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Microbiología
Equipo 9:
Castillo Noh Jonathan Emir
Ochoa Álvarez Alejandro
Puc Kantún Luis Enrique
Soto Broca Alejandro
Uc Hau Roger Abraham
Introducción. Objetivo del ejercicio de análisis del tema (NO del artículo),
información general que lleve al lector a comprender la importancia o aportación de la
publicación. Objetivo breve y claro del artículo.
(20 puntos): Pertinencia de la información, declaración de la importancia o aportación
del artículo, diferenciación entre el objetivo de este ejercicio y el objetivo del artículo
seleccionado.
Nutrientes -1 0 +1
Extracto de levadura 2 g/l 7 g/l 12 g/
Peptona 2 g/l 7 g/l 12 g/l
Glucosa 0.5 g/l 5 g/l 9.5 g/l
NaCl 5 g/l 25 g/l 45 g/l
Betaína 1 mM 10 mM 19 mM
Ampicilina 10 µg/ml 80 µg/ml 150 µg/ml
En este experimento, las condiciones a las que el IPTG fue inducido, se basaron en los resultados de
expresión máxima del experimento previo de Box-Behnken, cuyas condiciones son OD: 0.473, pH inicial:
7.65, IPTG: 0.729 mM, tiempo de incubación, antes de la inducción: 4.6 h, temperatura de inducción:
32.4°C. El medio en el que fueron estudiadas las variables, fue un medio LB en forma líquida.
Para la realización de los experimentos se utilizaron dos medios de cultivo: El medio R-medium
modificado, y el LB broth medium, o caldo LB. Cabe mencionar que en todos los medios, al ser
analizados en sus respectivos experimentos, se les fue agregado después de cierto tiempo (tiempo de
inducción, variable analizada en el primer experimento) una molécula llamada isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranósido, cuya función principal es la de inducir a la E. coli a una mayor producción de
proteínas recombinantes. En cuanto a la solución de nutrientes suministrada por los lotes, esta estaba
compuesta por glucosa, extracto de levadura, peptona, MgSO4*7H2O, ácido cítrico, KH2PO4 ,
(NH4)2SO4, Na2HPO4*12H2O, MgCl2 y NH4Cl.
Medios utilizados
Nutrientes suministrados
R-medium (modificado) LB- medium
por lote (fed batch)
Compon Ácido cítrico –3, Peptona -10.0 g Ácido cítrico –3
entes KH2PO4 –6.75, Extracto de levadura KH2PO4 –6.75,
(g/L) (NH4)2SO4 –5, -5.0 g (NH4)2SO4 –5,
Na2HPO4•H2O –3, NaCl -10.0 g Na2HPO4•12H2O –3,
MgCl2 –1.5, MgCl2 –5,
NH4Cl –0.1, NH4Cl –0.1,
Glucosa –20, Glucosa –750,
Extracto de levadura Extracto de levadura
–20, –50,
Peptona –30, Peptona –75,
y 6 ml de solución MgCl2 –5,
de metal traza. MgSO4•7H2O –20
Fuentes de
Fuentes de Fuentes de Carbono:
Carbono: Glucosa Glucosa
Carbono: Glucosa
Macron Fuentes de N:
utriente Fuentes de N: Fuentes de N:
Peptona, (NH4) Peptona, (NH4) 2SO4,
s Peptona
2SO4, NH4Cl.
NH4Cl.
Minerales: Na, K, Mg
Micronu Minerales: Na, Cl Minerales: Na, K,
KH2PO4, MgCl2. Mg, KH2PO4, MgCl2.
trientes
Factore
s
Ninguno Ampicillina Ninguno
selectiv
os
R-medium
Debido a que el medio carece de Agar o un agente gelificante y a que este está diseñado para cultivar a
la E. coli en agitación, es que se deduce que es un medio líquido y es un medio general debido a la
ausencia de agentes selectivos. Su composición es no definida ya que posee peptona y extracto de
levadura.
Criterio. Clasificación
Estado físico. Líquido.
Función. No selectivo.
Composición. No definido
Broth LB medium
El artículo reporta que el medio fue comprado a la compañía Difco (USA), por lo que se consultaron las
especificaciones de tal producto. Este medio líquido cuenta con peptona y extracto de levadura que
promueven el crecimiento y ayudan a disminuir la acumulación de acetato, además, el medio LB
contiene NaCl para la captación intracelular de osmolitos por presión osmótica (Sekar et al., 2018) y
adicionalmente se le ha agregado 50 micro-gramos/litro de ampicilina, un antibiótico el cual es soportado
en pequeñas cantidades por la E. coli (Zhanel G, pp 2, 2006).
Por lo que la clasificación del medio LB fue el siguiente
Cuadro 5. Clasificación del medio de cultivo.
Criterio. Clasificación
Estado físico. Líquido.
Función. Selectivo.
Composición. No definido
Es de función selectiva porque contiene ampicilina y no todas las bacterias logran soportar la
concentración especificada en el medio. (Zhanel G, pp 2, 2006)
En el segundo experimento, se buscó optimizar un medio de cultivo mediante la adición de los 6 factores
antes mencionados (cuadro 4). El medio LB contiene de por sí: peptona, extracto de levadura y cloruro
de sólido, sin embargo, para encontrar un medio de cultivo óptimo se modificó este en cuanto a las
concentraciones de los componentes propios del medio (NaCl, extracto de levadura y peptona) y además
se le añadieron componentes extra: betaina y glucosa. La función de la glucosa esencialmente es actuar
como fuente de carbono. La betaina tuvo dos funciones: actuar como osmolito y actuar como chaperona
al estabilizar a las proteínas recombinantes cuando estas se estén desnaturalizando (Fernández, 2012; p
45).
Resultados
Los resultados de la producción y expresión de proteínas se dan como una medida relativa a la
producción y expresión obtenida de los ensayos de control realizados respectivamente en cada
experimento.
Referencias
Sekar, et al., Statistical optimization of culture medium to produce recombinant viral protein by
Escherichia coli host for diagnostic kit to detect human immunodeficiency virus (HIV) infection,
Biochemical and Biophysical Research Communications (2018),
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.08.133
Lessard, J. C. (2013). Growth Media for E. coli. Laboratory Methods in Enzymology: Cell, Lipid
and Carbohydrate, 181–189. doi:10.1016/b978-0-12-420067-8.00011-8
PanReac AppliChem ITW Reagents. (22/02/2019). Triptona. URL:
https://www.itwreagents.com/italy/es/product/m_ingredientestriptona+%28ingrediente%29+para+
microbiolog%C3%ADa/403682
Merck. (22/02/2019). Extracto de levadura. URL:
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/y1625?lang=es®ion=MX
Zhanel G, Hisanaga T, Laing N. (2006). Determinan el índice de resistencia de Escherichia coli
frente a diversos antibióticos. Febrero 2019, de International Journal of Antimicrobial Agents.
Sitio web: http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/apua-cuba/r18-
determinan_el_indice_de_resistencia_de_escherichia_coli_frente_a_diversos_antibioticos.pdf
Brandao G.C., Bruns, R. E., da Silva, E.G.P., David, J.M., dos Reis, P.S., dos Santos, W.N.L.,
Ferreira H.S., Ferreira, S. L. C., Matos, J.M., Portugal, L.A. & Souza, A.S. (2007). Box-Behnken
desing: An alternative for the optimization of analytical methods. Acta 597, pp 179-186.
https://www.researchgate.net/publication/6155271_Box-
Behnken_design_An_alternative_for_the_optimization_of_analytical_methods
Fernandez, S. (2012). CONTRIBUCIÓN DE LA COLINA Y LA BETAÍNA AL METABOLISMO DE
LA HOMOCISTEÍNA DURANTE LA GESTACIÓN (Tesis doctoral) Universitat Rovira i Virgili.
Carrer Sant Llorenç.
Anexo