Efectos de Karela (Melón amargo; Momordica charantia) en los genes del metabolismo de lípidos y carbohidratos en la

hipercolesterolemia experimental: estudio bioquímico, molecular e histopatológico.

Abstracto

Antecedentes: la hipercolesterolemia es una enfermedad grave asociada con diabetes tipo 2, aterosclerosis, trastornos
cardiovasculares y enfermedades hepáticas. Los seres humanos buscan medicamentos a base de hierbas seguros como
la karela (Momordica charantia / melón amargo) para tratar dichos trastornos a fin de evitar los efectos secundarios de
las farmacoterapias ampliamente utilizadas.

Métodos: Cuarenta ratas Wistar machos se dividieron en cuatro grupos iguales; grupo de control con acceso libre a
alimentos y agua, grupo administrado de colesterol (40 mg / kg de BW por vía oral); grupo administrado por karela (5 g /
kg peso corporal por vía oral) y mezcla de colesterol y karela. Los tratamientos continuaron durante 10 semanas. Karela
se administró a ratas hipercolesterolémicas después de 6 semanas de administración de colesterol. Se tomaron tejidos
adiposos de suero, hígado y epidídimo para realizar evaluaciones bioquímicas, histopatológicas y genéticas.

Resultados: La hipercolesterolemia indujo una disminución en la superóxido dismutasa (SOD) sérica, catalasa, glutatión
reducido (GSH) y un aumento en los niveles de malondialdehído (MDA) que se mejoraron con la administración de
karela. La hipercolesterolemia regula la expresión de ARNm de los antioxidantes y altera la expresión de los genes del
metabolismo de los carbohidratos. Paralelamente, los grupos hipercolesterolémicos mostraron cambios significativos en
la expresión de PPAR-alfa y gamma, lipólisis, lipogénesis y metabolismo del colesterol como la carnitina
palmitoiltransferasa-1 (CPT-1). Acil CoA oxidasa (ACO), ácidos grasos sintasa (FAS), elemento responsable del esterol
vinculante de la proteína-1c (SREBP1c), 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMG-CoAR) y colesterol 7α-
hidroxilasa (CYP7A1) en el hígado y niveles de tejido adiposo. Curiosamente, Karela mejoró todos los genes alterados
que confirmaban su efecto hipocolesterolémico. Los hallazgos histopatológicos e inmunohistoquímicos revelaron que la
hipercolesterolemia indujo cambios en el tejido hepático en comparación con el control. Estos cambios incluyen
hendiduras de colesterol, necrosis, cariólisis y cortar la congestión del vaso sanguíneo portal. La inmunorreactividad de
caspasa-3 mostró expresión positiva en células hepáticas de ratas hipercolesterolémicas en comparación con el control.
Todos fueron contrarrestados y normalizados después de la administración de Karela al grupo hipercolesterolémico.

Conclusión: los hallazgos actuales confirmaron que karela es un suplemento potencial útil en el tratamiento de la
hipercolesterolemia y sus trastornos asociados y es bueno para la salud humana.

Palabras clave: Hidratos de carbono, expresión génica, hipercolesterolemia Karela, lípidos

Fondo

El síndrome metabólico se ha convertido en las enfermedades epidémicas más frecuentes a nivel mundial en las últimas
décadas. Una reciente encuesta nacional de salud realizada en China continental reveló que 60 millones de personas son
obesas y 200 millones tienen sobrepeso [1]. Como es sabido, el hígado es el tejido funcional que controla la producción
de triglicéridos (TG) y glucosa para el uso de otros tejidos, todos regulados por lipogénesis y gluconeogénesis [2]. Los
estudios han demostrado que la acumulación excesiva de lípidos en el hígado está asociada con el estrés oxidativo y la
disfunción mitocondrial hepática [3, 4]. La dieta alta en grasas indujo la sobreproducción de especies reactivas de
oxígeno en el tejido adiposo y el hígado [5].
La obesidad, la hipertrigliceridemia y / o la hipercolesterolemia son las causas comunes de muchas enfermedades, como
la cardiovascular [6] y la hepática [7]. La rata alimentada con una dieta rica en colesterol puede usarse como modelo del
síndrome de obesidad humana [8]. El hígado es el primer órgano en metabolizar el colesterol ingerido y se ve afectado
por el estrés oxidativo que resulta de un desequilibrio entre la producción de radicales libres y la efectividad de los
sistemas antioxidantes [9]. Las ratas alimentadas con una dieta rica en colesterol mostraron varias anomalías en las
secciones del hígado, como hendiduras de colesterol, hepatotoxicidad e hígado graso [10, 11].

La hipercolesterolemia, la hipertensión, los trastornos del metabolismo de la glucosa, el tabaquismo, el envejecimiento y

el estrés social son los principales factores de riesgo de enfermedades cardiovasculares [12]. Los estudios realizados
demostraron que la incidencia de eventos cardiovasculares aumentaba con el aumento de los niveles séricos de
colesterol [13]. Por lo tanto, la normalización de los niveles de colesterol sérico es importante para prevenir las
enfermedades cardiovasculares y sus trastornos asociados y la alteración en los lípidos y el metabolismo de los hidratos
de carbono. La disminución de los niveles de lípidos en suero a través de la dieta o la terapia con medicamentos parece
estar asociada con una disminución en el riesgo de enfermedad vascular y complicaciones relacionadas [14, 15].

Karela, cuyo fruto se conoce como Momordica charantia, calabaza amarga o melón amargo, es una verdura común
comestible en Asia. Aproximadamente el 93.2% de karela es agua, y las proteínas y los lípidos representan el 18.02% y el
0.76% de su peso seco, respectivamente [16]. Se han reportado beneficios fisiológicos, que incluyen hipoglucemia,
hipolipidemia, antivirus y efectos anticancerígenos [17, 18]. Se ha demostrado que karela redujo la obesidad inducida
por la dieta alta en grasas, la hiperlipidemia, la hiperglucemia, la resistencia a la insulina y el hígado graso en ratones
[19]. Karela se ha utilizado para el tratamiento de la diabetes en todo el mundo [20, 21].

El efecto hipoglicémico de Karela se ha demostrado en roedores diabéticos tipo 1 y tipo 2 [22, 23]. Además, disminuye
los niveles de colesterol total (TC), triglicéridos y fosfolípidos en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina [24]. Los
estudios fitoquímicos revelaron la presencia de alcaloides, flavonoides, esteroles, antraquinonas y fenoles, que
representaban los principales componentes activos de las hojas de karela [25]. Se ha encontrado que el extracto de
acetona de etilo de karela activa PPARα y PPAR γ[26] que son factores de transcripción activados por ligando que
anhelan la superfamilia del receptor nuclear. Desempeñan un papel clave en el control de la homeostasis de lípidos y
glucosa como factores transcripcionales que regulan genes que codifican enzimas implicadas en estos procesos [27].Este
estudio tuvo como objetivo examinar el efecto de karela en la hipercolesterolemia experimental a nivel bioquímico,
molecular y celular utilizando análisis de PCR semicuantitativo e inmunohistoquímica.

Métodos

Materiales y kits

El bromuro de etidio y la agarosa se adquirieron en Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Las ratas Wistar albino se
compraron en el Centro Rey Fahd de Investigación Científica, Universidad Rey Abdel-Aziz, Jeddah, Arabia Saudita. Kits
serológicos para HDLC, colesterol y triglicéridos (TG) HUMAN Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbH
(Wiesbaden, Alemania). La escalera de ácido desoxirribonucleico (ADN) se adquirió de MBI, Fermentas, Thermo Fisher
Scientific, EE. UU. Qiazol para la extracción de ARN y el cebador oligo dT se compraron en QIAGEN (Valencia, CA, EE.
UU.). Los kits para antioxidantes tales como superóxido dismutasa (SOD), catalasa, glutathi-one (GSH) reducido y
malondialdehído (MDA) se compraron de Bio-diagnostic Co., Dokki, Giza, Egipto.

Animales y diseño experimental

La Oficina del Comité Ético de Decanos científicos de la Universidad de Taif, Arabia Saudita, aprobó todos los
procedimientos de este estudio para el proyecto # 4860-437-1. Cuarenta ratas Wistar machos, 2 meses de edad (200-
222 g) se utilizaron para este estudio. Los animales se mantuvieron en observación durante 2 semanas para asegurar la
aclimatación completa antes del inicio del experimento. Los animales se mantuvieron en el mismo ciclo de luz y
oscuridad (12/12 h) con acceso libre a comida y agua. Cuatro grupos que contenían 10 ratas Wistar sanas se usaron para
el estudio de la siguiente manera: el grupo 1 sirvió como control negativo con acceso libre a comida y agua. El grupo 2
sirvió como grupo hipercolesterolémico positivo y recibió colesterol oral en una dosis de 40 mg / kg de peso corporal por
día durante 6 semanas. Al grupo 3 se le administró Karela o aliado en una dosis de 5 g / kg de peso corporal al día en
base a un estudio previo [28]. El grupo 4 administró por vía oral colesterol en una dosis de 40 mg / kg de peso corporal
por día durante 10 semanas más karela en una dosis de 5 g / kg de peso corporal al día en la semana 6 y continuó
durante 4 semanas más tarde. La dosis de colesterol se usó en base al hallazgo de Co y To [29]. Después de 10 semanas,
las ratas se inhalaron con dimetil éter y se decapitaron después de ayunar durante la noche. Hígado y adiposo se
conservaron los tejidos en solución de Bouin para el examen histopatológico y en el reactivo de Qiazol para la extracción
de ARN para la expresión génica.

Preparación y administración de Karela

Las frutas frescas de karela (melón amargo) se compraron en mercados locales comerciales en el gobierno de Taif
(Panda, Taif), Arabia Saudita. Las frutas de la planta fueron identificadas por un botánico en la Facultad de Ciencias de la
Universidad de Taif, Arabia Saudita. Karela se lavó minuciosamente con agua y se secó después de cortar en trozos
pequeños, se secó y se pulverizó utilizando una licuadora. La dosis utilizada fue de 5 g / kg peso corporal por tubo
intragástrico en base a informes anteriores [28].

Ensayo de parámetros bioquímicos

La glucosa se midió colorimétricamente usando kits comerciales disponibles. Los antioxidantes como la superóxido
dismutasa, SOD, GSH, MDA y catalasa se midieron espectrofotométricamente utilizando kits ELISA comerciales basados
en el manual de instrucciones del fabricante. Triacilglicerol sérico, colesterol total y colesterol de lipoproteínas de alta
densidad (HDLC) se midieron espectrofotométricamente de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Examen histopatológico e inmunohistoquímico

Las muestras recogidas de hígado se fijaron en solución de formalina neutra tamponada al 10% y luego se sometieron a
un proceso rutinario. Se prepararon secciones de parafina de 5 μm de espesor, teñidas con tinción con hematoxilina y
eosina (H & E) como se describió anteriormente [30]. Al utilizar el método de avidina-biotina-peroxidasa, las muestras de
hígado se incrustaron en parafina y se cortaron en secciones de 3 μm. Las muestras se montaron en portaobjetos
cargados positivamente para el examen inmunohistoquímico de la caspasa 3. Las secciones se desparafinaron, se
rehundieron y se sometieron a autoclave a 95 ° C durante 20 min en antígeno tampón de recuperación (tampón de
citrato 10 mM, pH 6). Después de lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS), la peroxidasa endógena se
bloqueó usando H2O2 al 3% en metanol durante 15 minutos. Un anticuerpo primario específico de rata para la caspasa
3 (n.º de catálogo RB 1197 B0, B1; Thermo Fisher Scientific Inc.) se diluyó en PBS (1: 100) y se incubó durante 30
minutos. Los portaobjetos se enjuagaron tres veces con PBS. Se incubó anticuerpo secundario IgG de cabra conjugado
con peroxidasa de rábano picante (Cat. 32230; Thermo Fisher Scien-tific Inc.) durante 30 min con secciones de tejido. Se
realizó un enjuague adicional por 3 veces con PBS. Las muestras se visualizaron después de 10 minutos de la adición de
metal mejorado diaminobenzidine (DAB) sustrato (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) como una solución de trabajo
(Thermo Fisher Scientific Inc.) como se indicó antes [31]. La puntuación de la actividad inmune se utilizó para evaluar la
intensidad de la tinción inmunohistoquímica y la proporción de las células teñidas [31].

Extracción de RNA, síntesis de cDNA y análisis de RT-PCR

El ARN total se extrajo de muestras de tejido adi-pose de hígado y epidídimo (50 mg por muestra) como se indicó
anteriormente [32]. En resumen, las muestras se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y posteriormente
se almacenaron a -70 ° C en 1 ml de Qiazol (QIAGEN, Valencia, CA, EE. UU.). Las muestras congeladas se homogeneizaron
usando un homogeneizador Polytron 300 D (Brinkman Instruments, Westbury, NY, EE. UU.). Luego, se añadieron 0.3 ml
de cloroformo al homogeneizado. Las mezclas después de agitar durante 30 s, se centrifugan a 4 ° C y 16,400 x g durante
15 min. El sobrenadante se transfirió a tubos nuevos. Se añadió un volumen igual de isopropanol a las muestras y se
centrifugó a 4 ° C y 16.400 x g durante 15 minutos. Los sedimentos de ARN se lavaron con etanol al 70%, se secaron
brevemente y luego se disolvieron en agua de dietilpirocarbo- nato (DEPC). La concentración de ARN y la pureza se
determinaron espectrofotométricamente a 260 nm. La integridad del ARN se confirmó en gel de agarosa
desnaturalizado al 1,5% teñido con bromuro de etidio.
Table 1 PCR conditions and primer sequence for examined genes

mRNA expression Forward primer (5′-3′) Reverse primer (5′-3′) PCR cycles and Annealing

PEPCK (236 bp) TTTACTGGGAAGGCATCGAT TCGTAGACAAGGGGGCAC 30 cycles, 52 °C 1 min

PK (229 bp) ATTGCTGTGACTGGATCTGC CCCGCATGATGTTGGTATAG 30 cycles, 52 °C 1 min

ACO (633 bp) GCCCTCAGCTATGGTATTAC AGGAACTGCTCTCACAATGC 35 cycles, 52 °C 1 min

CPT-1 (628 bp) TATGTGAGGATGCTGCTTCC CTCGGAGAGCTAAGCTTGTC 35 cycles, 52 °C 1 min

PPAR γ (550 bp) CATTTCTGCTCCACACTATGAA CGGGAAGGACTTTATGTATGAG 33 cycles 52 °C 1 min

PPAR-α (680 bp) GAGGTCCGATTCTTCCACTG ATCCCTGCTCTCCTGTATGG 35 cycles, 58 °C 1 min

FAS (345 bp) CCAGAGCCCAGACAGAGAAG GACGCCAGTGTTCGTTCC 37 cycles, 61 °C 45 s

SREBP-1c (191 bp) GGAGCCATGGATTGCACATT AGGAAGGCTTCCAGAGAGGA 35 cycles, 58 °C 50 s

HMG-CoAR (467 bp) CCTGCTGCCATAAACTGGAT GCCATTACAGTGCCACACAC 31 cyc les58°C 1 min

GST (575 bp) GCTGGAGTGGAGTTTGAAGAA GTCCTGACCACGTCAACATAG 35 cycles, 55 °C 1 min

CYP7A1 (574 bp) CCTCCTGGCCTTCCTAAATC GTACCGGCAGGTCATTCAGT 30 cycles 58 °C 1 min

SOD (410 bp) AGGATTAACTGAAGGCGAGCAT TCTACAGTTAGCAGGCCAGCAG 33 cycles, 55 °C 1 min

GAPDH (309 bp) AGATCCACAACGGATACATT TCCCTCAAGATTGTCAGCAA 25 cycles, 52 °C 1 min

Table 2 Protective effects of Karela on hypercholesterolemia induced changes in serum lipid levels in Wistar rats
HDLC (mg/dL) Cholesterol (mg/dL) TG (mg/dL) Glucose (mg/dL)

Control 30.8 ± 0.6 63.3 ± 4.1 30.5 ± 4.2 84.5 ± 2.3

Cholesterol 19.4 ± 0.7* 180.5 ± 6.6* 99.8 ± 7.4* 89 ± 10.2*

Karela 34.5 ± 0.9 54.5 ± 2.25 30.6 ± 1.78 76 ± 8.7

Karela + Cholesterol 38.32 ± 2.4# 81.2 ± 7.5# 55.3 ± 5.5# 69 ± 13.1#

La relación de la densidad óptica 260/280 de todas las muestras de ARN fue 1.7-1.9. Para la síntesis de ADNc, se incubó
una mezcla de 3 μg de ARN total y 0,5 ng de cebador Oligo dT (Qiagen Valencia, CA, EE. UU.) En un volumen total de 11
μl de agua DEPC esterilizada en el ciclo térmico Bio-Rad T100 ™ a 65 ° C durante 10 minutos para la desnaturalización.
Luego, se añadieron 2 μl de 10X RT-buffer, 2 μl de 10 mM dNTPs y 100 U de Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV)
Reverse Transcriptase (SibEnzyme, Ak, Novosibirsk, Rusia) y el volumen total se completó hasta 20 μl por agua DEPC. La
mezcla se volvió a incubar en el termociclador BIO-RAD a 37 ° C durante una hora, luego a 90 ° C durante 10 minutos
para inactivar la enzima. Para el análisis semicuantitativo de RT-PCR, se diseñaron cebadores específicos para los genes
examinados (Tabla 1) utilizando el programa informático Oligo-4 y el tamaño del sintetizador de Macrogen (Macrogen
Company, GAsa-dong, Geumcheon-gu. Corea). La PCR se realizó en un volumen final de 25 μl que consiste en 1 μl de
ADNc, 1 μl de 10 μM de cada cebador (directo e inverso) y 12, 5 μl de mezcla maestra de PCR (Promega Corporation,
Madison, WI, EE. UU.), El volumen fue trajo hasta 25 l con agua desionizada esterilizada. La PCR se llevó a cabo
utilizando la máquina de ciclo térmico Bio-Rad T100 ™ con la secuencia de ciclo a 94 ° C durante 5 min un ciclo, seguido
de ciclos variables (Tabla 1), cada uno de los cuales consta de desnaturalización a 94 ° C durante un minuto, recocido a la
temperatura específica correspondiente a cada cebador (Tabla 1) y extensión a 72 ° C durante un minuto con una
extensión final adicional a 72 ° C durante 7 min. Como referencia, se examinó la expresión del ARNm de gliceraldehído-
3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) (Tabla 1). Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en Gel de agarosa al
1,5% (Bio Basic, Markham, ON, Canadá) teñido con bromuro de etidio en tampón TBE (Tris-Borato-EDTA). Los productos
de PCR se visualizaron bajo luz ultravioleta y se fotografiaron usando un sistema de documentación en gel. Las
intensidades de las bandas de cuatro ratas diferentes por grupo y tres experimentos independientes se cuantificaron
densitométricamente utilizando el software Image J versión 1.47 (https://imagej.en.softonic.com/).

análisis estadístico

Los datos se expresan como Medios ± error estándar (SE). Los datos se analizaron usando análisis de varianza (ANOVA) y
pruebas descriptivas post hoc por SPSS software versión 11.5 para Windows (SPSS, IBM, Chicago, IL, EE. UU.) Con P <0,05
considerado como estadísticamente significativo. El análisis de regresión se realizó usando el mismo software.

Resultados

Efectos de karela en cambios en antioxidantes inducidos por hipercolesterolemia

La Tabla 2 muestra que la hipercolesterolemia experimental se asoció con un aumento en los niveles séricos totales de
colesterol, triglicéridos y glucosa. En paralelo, hubo una disminución en las lipoproteínas de alta densidad (HDL). La
administración de Karela normalizó y mejoró estos parámetros alterados y aumentó los niveles de HDL (Tabla 2). La
hipercolesterolemia como se ve en la Tabla 3, aumentó significativamente los niveles séricos de malondialdehído (MDA)
y disminuyó los niveles séricos de superóxido dismutasa (SOD), glutatión reducido (GSH) y catalasa. La administración de
karela mejoró significativamente la disminución de la actividad antioxidante y normalizó el aumento de MDA (Tabla 3).
Es de destacar que la administración de karela para controlar ratas indujo una alta potencia antioxidante.
Table 3 Protective effects of Karela extract on hypercholesterolemia induced changes in antioxidants levels in Wistar rats

SOD (U/ml) Catalase (U/ml) GSH (mg/dl) MDA (nmol/ml)

Control 347.9 ± 37.5 32.5 ± 4.4 0.4 ± 0.01 5.17 ± 0.3

* * *
Cholesterol 202.7 ± 25.4 20.23 ± 2.8 0.2 ± 0.02 37 ± 4. 2*

$ $
Karela 566.3 ± 28.1 31.80 ± 8.3 0.8 ± 0.02 4. 6 ± 0.01
# #
Karela + Cholesterol 286.7 ± 44.2 66.5 ± 7.2 h1.7 ± 0.07# 16.7 ± 1.02
#

Cambios patológicos e inmunohistoquímicos en el hígado después de la administración de karela a ratas

hipercolesterolémicas

El examen histológico del hígado en control y las ratas administradas con karela tenían una arquitectura normal de
lóbulos hepáticos con placas de hepatocitos poligonales dispuestas radialmente alrededor de la vena central y separadas
por sinusoides sanguíneos, los hepatocitos revelaron un citoplasma acido-fílico y núcleos redondeados (Fig. 1a). , b). En
ratas hipercolesterolémicas se observó pérdida de la arquitectura hepática normal con depósito de cristales de
colesterol en muchos quistes radiculares que forman hendiduras de colesterol y necrosis de hepatocitos (Fig. 1c).
Además, cortar la congestión del vaso sanguíneo portal con un amplio portal
Fig. 1 Fotomicrografía de hígados de rata en los diversos grupos: un grupo control, que muestra la estructura
histológica normal del lóbulo hepático (L) con núcleo eucromático central de hepatocito (H) envolvente vena central
(CV) (H & E; barra, 89 μm ); b Grupo administrado por Karela, muestra estructura histológica normal del lóbulo
hepático (L), hepatocito (H) y vena central (CV) (H & E; barra, 14 μm); c Grupo de colesterol, que muestra la
deposición de cristales de colesterol en muchos quistes radiculares que forman hendiduras de colesterol (flechas) y
necrosis (N) de hepatocitos (H & E; barra, 14 μm); d Grupo administrado con colesterol, que muestra la congestión
severa del vaso sanguíneo portal (C) con fibrosis portal extensa (flecha) e hiperplasia del revestimiento epitelial del
conducto biliar (B) (H y E; barra, 89 μm); e Grupo de colesterol, que muestra necrosis en hepatocitos (N) con cariólisis
de núcleos de hepatocitos (flechas) (H y E; barra, 14 μm); y f Colesterol y grupo Karela, muestran parénquima
hepático normal aparente con pocas hendiduras de colesterol (flecha), lóbulo hepático (L), hepatocito (H), vena
central (CV) (H & E; barra, 14 μm)

fibrosis, hiperplasia del revestimiento epitelial del conducto biliar y la cariólisis de los núcleos de los hepatocitos (Fig. 1d,
e). En el hígado de ratas hipercolesterolémicas a las que se administró karela, el hígado mostró un parénquima hepático
normal aparente con pocas hendiduras de colesterol (Fig. 1f). En examen inmunohistoquímico para la expresión de
caspasa-3 en el hígado. El control y las ratas administradas con karela mostraron tinción inmunohistoquímica negativa
para la inmunorreactividad de caspasa-3 (figura 2a, b). El hígado de ratas hipercolesterolémicas mostró una fuerte
tinción inmunohistoquímica de la caspasa 3 (Fig. 2c). El hígado de ratas hipercolesterolémicas a las que se administró
karela mostró una tinción inmunohistoquímica leve de Caspase-3 (Fig. 2d).

Efectos de karela en la expresión génica de antioxidantes y genes asociados a carbohidratos alterados por
hipercolesterolemia
La figura 3 muestra que la hipercolesterolemia disminuyó significativamente la glutatión-S-transferasa (GST) y la
superóxido expresión de mRNA de dismutasa en hígado. La administración de karela para ratas administradas con
colesterol normalizó el patrón de expresión de ARNm en comparación con las ratas de control. Por otro lado, la
hipercolesterolemia disminuyó la expresión de mRNA de piruvato quinasa (PK) que se mejoraron cuando se administró
conjuntamente karela para ratas hipercolesterolémicas (Fig. 4). Por el contrario, karela regulado fosfoenolpiruvato car-
boxykinase (PEPCK) que se upregulated en hypercholes-terolemic ratas (Fig. 4]. La administración concomitante de
karela con colesterol mejoró este aumento en la expresión de PEPCK en ratas hipercolesterolémicas.

Efectos de la karela sobre la lipólisis y la expresión del gen de la lipogénesis alterada por la hipercolesterolemia

Para examinar la expresión de genes para la oxidación de ácidos grasos, tales como acil CoA oxidasa (ACO) y carnitina
palmitoiltransferasa-1 (CPT-1), se llevó a cabo RT-PCR en tejidos hepáticos. La figura 5 muestra que la karela sola
aumentó parcialmente la expresión de ARNm de ACO y CPT-1, mientras que las ratas administradas con colesterol
mostraron una regulación negativa en su expresión de ARNm. Cuando karela se coadministra con colesterol mejoró esta
regulación a la baja. En paralelo, la enzima esencial para la síntesis de ácidos grasos (ácidos grasos syn-thase; FAS)
mostró una disminución en las ratas administradas con karela y reguladas positivamente en ratas hipercolesterolémicas.
Se downregulated cuando karela coadministrado con colesterol (Fig. 5). A continuación, examinamos la expresión de
PPAR-α y PPAR-γ en el hígado y el tejido adiposo, respectivamente, como un regulador transcripcional del metabolismo
de los lípidos y la homeostasis de la glucosa. Como se ve en la Fig. 6, Karela activó la expresión de PPAR-α y PPAR-γ en
hígado y tejido adiposo, respectivamente, que se regularon negativamente de forma significativa en grupos
hipercolesterolémicos.

Fig. 2 Fotomicrografía de tinción inmunohistoquímica de Caspasa 3 en hígado de rata en grupos examinados: un grupo
control, que muestra tinción inmunohistoquímica negativa de la inmunorreactividad de caspasa 3 (bar, 14,53 μm); b
Ratas administradas por Karela, que muestran tinción inmunohistoquímica negativa de caspasa 3 (bar, 14.51 μm); c
Grupo administrado colesterol, que muestra fuerte tinción inmunohistoquímica y reactividad inmune de Caspase 3
(barra, 13.57 μm); d Grupo de tratamiento con colesterol y Karella, que muestra tinción inmunohistoquímica leve de
caspasa 3 (bar, 13,56 μm).
Fig. 3 Efecto protector de karela sobre los cambios en la expresión de antioxidantes inducida por hipercolesterolemia en
el hígado. A las ratas hipercolesterolémicas se les administró karela durante 4 semanas consecutivas. El ARN total se
extrajo de tejidos hepáticos y las expresiones de GST y SOD se analizaron mediante análisis de RT-PCR semicuantitativa.
Los valores son medias ± SE de 10 ratas. * Grupo de control P <0.05 Vs; # P <0.05 VS grupo hipercolesterolémico. Los
paneles superiores (a) son expresión de ARNm de genes examinados. Las columnas inferiores (b) son análisis
densitométrico de la expresión génica de los paneles superiores.

Los efectos de karela en los genes regulan la expresión del metabolismo del colesterol

Finalmente, examinamos el efecto de karela en los genes asociados con el metabolismo del colesterol, como la proteína
de unión responsable del elemento esterol-1c (SREBP-1c), la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMG-CoAR)
y el colesterol 7α- hidroxilasa (CYP7A1). Karela solo mostró regulación a la baja en SREBP-1c y la expresión de HMG-
CoAR que estaban reguladas positivamente en ratas administradas por colesterol y ad-ministradas (Fig. 7). La
administración de karela a ratas hipercolesterolémicas normalizó significativamente este aumento en la expresión de
ARNm de SREBP-1c y HMG-CoAR. Con respecto a la expresión de CYP7A1, Karela mostró un aumento parcial en CYP7A1
y la alimentación con solo colesterol inducía un efecto estimulante más claro en el ARNm de CYP7A1 en comparación
con karela. Cuando se administró karela a ratas hipercolesterolémicas, se informó un efecto de regulación positiva
aditiva (figura 7).
Fig. 4 Efecto protector de karela sobre los cambios en la expresión de PK y PEPCK inducida por hipercolesterolemia en el
hígado. A las ratas hipercolesterolémicas se les administró karela durante 4 semanas consecutivas. El ARN total se
extrajo de los tejidos del hígado y las expresiones de PK y PEPCK se analizaron mediante análisis semicuantitativo de RT-
PCR. Los valores son medias ± SE de 10 ratas. * Grupo de control P <0.05 Vs; # P <0.05 VS grupo hipercolesterolémico.
Los paneles superiores (a) son expresión de ARNm de genes examinados. Las columnas inferiores (b) son análisis
densitométrico de la expresión génica de los paneles superiores.

Discusión

El presente estudio interpreta que karela tiene un efecto hipocolesterolémico a través de la reducción del estrés
oxidativo hepático y la apoptosis, la regulación de los genes asociados con el metabolismo de la glucosa, los lípidos y el
colesterol a niveles bioquímicos, celulares y moleculares. La hipercolesterolemia mostró afección hepática que se
presentó por apoptosis. En las enfermedades del hígado, la reparación celular, la inflamación, la regeneración y la
fibrosis pueden ser desencadenado por la apoptosis [33]. El hígado es el primer órgano en metabolizar el colesterol
ingerido y se ve afectado por el estrés oxidativo que resulta de un desequilibrio entre la producción de radicales libres y
la efectividad de los sistemas de defensa antioxidante [9]. Los datos actuales revelaron que las ratas alimentadas con
una dieta rica en colesterol tenían anomalías en las secciones del hígado, como hendiduras de colesterol, necrosis de los
hepatocitos y congestión del vaso sanguíneo portal. Informes anteriores mostraron que la dieta alta en colesterol causa
hepatotoxicidad e hígado graso [10, 11] y un aumento en el número de hepatocitos apoptóticos [34]. Los posibles
mecanismos para los efectos beneficiosos de karela en el hígado graso implica reducir la inflamación, eliminar el estrés
oxidativo y suprimir la apoptosis como se confirma aquí y en otro estudio [19].

Fig. 5 Efecto protector de karela sobre los cambios en la expresión de CPT-1, ACO y FAS inducida por hipercolesterolemia
en el hígado y el tejido adiposo. A las ratas hipercolesterolémicas se les administró karela durante 4 semanas
consecutivas. El ARN total se extrajo de tejidos hepáticos y las expresiones de CPT-1, ACO y FAS se analizaron mediante
análisis de RT-PCR semicuantitativa. Los valores son medias ± SE de 10 ratas. * Grupo de control P <0.05 Vs; # P <0.05 VS
grupo hipercolesterolémico. Los paneles superiores (a) son expresión de ARNm de genes examinados. Las columnas más
bajas (b) son análisis densitométrico de expresiones génicas para paneles superiores.

Como se conoce, Chen y su equipo [35] son los primeros que confirmaron el efecto anti-adiposidad de karela, que
posteriormente mostró una disminución del contenido de triglicéridos de las células y los músculos hepáticos en ratas
alimentadas con una dieta alta en grasas que contiene jugo de melón amargo liofilizado. [36]. Recientemente, se ha
reconocido que el tejido adiposo sirve como un almacenamiento de energía y un órgano endocrino al liberar adipocinas
en la circulación para regular tanto la masa de tejido adiposo como las funciones de otros tejidos al afectar el
metabolismo sistémico de lípidos y glucosa [37]. Se confirmó el efecto antiobesidad del melón amargo [38]. Aquí, la
hipercolesterolemia causó estrés oxidativo y disminuyó los niveles de antioxidantes y la expresión en el hígado, y la
karela mejoró estas alteraciones. En paralelo, Wu y Ng [39] encontraron que los extractos de calabaza amarga cultivada
en Taiwán, poseía mayores actividades antioxidantes y de eliminación de radicales libres. Como la gluconeogénesis
hepática conocida constituye aproximadamente 60-97% de la producción de glucosa hepática. PEPCK es una enzima
limitante de la velocidad clave de la gluconeogénesis. El alto consumo de grasas en la dieta puede regular al alza la
expresión de PEPCK en ratones [40]. En nuestro presente estudio, la expresión de PEPCK aumentó en ratas
hipercolesterolémicas. La administración de karela restableció la expresión de PEPCK a un nivel similar al grupo de
control. Por lo tanto, la karela indujo un efecto hipoglucemiante en ratas hipercolesterolémicas mediante la inhibición
de la producción de glucosa hepática a través de una disminución en la expresión de PEPCK y sin efecto sobre el ARNm
de PK (figura 4). Posiblemente, el efecto hipoglucemiante de karela se deba a la inhibición de la actividad de la glucosa-
6-fosfatasa [41].

Fig. 6 Efecto protector de karela sobre los cambios en la expresión de PPAR-α y PPAR-γ inducida por hipercolesterolemia
en el hígado y el tejido adiposo. A las ratas hipercolesterolemicas se les administró karela durante 4 semanas
consecutivas. El ARN total se extrajo de tejidos hepáticos y las expresiones PPAR-α y PPAR-γ se analizaron mediante
análisis de RT-PCR semicuantitativo. Los valores son medias ± SE de 10 ratas. * Grupo de control P <0.05 Vs; # P <0.05 VS
grupo hipercolesterolémico. Los paneles superiores (a) son expresión de ARNm de genes examinados. Las columnas
inferiores (b) son análisis densitométrico de la expresión génica de los paneles superiores.

Nerurkar y sus colegas [42] informaron in vitro que la karela inhibía la diferenciación de preadipocitos humanos a través
de la regulación a la baja en PPAR-γ, SREBP-1c, resistina y regulación positiva en la lipólisis. Entre los factores que
afectan a la lipogénesis se encuentran el receptor-activador del proliferador de peroxisoma (PPAR-γ) y SREBP-1c. PPAR-γ
es el principal regulador de la adipogénesis [43], mientras que SREBP-1c es un factor de transcripción adipogénico [44].
El equilibrio entre la adipogénesis y la lipólisis es crítico para la función adecuada del tejido adiposo, que afecta
consecutivamente la patogénesis de la obesidad y sus funciones metabólicas asociadas (42). Para tratar la obesidad,
necesita intervenciones múltiples como programas de ejercicio, dieta, modificación del comportamiento y
farmacoterapia. Karela mostró resultados claros en el metabolismo de los lípidos a través de la regulación de las enzimas
clave esenciales para la lipogénesis y la lipólisis. Se downregulated la expresión de FAS y aumentó la expresión de ACO y
CPT-1. Nuestros hallazgos que karela suprimieron la expresión del gen FAS y SREBP1c postulan que la karela podría
antagonizar la actividad transcripcional de factores lipogénicos como ADD1 / SREBP-1c [44]. SREBP1c es un regulador de
la homeostasis lipídica, la lipogénesis y la biosíntesis de esteroles. En nuestros resultados, SREBP1c disminuyó por karela
y aumentó en ratas hipercolesterolémicas y se normalizó cuando se coadministraron juntas. Sin embargo, Huang et al.
[45], no observó ningún efecto sobre la expresión de ARNm de SREBP-1c en el tejido adiposo de ratas alimentadas con
dieta rica en grasas y karela. Sugirieron que karela posiblemente actúe en los niveles de proteína o post-
transcripcionalmente para afectar estos genes [45].

Fig. 7 Efecto protector de karela sobre los cambios en la expresión de SREBP1c, HMG-CoAR y CYP7A1 inducida por
hipercolesterolemia en el hígado. A las ratas hipercolesterolémicas se les administró karela durante 4 semanas
consecutivas. El ARN total se extrajo de tejidos hepáticos y las expresiones de SREBP1c, HMG-CoAR y CYP7A1 se
analizaron mediante análisis de RT-PCR semicuantitativa. Los valores son medias ± SE de 10 ratas. * Grupo de control P
<0.05 Vs;
# P <0.05 VS grupo karela y $ P <0.05 V grupo hipercolesterolémico. Los paneles superiores (a) son expresión de ARNm
de genes examinados. Las columnas inferiores (b) son análisis densitométrico de la expresión génica de los paneles
superiores.

La homeostasis del colesterol se logra a través de la regulación de la biosíntesis del colesterol, la conversión de col-
esterol en ácidos biliares y su excreción. La homeostasis del colesterol está regulada por HMG-CoAR y CYP7A1 [46].
HMG-CoAR es la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de colesterol, mientras que CYP7A1 es la enzima
limitante de la velocidad en la síntesis de ácidos biliares del col-esterol a través de la vía clásica [47] Además, CYP7A1
está parcialmente regulado a nivel transcripcional por el hígado hepático X receptor-α (LXRα) y receptor farnesoide X
[48, 49]. LXRα es un factor de transcripción activado por las formas oxidadas del colesterol, que actúa como sensor de la
acumulación excesiva de colesterol intracelular [48]. El receptor Farnesoid X es un receptor de ácido biliar y actúa como
el principal sensor de ácido biliar hepático que regula la síntesis y el transporte de ácidos biliares. Además, más del 95%
de los ácidos biliares se reabsorbe en el íleon distal y se transporta al hígado al cuerpo. Por lo tanto, los LXRα y FXR
hepáticos juegan un papel importante en la regulación de la homeostasis del colesterol a través de la modulación de la
biosíntesis de los ácidos biliares. En comparación con las ratas hipercolesterolémicas, informamos que el grupo Karela
aumentó la expresión del gen CYP7A1 (Fig. 7) y disminuyó el nivel sérico de TC (Tabla 2). Estos resultados sugieren que
karela ejerce su actividad hipocolesterolémica al disminuir la reabsorción de ácidos biliares en el intestino y facilitando la
conversión de colesterol a ácidos biliares a través de la regulación positiva de CYP7A1 [28]. Por otra parte, Matsui et al.

Saad et al. BMC Medicina complementaria y alternativa (2017) 17: 319 [28] concluyeron que la regulación al alza en
CYP7A1 en grupos administrados con karela es independiente de la expresión de LXR-α en tejidos hepáticos examinados.
Karela alteró el nivel de ARNm de HMGR (Fig. 7), lo que sugiere que la disminución del nivel de colesterol sérico en el
grupo de karela depende de la regulación de la síntesis de colesterol hepático. Finalmente, se puede concluir a partir de
informes previos que karela suprimió el efecto del pequeño heterodímero asociado (SHP) que está implicado en la
biosíntesis de ácidos biliares, y esta supresión mejoró la acción de CYP7A1 a través del homólogo-1 del receptor
hepático (LRH-1). Por lo tanto, este aumento en CYP7A1 es la causa de la disminución en los niveles séricos de colesterol
(aumentar el catabolismo del colesterol en sangre a ácidos biliares en el hígado) como se informó en este estudio.

Conclusión

Este estudio demostró que karela alteró la expresión hepática y del tejido adiposo de los genes asociados con los lípidos
y el metabolismo de los carbohidratos para mejorar los niveles de colesterol en la sangre y la hipercolesterolemia.
Mejora la alteración inducida por el colesterol en la arquitectura de las células hepáticas, la apoptosis y el estrés
oxidativo. Además, nuestro estudio demostró que el efecto hipocolesterolémico inducido por karela a través de su
acción sobre la promoción de la conversión de colesterol a ácidos biliares a través de la activación de CYP7A1, regulación
positiva de PPAR y regulación de FAS, SREBP1c y HMG-CoAR en hígado y tejido adiposo tejido. Nuestros hallazgos
recomiendan el uso de karela como alimentos funcionales que tiene efectos beneficiosos para la salud humana.