atividade física (2-way
ANOVA, F22,22 = 7,588, p> 0,9999) (Figura S5A) entre ratos de controlo e ABX sob tratamento com CL-
316243. No entanto, camundongos controle ganharam significativamente mais proteína UCP1 (2-way ANOVA,
F1,20 = 13,37, p <0,0001) (Figura 5C) e Ucp1 mRNA (2-way ANOVA, F1,21 = 9,244, p <0,0001) em scWAT
(Figura 5D) sob tratamento com CL-316243 do que os ratos ABX.
Em seguida, perguntamos se diferentes formulações de ABX também poderiam suprimir a termogênese.
Repetimos nosso experimento ABX junto com outro protocolo ABX publicado (referido aqui como ABX-SZ)
por 30 dias. Ambos ABX e ABX-SZ não demonstraram diferença no peso corporal (medidas repetidas de 2 vias
ANOVA, F21,588 = 105,1, p = 0,3635) e ingestão de alimentos (medidas repetidas de 2 vias ANOVA, F21,567
= 9,962, p = 0,7) em comparação com camundongos controle após 30 dias de tratamento (Figuras S5B e S5C), e
eles não demonstraram diferença na massa de tecido em diferentes locais anatômicos entre ABX e ABX-SZ
(Figura S5D). Em comparação com camundongos controle, ambos os camundongos ABX e ABX-SZ
apresentaram níveis semelhantes de expressão gênica de Ucp1 em temperatura ambiente (2-way ANOVA, F1,28
= 103,4, p> 0,9999), mas o nível de expressão do gene Ucp1 diminuiu significativamente quando agudamente
exposto a uma temperatura ambiente de 4 C durante 48 horas (ANOVA de 2 vias, F1,28 = 103,4, p = 0,0010)
(Figura 5E).
Não houve diferença entre ABX e ABX-SZ no consumo de oxigênio (2-way ANOVA, F2,9 = 3,23, p>
0,9999), RER (2-way ANOVA, F2,9 = 2,887, p = 0,1583) e atividade física (2-way ANOVA, F2,9 = 3,835, p =
0,0784) antes e depois do tratamento com CL-316243 temperatura ambiente (Figuras 5F, S5E e S5F). Em
comparação com os ratos de controlo, tanto os murganhos ABX como os ratos ABX-SZ apresentaram menor
consumo de oxigénio (2-way ANOVA, F2, 9 = 13,43, p = 0,0313) após o tratamento com CL-316243. Também
não houve diferença no RER (2-way ANOVA, F2,9 = 2,887, p> 0,9999) e atividade física (2-way ANOVA, F2,9
= 3,980, p> 0,9999) em camundongos ABX-SZ em comparação com o controle ratos. Para determinar as
assinaturas de expressão gênica após diferentes tratamentos ABX em tecido adiposo, foi realizada análise de
RNA-seq em scWAT e pgVAT de camundongos à temperatura ambiente no dia 28 do tratamento.
A aglomeração hierárquica dos genes diferencialmente expressos entre as amostras de RNA-seq é
mostrada nas Figuras 5G, S6A e S6B, e na Tabela S2. As principais diferenças no scWAT foram relacionadas às
vias imunes, e nenhuma diferença foi encontrada no pgVAT entre ABX e ABX-SZ (Figura S6D). Consistente
com os nossos resultados qPCR, ambos os ratos ABX e ABX-SZ não apresentaram diferenças na expressão
gênica de citocinas Ucp1, M2, ou tipo 2 em comparação com os ratos controle.
O receptor de butirato Hcar2 (receptor de ácido hidroxicarboxílico 2, também conhecido como Gpr109a)
foi significativamente suprarregulado em camundongos ABX e ABXSZ em comparação com camundongos
controle, enquanto os receptores FFA Ffar2 (também conhecido como Gpr43) e Ffar3 (também conhecido como
Gpr41) não mostraram diferença (Figura S6C). A expressão gênica selecionada foi validada por qPCR (Figura
5H). Não houve diferença no padrão de expressão gênica entre ABX e ABX-SZ no pgVAT (Tabela S3). Nossos
dados sugerem que a depleção da microbiota por diferentes protocolos ABX teve efeitos similares e não
promoveu DEE elevado e termogênese adaptativa.

Microbiota de Recolonização e Butirato Resgata Parcialmente a termogênese dos ratos ABX

Avaliamos o conteúdo de 16S rDNA para o pellet fecal em camundongos controle, ABX e ABX-SZ por
qPCR (Thackray et al., 2018). Ambos os tratamentos ABX e ABX-SZ reduziram o conteúdo bacteriano para (5
± 0,5) 3 104 pg de DNA por grama de sedimento fecal em comparação com (2,8 ± 0,2) 3 107 pg / g em murganhos
de controlo. Estas alterações ocorreram imediatamente após os tratamentos com ABX e ABX-SZ, sugerindo que
ambos os protocolos ABX esgotaram de forma eficiente a maioria da microbiota intestinal (Figura 6A). O
sequenciamento dos amplicons de 16S rDNA do ceco revelou que menos unidades taxonômicas operacionais
(OTUs) foram detectadas nos grupos ABX e ABX-SZ em comparação ao grupo controle (Figura 6B). Além disso,
a análise da coordenada principal (PCoA) da métrica de fração única ponderada (UniFrac) ilustrou que esses dois
tratamentos diferentes com protocolo antibiótico (ABX e ABX-SZ) tiveram impactos semelhantes sobre a
composição bacteriana (Figura 6C).
Lachnospiraceae (pertencentes à bactéria produtora de butirato Clostridia) foram induzidas por
estimulação a frio em camundongos controle (Figuras 6D, 6E, S7A e S7B).
Os indivíduos com PF que apresentaram maior nível de expressão da UCP1 também apresentaram
Clostridia significativamente maior. A abundância de DNA de Clostridia nos demais conteúdos de fezes de ABX
e ABX-SZ foi significativamente menor que nos animais de controle na 4C.
Nós exploramos se o repovoamento da microbiota em camundongos ABX poderia reverter o impacto
negativo no escurecimento WAT. Imediatamente após a retirada do tratamento antibiótico, os camundongos ABX
foram transferidos para gaiolas contendo os ninhos antigos e cama suja de camundongos controle por 5 dias.
Após 5 dias de tratamento de repovoamento da microbiota, estes ratos foram transferidos para uma temperatura
ambiente de 4 ° C por 48 h.
Descobrimos que o conteúdo de 16S rDNA por sedimento fecal medido por qPCR (Thackray et al., 2018)
e os níveis de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), incluindo acetato, propionato e butirato das fezes do ceco,
foram significativamente restaurados no camundongos repovoados (RO) em comparação com os camundongos
ABX (Figuras S7C e S7D).
Camundongos RO apresentaram uma expressão significativamente aumentada de Ucp1 (1-way
ANOVA, F2,13 = 8,492, p = 0,0036) em resposta à estimulação a frio em comparação com camundongos ABX
(Iida et al., 2013) (Figura S7E). Estes dados indicaram que a recolonização intestinal da microbiota beneficia a
termogênese adaptativa no scWAT.
Um mecanismo potencial pelo qual a microbiota pode influenciar o metabolismo do hospedeiro é através
de metabólitos gerados durante a fermentação microbiana no intestino. Estudos prévios relataram que AGCCs
com metabólitos bacterianos comensais, especialmente butirato, um inibidor típico da histona deacetilase
(HDAC) (Candido et al., 1978; Sealy e Chalkley, 1978), podem regular a expressão de numerosos genes através
de diferentes mecanismos (...) . HDAC1 e HDAC3 demonstraram desempenhar um papel fundamental no
processo de termogênese (Emmett et al., 2017; Li et al., 2016). A maior parte do butirato no ceco pode ser usada
pelas mitocôndrias como substrato energético no cólon. No entanto, alguns butiratos podem entrar no sistema
circulatório e atravessar a barreira hematoencefálica via transportadores monocarboxilatos (MCTs) (Vijay e
Morris, 2014).
Estudos recentes sugeriram que o butirato poderia ativar a BAT através de um circuito neural direto do
intestino (Li et al., 2018). Portanto, avaliamos se o butirato exógeno promoveria a termogênese adaptativa em
camundongos com microbiota empobrecida. Camundongos controle e ABX receberam butirato de sódio (80 mg
/ dia) por um período de 7 dias consecutivos por gavagem oral à temperatura ambiente (23 ± C ± 1 ºC).
Descobrimos que a temperatura corpórea central dos camundongos ABX aumentou de 36,34 ± C ± 0,16 ° C para
37,07 ± C ± 0,22 ° C (2-way ANOVA, F1,26 = 0,5477, p = 0,0165), mas não houve efeito significativo em
ratinhos de controlo (de 36,83? C? 0,13? C a 36,82? C? 0,09? C) (Figura 6F).
A análise de proteínas mostrou que o tratamento com butirato aumentou significativamente o conteúdo
de UCP1 na BAT (1-way ANOVA, F1,6 = 5,98, p = 0,017) e scWAT (1-way ANOVA, F1,6 = 5,98, p = 0,019)
de camundongos ABX em comparação para controlar camundongos (Figura 6G), mas o tratamento com butirato
não teve influência no peso corporal em camundongos controle e ABX (Figura S7F). Um estudo recente sugeriu
que o butirato diminui a ingestão de alimentos e inibe a atividade neuronal orexígena no hipotálamo (Li et al.,
2018). Nós também descobrimos que o butirato diminuiu a ingestão de alimentos no grupo controle, mas não no
grupo tratado com ABX (Figura S7G). O nível de butirato nas fezes do ceco foi significativamente diminuído
por um fator de 1.000 em indivíduos ABX (3.4 ± 0.2 mMol / g) e ABX-SZ (3.2 ± 0.14 mMol / g). O tratamento
com gavagem com butirato restaurou um nível de butirato a 10% (220,2 ± 54,6 mmol / g) comparado com o
grupo controle (2.352 ± 206,2 mmol / g) (Figura 6H). Em contraste com as fezes do ceco, não houve diferença
significativa entre camundongos controle e camundongos ABX nos níveis séricos de butirato após gavagem com
butirato. Este resultado é consistente com estudos recentes que indicaram que a supressão da ingestão de
alimentos por gavagem com butirato era independente dos níveis de butirato circulante (Chevalier et al., 2015;
Li et al., 2018) (Figura S7H; Tabela S4). Esses dados sugerem que o metabólito bacteriano butirato aumentou o
gasto energético e resgatou parcialmente a termogênese prejudicada pela depleção da microbiota.
Rastreamento de isótopos e análise do fluxo metabólico de 13C-butirato in vivo

O mecanismo pelo qual o butirato pode regular a temperatura corporal e a expressão da UCP1 não é claro.
Um mecanismo possível é que o butirato administrado por via oral possa ser distribuído aos tecidos periféricos,
como o BAT e o WAT, quando a microbiota é depletada e o butirato desempenha o papel de um substrato
energético ou um inibidor de HDAC. Um mecanismo alternativo possível é que o cérebro é sensibilizado para os
níveis de butirato no intestino após o tratamento com ABX, e o butirato administrado por sonda regula a BAT
através de um eixo do intestino-cérebro ativado. Para explorar esses diferentes mecanismos, medimos se havia
uma diferença na distribuição exógena de butirato usando gavagem de butirato marcado com 13C. Administramos
o mesmo nível de butirato de sódio para controle e camundongos ABX por 6 dias e gavagem mista [U13C] e 12C
butirato de sódio (proporção 1: 9) no dia 7. O butirato pode ser usado pelas mitocôndrias após a distribuição e
exalado como CO2. Portanto, determinamos cuidadosamente o tempo de sacrifício em 1 h após a gavagem
medindo o 13CO2 em camundongos controle (Figura S8A). Como o butirato pode entrar no ciclo do ácido
tricarboxílico (TCA) via acetil-coenzima A (CoA), realizamos uma análise de metabólitos direcionados para os
metabólitos de SCFA e TCA em vários tecidos (Figura 7A). A captação de acetato, propionato e butirato no ceco
e no cólon foi amplamente limitada em indivíduos ABX, e o tratamento por gavagem com butirato pôde
seletivamente restaurar os níveis de butirato no ceco e cólon (Figuras 7B, 7C, S8B e S8C). A relação 13C: 12C
de butirato em indivíduos ABX foi significativamente maior que em indivíduos controle no cólon (7,8% ± 1,1%
versus 10,5% ± 0,4%) e ceco (7,6% ± 1,1% versus 10,4% ± 0,4%) ( Figura 7F).
Descobrimos que vários isótopos m + 2 de metabolitos de TCA tais como citrato, succinato, fumarato e
malato foram significativamente enriquecidos nos cérebros de ratinhos ABX em comparação com ratinhos de
controlo após tratamento com gavagem com butirato (Figura 7D). Mais importante, a contribuição fracionada do
butirato de [U13C] para citrato foi substancialmente maior no cérebro (relação> 1: 9) do que BAT, scWAT, cólon
e ceco, e a relação 13C: 12C de citrato foi significativamente maior em indivíduos ABX. (42,2% ± 4,5%) em
relação aos controles (25,3% ± 3,3%) no encéfalo (Figura 7F). Este resultado sugeriu que há uma rota seletiva
para o butirato do intestino para o cérebro. Estudos recentes sugeriram que o enriquecimento do succinato poderia
ativar a termogênese na BAT e confirmamos que os níveis de succinato foram mais altos do que outros
metabólitos de TCA na BAT estimulada pelo frio (Figura 7E). Não houve diferença significativa de
enriquecimento em metabólitos de m + 4 butirato ou m + 2 TCA em BAT (Figura 7E) e em scWAT (Figuras
S8D e S8E) entre camundongos controle e ABX após tratamento com gavagem com butirato. Esses resultados
indicaram que o butirato provavelmente regula a temperatura corporal e a expressão da UCP1 via um eixo do
intestino-cérebro ativado, ao invés de uma interação direta entre o butirato e os tecidos adiposos.
DISCUSSÃO
Números crescentes de estudos relataram relações entre a microbiota intestinal e os estados fisiológicos
do hospedeiro tanto em camundongos quanto em humanos. Embora alguns estudos indiquem uma ligação entre
a microbiota intestinal e a obesidade e diabetes (...), o impacto da microbiota intestinal em diferentes adipócitos
não é claro. Uma vez que a UCP1 desempenha um papel vital na termogênese sem tremores, nós nos
concentramos em saber se a microbiota intestinal afeta a termogênese dependente da UCP1. Descobrimos que a
UCP1 foi atenuada durante um desafio agudo de temperatura ambiente fria e após a administração de um agonista
de adrenorreceptor b3 (Adrb3), quando a microbiota intestinal estava ausente. Nosso trabalho apóia a idéia de
uma ligação entre a microbiota intestinal e a termogênese dependente de UCP1 de adipócitos marrons e beges
(brite). Evidências crescentes sugerem que a UCP1 não é necessária na adaptação a longo prazo ao frio, e a
captação de glicose da BAT sob estimulação CL-316243 (Keipert et al., 2017) e mecanismos termogênicos
independentes da UCP1 como a creatina (Kazak et al., 2015 ) ou retículo sarcoplasmático / endoplasmático, ciclos
de Ca2 + -ATPase 2b (SERCA2b) (Ikeda et al., 2017) em adipócitos beges também podem contribuir para a
homeostase energética do corpo inteiro. Se esses processos também estão prejudicados na ausência da microbiota
intestinal, é atualmente desconhecido.
Camundongos GF e ABX têm sido usados com frequência para estudar o impacto da microbiota intestinal
no hospedeiro (Lundberg et al., 2016; Sivan et al., 2015; Ve´tizou et al., 2015; Yang et al., 2017). Aqui, nós
relatamos algumas características fisiológicas de camundongos ABX e GF, incluindo a medição de DEE de
animais GF usando a técnica DLW, e termogênese b3-adrenérgica induzida.
Muitos estudos prévios relataram que camundongos ABX ou GF resistem à obesidade induzida por dieta
com alto teor de gordura e melhoram o metabolismo da glicose (...). Descobrimos que a expressão da UCP1 e o
gasto energético de todo o corpo foram atenuados com a depleção da microbiota intestinal. Isso contrasta com
um estudo anterior (Sua ´rez-Zamorano et al., 2015), que sugere que a depleção da microbiota promove o
escurecimento. A mistura de antibióticos que eles usaram diferiu do que usamos. Assim, nós replicamos nossos
estudos usando sua receita antibiótica (ABX-SZ), mas não descobrimos que a depleção da microbiota facilitou o
escurecimento do WAT. Em contraste, descobrimos que os ratos tratados com antibióticos (independente do
coquetel utilizado) e camundongos GF tiveram uma capacidade prejudicada para termogênese dependente de
UCP1. Além disso, a expressão de UCP1 regulada para baixo pode ser considerada inconsistente com o melhor
desempenho do metabolismo da glicose nos camundongos ABX. No entanto, a capacidade de captação de glicose
nem sempre é positivamente correlacionada com a termogênese dependente da UCP1 (Olsen et al., 2017). Por
exemplo, estudos recentes sugeriram que a captação de glicose é elevada em camundongos knockout Ucp1 (KO)
e que os adipócitos marrom ou bege poderiam consumir glicose através da via SERCA2b de uma maneira
independente da UCP1 (Ikeda et al., 2017; Olsen et al. , 2017).
Uma comunidade de microbiota intestinal saudável beneficia a homeostase metabólica do hospedeiro e,
reciprocamente, a composição da microbiota intestinal pode ser moldada pela temperatura ambiente e pelos
macronutrientes da dieta (...). Tem sido sugerido que os níveis de AGCCs estão positivamente associados ao
aumento do metabolismo energético (...), enquanto outros metabólitos derivados da microbiota, como
trimetilamina e propionato de imidazol, foram sugeridos como negativamente relacionados à saúde do hospedeiro
(Hsiao et al., 2013; Koeth et al., 2013; Koh et al., 2018). Os metabólitos derivados da microbiota não apenas
desempenham papéis vitais na educação imune do hospedeiro e defesa do patógeno, mas também estão
envolvidos no estado nutricional do hospedeiro (Blanton et al., 2016; Guglielmi, 2018). Aqui, confirmamos que
a capacidade de absorção de energia diminuiu em camundongos ABX; Além disso, os resultados dos
camundongos PF sugeriram que a ingestão de energia e o peso corporal temporariamente reduzido observado em
camundongos ABX não foram a causa do menor gasto de energia e da capacidade termogênica amortecida.
A ausência de microbiota intestinal, via tratamento antibiótico ou no modelo GF, pode resultar na depleção
de metabólitos gerados durante a fermentação microbiana no intestino, promovendo assim um estado de
deficiência de metabólitos intestinais. Nossos resultados são consistentes com estudos anteriores que mostraram
que, sob tratamento com ABX, todos os tipos de AGCCs e ácidos biliares quase desapareceram no ceco. Um
estudo anterior mostrou que as bactérias produtoras de butirato foram aumentadas pela estimulação a frio
(Chevalier et al., 2015), e confirmamos este fenótipo. A expressão de Hcar2, um receptor de butirato (Offermanns,
2017), foi dramaticamente aumentada em camundongos ABX e ABX-SZ em comparação com camundongos
controle, enquanto outros receptores SCFA Ffar2 e Ffar3 não mostraram diferença.
Vários estudos recentes sugeriram que o butirato exógeno poderia aumentar o gasto energético do
hospedeiro e promover a expressão da UCP1 (Gao et al., 2009; Li et al., 2018). Em um estudo piloto, também
descobrimos que o butirato exógeno teve efeitos maiores do que o acetato e propionato (dados não mostrados).
Isso nos levou a avaliar se o butirato exógeno poderia resgatar a hipotermia e promover a expressão da UCP1
quando a microbiota intestinal estivesse ausente. Usando a análise do fluxo metabólico de 13C-butirato,
descobrimos que a absorção e utilização de butirato foram mais rápidas no cérebro que no BAT e no WAT, uma
vez que o butirato entra na circulação. Isso sugere que o butirato atua possivelmente no cérebro por meio do eixo
gastrointestinal (Mayer et al., 2015) para regular a ingestão de alimentos e a termogênese.
Em resumo, esses dados mostraram que a depleção da microbiota mediada por antibióticos não promove
o escurecimento da WAT por meio de sinalização de citocinas tipo 2 e macrófagos ativados alternativamente,
mas afeta negativamente a termogênese adaptativa mediada via BAT interescapular e o escurecimento do
scWAT. Esses efeitos foram confirmados em camundongos GF e em camundongos tratados com um ABX
diferente. Uma microbiota intacta pode, assim, ser um componente essencial da resposta termorreguladora, e o
butirato derivado de micróbios pode ser um fator mediador nesse papel.
LIMITAÇÕES DO ESTUDO
Embora tenhamos descoberto que a termogênese dependente do DEE e da UCP1 foi atenuada por meio
de dois protocolos ABX comuns e em camundongos GF (Abt et al., 2012; Sua rez-Zamorano et al., 2015), nosso
trabalho tem várias limitações. Em primeiro lugar, é inevitável que o fundo da composição da flora intestinal do
nosso trabalho é distinto de outros estudos porque de diferentes condições de alojamento, dieta, o sexo, a idade,
via de administração de antibiótico (água ou gavagem potável), e outros factores (Ussar et al. , 2015). Este é um
grande desafio para a repetibilidade nos estudos da microbiota intestinal. Além disso, vários antibióticos foram
relatados como sendo tóxicos para as mitocôndrias (Hangas et al., 2018; Jiang et al., 2018; Kalghatgi et al., 2013;
Moullan et al., 2015). É possível que a função mitocondrial do hospedeiro tenha sido afetada pelos antibióticos,
embora tenhamos obtido os mesmos resultados usando dois coquetéis bastante diferentes. No entanto, também
replicamos com sucesso alguns dos dados usando camundongos GF, nos quais nenhum artefato antibiótico estaria
presente. No entanto, um procedimento padrão ouro para camundongos tratados com antibióticos é urgentemente
necessário para a pesquisa da microbiota intestinal. Alternativamente, os estudos devem usar, como nós, vários
coquetéis de antibióticos para mostrar que a resposta não depende do coquetel. Em segundo lugar, a composição
da microbiota intestinal é complexa, e mesmo múltiplas combinações de antibióticos são incapazes de esgotar
completamente a microbiota intestinal. Bactérias e fungos resistentes a antibióticos permanecem no trato sob
tratamento com ABX; Portanto, é possível que o desequilíbrio da microbiota intestinal possa influenciar a
homeostase da energia do hospedeiro (Dollive et al., 2013; López et al., 2014; Underhill e Iliev, 2014). Nosso
estudo mostrou claramente que a composição foi alterada sob um desafio a frio. No entanto, não conseguimos
isolar o impacto do microbioma intestinal em uma única espécie na microbiota. Esse pode não ser um efeito de
uma única espécie, e os detalhes desse mecanismo requerem mais estudos.
Terceiro, o mecanismo molecular subjacente ao papel da termogênese indutora do butirato em
camundongos ABX permanece incerto. Nossos dados mostraram que o receptor de butirato Hcar2 foi aumentado
em camundongos ABX, sugerindo que eles podem ser mais sensíveis ao butirato exógeno. Então, a função
molecular do butirato na termogênese pode estar relacionada ao seu papel como inibidor de HDAC (Emmett et
al., 2017; Li et al., 2016; Walsh et al., 2015). Usando a análise do fluxo metabólico de 13C-butirato, mostramos
que o cérebro absorve e usa mais butirato do que o BAT e o WAT. Isso é consistente com um relatório recente
(Li et al., 2018) sugerindo que o butirato poderia ativar a BAT através do circuito neural do cérebro intestinal.
Mais trabalho é necessário para explorar a função do butirato no cérebro. Por fim, descobrimos que os ratos ABX
e GF tratados com 3 a 4 semanas apresentaram hipotermia e atenuaram o gasto de energia após a administração
de um agonista do receptor b3-adrenérgico. No entanto, não fomos capazes de realizar um desafio a frio em
camundongos GF por causa de suas condições especiais de alojamento. Nem todos os experimentos são viáveis
para camundongos GF, o que é uma desvantagem comum de seu uso. Apesar dessas limitações, nosso estudo
ainda fornece a clara relação entre a microbiota intestinal e a termogênese adaptativa e oferece alguns insights
importantes em estudos futuros usando modelos de camundongos ABX e GF para investigar melhor os
mecanismos que sustentam o eixo intestino-cerebral.