Pruebas del IMViC

Fundamento: Indol, Rojo de Metilo, Voges- Son cuatro pruebas bioquímicas.Se

Proskauer y Citratos emplean fundamentalmente para la
identificación de
las Enterobacterias (bacilos Gram
negativos, anaerobios facultativos
con metabolismo fermentador).
Dependiendo de las condiciones, las
enterobacterias, pueden realizar un
metabolismo aerobio (si disponen de
oxígeno), realizar una respiración
anaerobia (si hay nitratos u otro
aceptor de electrones) y distintas
fermentaciones.
Escherichia coli : Indol + ;Rojo de
metilo +; Voges-Proskauer –;Citratos
-

5.1. Producción de Indol (I) 5.1. Producción de Indol (I):

a-Fundamento: Se determina si la
bacteria posee una enzima
(triptofanasa). La triptofanasa
hidroliza el triptófano en indol y
alanina. El indol se detecta
empleando un reactivo específico
(Reactivo de Kovacs). El triptófano
forma parte de las peptonas del
medio.
b- Materiales y reactivos:Agua

de peptona

y Reactivo de Kovacs
5.1.c- Método: c- Método: Inocular
el medio de
cultivo (agua de
peptona). Incubar a
37 oC durante 48
horas
 Añadir unas gotas de
reactivo de Kovacs.
Agitar y dejar reposar el
cultivo. El HCl
proporciona el pH ácido
que requiere la
reacción. El alcohol
amílico es, insoluble en
agua y menos denso
5.1.d-Resultado: Producción de Indol Un anillo rosa-rojizo en la superficie
indica que se ha formado un complejo
coloreado entre el indol y el p-
dimetilamino benzaldehído.El alcohol
amílico concentra el complejo
coloreado en la superficie
A la izquierda se
observa un cultivo de E.
coli y a la derecha otro
de Salmonella spp

5.2. Rojo de metilo (M) 5.2. Rojo de metilo (M)

5.2.a. Fundamento: Detecta la

fermentación ácido-mixta. Se
acumulan ácidos (acético, fórmico,
etc.), relativamente fuertes y bajan el
pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio
de pH se detecta añadiendo un
indicador (rojo de metilo) al cultivo
b. Materiales y reactivos: Medio de
Clark-Lubs e indicador de rojo de
metilo
5.2.c. Método Inocular el medio de Clark-Lubs.
Incubar a 37 oC durante 48 horas.
Añadir unas gotas de rojo de metilo
(rojo a pH 4-5; amarillo a pH>6)

5.2.d. Resultado. Rojo de Metilo

 A la izquierda un cultivo
de E. coli y a la derecha
otro de Serratia

5.3. Voges-Proskauer (V) Fundamento

Detecta la fermentación
butanodiólica. En esta fermentación
se producen menor cantidad de ácidos
que en la fermentación ácido-mixta, y
una gran cantidad de butanodiol.
Mediante un reactivo, (alfa-naftol y
KOH al 40%), se detecta la presencia
de un precursor del butanodiol
(acetilmetilcarbinol o acetoína). La
acetoina en presencia de oxígeno se
oxida a diacetilo. El diacetilo oriigina
una coloración roja al reaccionar con
los restos guanidínicos de algunos
aminoácidos de la peptona del medio
(Ej. Arginina).
b. Materiales y reactivos: El medio de
cultivo, es el mismo que en la prueba
del rojo de metilo. Reactivos :alfa-
naftol
5.3.c. Método Inocular el medio de Clark-Lubs.
Incubar a 37 oC durante 48 hora
Añadir unas gotas alfa-naftol (0.6
ml). Agitar y añadir KOH (0.2
ml).Agitar. Iincubar 1-2 horas a 37 oC

5.3.d.Resultado: Voges-Proskauer La acetoína en contacto con el

oxígeno y la potasa origina diacetilo.
El alfa naftol incrementa la
sensibilidad de la reacción. El diacetilo
origina un compuesto de color
rosado.La prueba será positiva si en
20 minutos aparece una coloración
roja. Los cultivos negativos se
incuban 1-2 horas a 37 oC en posición
inclinada efectuándose de nuevo la
lectura. (El contacto con el oxígeno y
la elevada temperatura favorecen la
reacción).
 A la izquierda cultivo
de Serratia spp. Y a la
derecha de E. coli

5.4. Consumo de citratos (C) Fundamento: Se determina la

utilización del citrato como única
fuente de carbono y energía. La
prueba emplea un medio definido
(Koser) con citrato como única fuente
carbonada (se detecta turbidez).
Alternativamente se utiliza el medio
de Simmons: utiliza un medio sólido
con citrato sódico y un indicador
ácido-base (azul de bromotimol). En
este caso se detecta la alcalinización
del medio por el consumo del citrato.
Materiales y reactivos: Medio de
Koser o Medio de Simmons
5.4.c. Método Inocular uno de los medios:El medio
de Simmons es sólido, y se siembra
por estría con asa de platino. Incubar
a 37 oC durante 48 horas
5.4.d. Resultado: Crecimiento sobre Detectar el crecimiento en el medio de
citrato como unica fuente de carbono Koser por turbidez. En el medio de
Simmons por alcalinización del cultivo
(el indicador toma color azul)
Crecimiento en el medio
de Simmons: a la
izquierda cultivo
de Salmonella spp. y a
la derecha de E. coli.
*Dado que la lectura del
medio de Koser se hace
detectando la turbidez
del medio, es necesario
inocular con una
pequeña cantidad de
bacterias y comprobar
que el tubo permanece
casi transparente tras la
inoculación.
PRUEBA INDOL
1.- Tomamos un tubo de agua de peptona.
2.- Tomamos un inóculo de la bacteria y la disolvemos en el medio agua de
peptona.
3.- A continuación, con una pipeta Pasteur, echamos 5 gotas del reactivo de
Kovacs y mezclamos por rotación para que se mezcle bien.
4.- Esperamos de 1 – 2 minutos para leer el resultado.
*Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio.
*Negativa: No se produce color. O un Color naranja en la superficie del medio.
Indica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser el precursor de
la formación de indol. La reacción positiva después de 24 horas indica una prueba
completa

PRUEBA ROJO METILO

1.- Tomamos un medio MRVP.
2.- Cogemos un inóculo de la bacteria y la disolvemos en el tubo de medio MRVP.
3.- Ponemos 5 gotas de rojo de metilo y mezclamos por rotación.
4.- Esperamos 1 – 2 minutos para ver el resultado de la prueba.
*Positiva: Rojo en la superficie del medio (pH = 4.4). Algunas bacterias pueden
producir menores cantidades de ácido a partir del sustrato por ello es posible que
aparezca un color naranja. Esto indica una prueba positiva.
*Negativo: Amarillo (pH = 6) ó naranja

PRUEBA DE VOGES PROSKAUER.

1.- Tomamos un medio de MRVP.
2.- Cogemos un inóculo de la bacteria y lo disolvemos en el medio MRVP.
3.- Añadimos 12 gotas del reactivo α-naftol (VRB).
4.- A continuación, añadimos 4 gotas del reactivo potasa al 40%.
5.- Como la reacción necesita oxígeno para producirse, colocamos el tubo abierto
inclinado sobre la gradilla como punto de apoyo.
6.- Esperamos durante 10 minutos para ver si se produce el color rojizo en el
medio.
*Interpretación Positivo: Rojo rosado en la superficie del medio (presencia de
acetoína).
*Negativo: Amarillo. Puede formarse un color cobrizo, pero aun así la reacción es
negativa.

PRUEBA DEL MEDIO CITRATO

1.- Cogemos un medio citrato.
2.- Tomamos un inóculo con el asa de siembra de platino y sembramos el medio
citrato.
3.- Lo ponemos a incubar y observamos el resultado al día siguiente.
*Interpretación Positivo: Crecimiento, aunque no exista cambio de color.
Crecimiento y el medio de color azul intenso en pico de flauta.

*Negativo: No se observa crecimiento y medio de color verde.

Si se utiliza carbono a partir de citrato de sodio, también se extrae nitrógeno del
fosfato de amonio contenido en el medio, liberándose amoniaco. En ocasiones se
detecta un crecimiento visible a lo largo de la línea de siembra antes de la
aparición de color. Este crecimiento visible también indica resultado positivo.