UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA

AGRICULTURA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

GENÉTICA

Nombre: Balseca Karol, Esparza Carlos, Quinga Joseph

NRC: 3223
Fecha de entrega: 18/06/18

INFORME DE LABORATORIO # 2

TEMA:
Extracción de ADN a partir de una muestra de sangre periférica
OBJETIVOS:
Objetivo general:
 Extraer DNA a partir de una muestra de sangre periférica humana .
Objetivos específicos:
 Aprender los fundamentos generales para la extracción del ADN a partir de
sangre humana.
 Obtener una muestra de sangre con anticoagulante de aproximadamente 10ml
 Lisar células sanguíneas (leucocitos) mediante tratamiento con una solución de
lisis.
 Obtener la medusa de ADN.
JUSTIFICACIÓN:

Se realizó esta práctica con el objetivo de aprender y aplicar el procedimiento adecuado

que conlleva la extracción de DNA de sangre periférica; al igual que la preparación y
funcionamiento de cada reactivo utilizado, tal como: EDTA, PBS, TLB, SDS y CIA. A
demás de la cuantificación del DNA extraído por la medición de la absorbancia.

Metodología

Se extrajo 10 ml de sangre con 250μl de EDTA (56mg/ml) en tubo de 50ml.

Se colocó TLB hasta completar 50ml. (Tris-HCL 10mM (ph 8.0), Tritón X-100 1% y
sacarosa 320 mM) después se puso 4°C durante 30 minutos y se invirtió la muestra 10
veces cada 0 minutos.
Se centrifugó a 3500 rpm, por 20 minutos a 4°C, a continuación se desechó el
sobrenadante por inversión y después se añadió 5 mL de PBS al pellet y se agitó.
A continuación se llevó a la centrifugadora a 3500 rpm, por 20minutos a 4° C, Se
colocó al pellet de células 3 mL de NLB y 230 μL de SDS al 10 %, después se lo llevó
al Vortex por 15 segundos, hasta que se disgregue el pellet y seguidamente se añadió
60 uL de proteinasa Ken seguida se incubó la muestra en el baño de maría a 55 °C por
1 hora, después se colocó 1200 μL de NaCl 5M y se lo llevó al Vortex por 15
segundos; nuevamente se centrifugó por 20 minutos a 3500 rpm a 15°C. Después de la
centrifugación se extrajo el sobrenadante a un tubo falcon cuidando no tocar el
precipitado.
Se añadió 5 mL de CIA y se llevó al vortex por 5 segundos. Se llevó a la centrifuga por
20 minutos a 3500 rpm a 15°C, en seguida se quitó el sobrenadante cuidando no tocar
la interfase y se depositó en un tubo falcon.
Se agregó igual cantidad de 2 propanol y se invirtió para favorecer la precipitación del
ADN en forma de medusa. Se pescó la medusa con ayuda de una punta azul y se colocó
el ADN a un tubo eppendorf limpio y estéril. Nuevamente se lo llevó a la centrifuga y
con ayuda de una punta amarilla se extrajo el resto de 2 propanol sin tocar el ADN,
después se puso 1 mL de alcohol al 70 % , se centrifugó a 3500 rpm a 14°C durante 10
min.
Finalmente se eliminó el sobrenadante por inversión, se dio un toque de centrífuga y
con ayuda de una punta amarilla se extrajo el resto de líquido sin tocar el ADN.

Resultados

Figura 1. Medusa de ADN. Por Karol Balseca

En figura 1 se puede observar la medusa que se obtiene después de agregar el 2
propanol y agitarlo
Discusión
Según Riera, Rojas, & Zapata, 2010. La extracción de DNA por Salting-out es uno de
los métodos mas eficientes para obtener de DNA de pequeños volumenes de sangre
puesto que la gran concentracion de sales permiten que se precipite la proteína u otros
contaminantes del ADN, lo que generaría que el DNA presente una mayor pureza,
ademas como menciona Komski, 2014. Para poder obtener la medusa de ADN se debe
inactivar las DNAsas por lo cual se utiliza PK-SDS o Proteinasa K-dodecil sulfato de
sodio, el SDS permitirá la activación de la PK que actuara inhibiendo a las DNAsas, si
no se usa este complejo no se podría obtener DNA puesto que se degradaría, posterior a
esto con el sobrenadante obtenido se precipita los ácidos nucleicos con etanol absoluto
lo que permite la formacion de la hebras de DNA (Sánchez , y otros, 2016).Esto se
logró observar al momento de añadir 2 propanol al sobrenadante obtenido como se
observa en la figura 1. En la cual se logra ver las hebras de DNA en forma de una
medusa, para corrobar lo citado de Riera, Rojas, & Zapata, 2010; Sánchez , y otros,
2016. Sobre la eficiencia de este método de extracción, se deberia realizar un analisis de
absorbancias estableciendo una relación 260/280 la cual permitiera conocer el nivel de
contaminación y la calidad de la misma, dado que hubo un incidente con la muestra
obtenida no se pudo realizar estos análisis, pero para poder decir que una muestra es
pura el coeficiente de las absorbancia debe encontrarse entre 1,7-2; en caso de que este
este sea menor a 1,7 indica la presencia de proteínas y si es mayor a 2 indica la
presencia de compuestos contaminantes como etanol (Jimenez , 2003).
Conclusiones
 Se extrajo el DNA, de una muestra de sangre periférica mostrando como
resultado la medusa del mismo.

 El tuvo con EDTA permitió recolectar aproximadamente 10ml de sangre y evitó

que esta coagulara.

 La solución TLB (sacarosa, tritón X100, Tris-HCl) realizó la lisis celular de los
leucocitos, pudiendo asi extraer el DNA de dichas células.

 Es indispensable conocer los elementos técnicos como los fundamentos del

protocolo de extracción de ADN proveniente de una muestra de sangre humana.

Bibliografía
Jimenez , E. A. (2003). Manual de neurogenetica. Madrid: Días de SAntos.
Komski, L. (30 de Enero de 2014). Métodos de extracción de ADN. Obtenido de
Fujifilm: http://www.wakolatinamerica.com/blog-reactivos/post/10-metodos-de-
extraccion-de-adn/
Riera, M., Rojas, M., & Zapata, P. (2010). Protocolo de extraccion de DNA por Salting-
out para pequeños volumentes de sangre. Rev.Cienc.Tecnol.
Sánchez , E., Calleros, E., Gonzáles , A., Rubio , J., Martinez, O., Hérnandez , S., &
Morales, R. (2016). Análisis comparativo de diferentes métodos de extracción
DNA y si eficiencia de genotipificación en pl. Mexico D.F: Universidad Juarez
de Durango.