UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

MICROBIOLOGÍA I

Nombre: Juan Pablo Vaca González NRC: 4332

Fecha: Miércoles, 9 de mayo de 2018.

Título: Contraste entre las técnicas de tinción simple y diferencial en levaduras mediante el uso de distintos métodos
y reactivos para visualizar la morfología de la levadura.

Palabras clave: Saccaromyces cereviseae, frotis, azul de metileno.

Resumen

El experimento que se llevó a cabo utilizo tres técnicas diferentes de las cuales se aplicó a una muestra de
levadura activada con previa preparación de un frotis en el laboratorio utilizando un asa bacteriológica esterilizada.
Se utilizó una técnica de tinción simple y dos de tinción diferencial de manera que se pueda evidenciar como influye
cada una de las mismas en la visualización en el microscopio para lo cual se utilizó distintos reactivos como azul de
metileno, etanol al 10% y 40% y KOH, este último solo se utilizó en una de las dos variantes de la tinción diferencial.
Una vez que se llevó la muestra al microscopio y mediante el uso de aceite de inmersión se logró visualizar que la
tinción diferencial permitía observar al núcleo y, en menor intensidad, la vacuola mientras que en la tinción simple
solo se reconoció la forma geométrica y caracteres interactivos de una levadura. Como consecuencia de ello, se
evidenció como el uso de técnicas diferentes y reactivos en distintas concentraciones y tiempos permiten reconocer
estructuras en la levadura con mayor o menor detalle dependiendo del propósito de investigación y la disponibilidad
de recursos.

1.- Introducción

Las preparaciones de frotis adecuadas para su análisis son requerimientos necesarios que deben seguir ciertas
condiciones, en general se debe utilizar una pequeña cantidad de la muestra que no debe exceder una gota de forma
que se pueda esparcir por toda la placa sin dejar excesos, esto se logra mediante el uso de una asa de siembra ya que
el arco ubicado en el extremo de la misma permite al usuario tomar el volumen suficiente para el frotis. Posteriormente,
en general, se suele requerir de una fijación de la muestra una vez ubicada en la placa portaobjetos esto se logra con
la exposición rápida y efectiva sobre el mechero (UV, 2005).

De manera general, las tinciones se fundamentan en el uso de colorantes que le asignan una clasificación
sintética y natural. En gran medida, el uso de colorantes naturales se dirige al reconocimiento histológico y
morfológico de bacterias y hongos (Vizcarrondo, 2008). En general las tinciones requieren de la cobertura total de la
placa portaobjetos con el colorante lo que teñirá a las células en cuestión dependiendo de la práctica y los propósitos
de la misma (UV, 2005).

Las tinciones son una técnica fundamental que permiten el reconocimiento de diversas estructuras y
características de los microrganismos de estudio en cuestión, dentro de las cuales se puede mencionar a la tinción
Gram para análisis de bacterias, la tinción Wright para reconocimiento de enfermedades provocadas por parásitos,
Ziehl-Neelsen aplicado de igual manera a enfermedades catastróficas o el uso de azul de lactofenol para hongos
(López, Hernández, & Colín, 2014).

2.- Justificación

El aprendizaje acerca de la técnica de preparación de un frotis permite realizar una adecuada práctica con
resultados y conclusiones confiables y viables en el análisis requerido (UV, 2005). La importancia radica en la
conservación adecuada de la muestra que debe seguir los parámetros especificados ya que una desobediencia hacia
ellos puede hacer que no se logre visualizar a la muestra o que esta se dañe. El uso de técnicas de tinción nos permite
reconocer la morfología de los microorganismos en cuestión, y generalmente se aplica a la parte de diagnóstico clínico
para detectar parásitos, bacterias u hongos que son causas de enfermedades crónicas, de manera que se pueda
identificar sus puntos más vulnerables y otorgar una solución (López, Hernández, & Colín, 2014).

El uso de las técnicas de tinción que se especifican a continuación se realizó para ver el grado de descripción
que se puede proporcionar con las mismas. La tinción simple se la utiliza para visualizar la forma en la que los
microorganismos se agrupan y su morfología, por otro lado la tinción diferencial otorga una perspectiva más detallada
de las características de las células (UGR, 2011). Es indispensable diferenciar entre ambas técnicas y propósitos ya
que esto permitirá reducir los tiempos de análisis y entregar resultados puntuales y fundamentales.

3.- Objetivos

3.1. Objetivo general: Contrastar las técnicas de tinción simple y diferencial en levaduras mediante el uso
de distintos métodos y reactivos para visualizar la morfología de la levadura.

3.2. Objetivos específicos

 Preparar un frotis de levadura con el procedimiento adecuado.

 Realizar las tinciones, simple y diferenciales, con los reactivos y tiempos especificados.
 Contrastar los resultados de la tinción diferencial y el efecto del KOH.

4.- Hipótesis

La tinción diferencial presenta características específicas internas más detalladas de las levaduras en
comparación con la tinción simple.

5.- Marco teórico

Un frotis es el nombre con el que se denomina a una expansión realizada de una muestra tomada previamente
la cual no debe ser de un volumen de gran magnitud pero debe ser lo suficiente para cubrir una considerable área de
la placa. Posteriormente requerirá de una fijación lo que permite aplicar técnicas de tinción para observarlas al
microscopio y asegurar una diferenciación de los microorganismos y evitar que estos sean arrastrados por los reactivos
y lavados continuos (UV, 2005).

Las tinciones se clasifican de acuerdo a dos criterios, de acuerdo al detalle que se busca obtener de su
aplicación sobre el microorganismo y de acuerdo al fondo que se utiliza. En el primer criterio se encuentran las
tinciones simple que permite la visualización de formas y agrupaciones y también la diferencial que permite reconocer
características especiales tales como el núcleo (Guzmán, 2016). Por otro lado se encuentran las tinciones negativas y
positivas, as primeras se distinguen de las segundas ya que en ellas se tiñe el fondo en el que se visualiza los
microorganismos y no a ellos (UPRM, 2010).

Dentro de las técnicas más importantes que se utilizan en procesos de tinción son las siguientes: La tinción
Gram desarrollada por Hans Christian Gram que permite categorizar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas haciendo uso de dos reactivos distintos, la tinción Wright se enfoca en los componentes que pueden presentar
las células ya que estos pueden ser ácidos y básicos utilizando dos reactivos básicos(eosina y azul de metileno), la
tinción Ziehl-Neelsen que es utilizada para detectar bacterias ácido-alcohol resistentes como Trypanosoma cruzii, y
en general se utiliza para diagnosticar tuberculosis (López, Hernández, & Colín, 2014). Y finalmente esta la tinción
simple y diferencial que utiliza azul de metileno para distinguir características de la célula.

6.- Materiales y métodos

Para la preparación del frotis se utilizó levadura comestible común previamente activa, colocada en un vaso
de precipitación, una asa bacteriológica la cual se esterilizó colocando su punta sobre un mechero Bunsen hasta que
se forme el rojo vivo en todo el filamento uniformemente, después se expuso la parte de mayor grosor para que se
esterilice también y se procedió a la toma de la muestra considerando que todo se realizó alrededor de la flama para
evitar contaminación por el ambiente. Posteriormente se procedió a frotar la muestra sobre una placa portaobjetos la
cual se rotuló con las iniciales del usuario, la fecha, el NRC y el microorganismo en cuestión y se pasó por el fuego 3
veces con la parte que contenía la muestra contraria a la fuente del fuego del mechero para fijar a la levadura, este
procedimiento se repitió dos veces más para la tinción diferencial que involucra KOH y la que no.

Para la tinción simple solo se utilizó azul de metileno durante dos minutos, posteriormente se lavó evitando
que el chorro de agua sea de un flujo fuerte y se secó la placa con papel toalla de manera puntual para no dañar la
muestra, se llevó la muestra al microscopio para visualizar los resultados con aceite de inmersión en la lente 100X.

Para la primera variante de la tinción diferencial (a) se utilizó el frotis preparado anteriormente, se aplicó
etanol al 40% por un minuto y se lo enjuago con agua común, después se cubrió con una solución de KOH y se dejó
reposar por 30 minutos evitando que este se seque y transcurrido el tiempo necesario se procedió a lavar, se aplicó
azul de metileno en la muestra durante dos minutos y se lavó con agua; finalmente se aplicó etanol al 10% durante 5
segundos, se sacudió y se dejó secar al ambiente. Se llevó la muestra al microscopio para visualizar los resultados con
aceite de inmersión en la lente 100X. Para la segunda variante de la tinción diferencial (b) se utilizó un tercer frotis,
se aplicó etanol al 40% por un minuto y se enjuagó, se aplicó azul de metileno por 2 minutos y se enjuagó, se aplicó
etanol al 40% y se dejó secar al ambiente. Se llevó la muestra al microscopio para visualizar los resultados con aceite
de inmersión en la lente 100X.

7.- Resultados

Mediante los tres procedimientos aplicados para la tinción se obtuvo los resultados indicados en las figuras.

MÉTODOS DE TINCIÓN APLICADOS

SIMPLE DIFERENCIAL A DIFERENCIAL B

Núcleo Núcleo
Vacuol
Vacuola
a

Fig. 1. Se identifica las formas de Fig. 2. Se logra visualizar las Fig. 3. Se visualiza el núcleo en la
agrupación de las levaduras con una vacuolas y el núcleo en la mayoría levadura de la derecha y la vacuola
de ellas en estado de gemación de plantas. en la levadura del centro.
(rojo). Autor: Juan Pablo Vaca Autor: Xavier Montalvo
Autor: Juan Pablo Vaca
En la Figura 1, la tinción simple se evidencia una aglomeración muy intensa en la muestra con ciertas
levaduras en estado reproductivo de gemación inicial y otras fases de terminación. En la Figura 2, tinción diferencial
con KOH se logró visualizar las estructuras con una mayor facilidad en contraste con la tinción diferencial sin KOH
que corresponde a la Figura 3 que su distinción presenta bastante dificultad.

8.- Discusión

La realización de un frotis permite que los microorganismos de la muestra se distribuyan ampliamente de

manera que estos puedan ser visualizados con mayor facilidad, a la vez es indispensable la fijación en un mechero ya
que esto impide que los microorganismos sean arrastrados por los lavados realizados en los procesos de tinción y a la
vez las inactiva de manera que no degraden los reactivos de las técnicas de tinción (UV, 2005). En la práctica se siguió
el protocolo establecido para realizar un frotis adecuado. En la placa de la tinción simple se logró evidenciar
aglomeración de las levaduras en el centro lo que corresponde como indicio de que no se expandió adecuadamente la
muestra en la placa. En la de la tinción diferencial con KOH y sin KOH se logró visualizar una menor población lo
que es indicio de pérdida de muestra por los constantes lavados realizados por el uso de un mayor número de reactivos
que en la tinción simple.

Las levaduras en estado vivo poseen capacidad de degradar el azul de metileno con enzimas, sin embargo, al
realizar el frotis estas mueren de manera que el azul de metileno no es degradado y se tiñe el interior de las levaduras
lo que permite su visualización (Vinidea, 2001). Las levaduras presentan características claramente identificables y
visibles como su tamaño de crecimiento, geometría, agrupaciones de gran magnitud, medios de reproducción como la
gemación que es un método asexual (Andoni, 2014). En el laboratorio se logró evidenciar el efecto del azul de metileno
sobre las levaduras y se describió la morfología de las mismas. En la tinción simple se logró identificar las
características generales de las levaduras tales como su forma ovoide, sus agrupaciones aglomeradas en ciertas
regiones y un estado de gemación que se visualiza como una pequeña levadura saliendo de una más grande.

La tinción de levaduras con azul de metileno puede estar sometida a dos condiciones, una en la que se utiliza
KOH y otra en la que no. El KOH actúa como componente aclarante de manera que permite visualizar las estructuras
internas de manera más detalla en contraste con otros reactivos (Negroni, 2011). En el laboratorio al realizar la tinción
diferencial utilizando KOH en contraste con el procedimiento que no lo utilizaba se obtuvo una mejor visibilidad en
la que si utilizaba KOH de manera que las estructuras internas principales como núcleos y vacuolas fueron claramente
distinguibles a diferencia del segundo procedimiento en donde sí se logró visualizar por el incremento de luz del
microscopio aunque con dificultad ya que las levaduras estaban intensamente teñidas.

9.- Conclusiones

 El frotis es un prerrequisito que se somete a varios parámetros de preparación los cuales contribuyen
significativamente en la conservación y análisis de la muestra.
 La tinción simple es una técnica que permite visualizar las características externas e interactivas de las
levaduras, mientras que la tinción diferencial permite visualizar las estructuras internas.
 El uso de KOH en la tinción diferencial permite una mejor visualización de los resultados de la tinción ya
que aclara la muestra y las estructuras que esta presenta.

10.- Bibliografía

Andoni, J. (2014). Tipos de contaminación en cultivos celulares y su prevención. Obtenido de http://servicios.unileon.es/formacion-

pas/files/2014/02/Contaminaciones-y-prevencion.pdf

Guzmán, M. (2016). Tinciones en Microbiolgía. Obtenido de http://www.telmeds.org/wp-content/uploads/2016/11/Tinciones-en-

Microbiolog%C3%ADa.pdf

López, L., Hernández, M., & Colín, C. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Obtenido de
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf

Negroni, R. (2011). Manual de medios y reactivos en el laboratorio de micología. Obtenido de

http://www.uca.edu.ar/uca/common/grupo11/files/micologia-2013/Manual-de-Medios-y-Reactivos.pdf

UGR. (2011). Observación de las bacterias. Obtenido de http://www.ugr.es/~cjl/tinciones.pdf

UPRM. (2010). Tinción de microorganismos. Obtenido de http://academic.uprm.edu/~lrios/3725/Ejercicio4.pdf

UV. (2005). Preparación de un frotis bacteriano por tinción simple - UV. Obtenido de https://www.uv.es/~jjmateo/microb/tincionsimple.doc

Vinidea. (2001). Tinción con azul de metileno. Obtenido de http://www.infowine.com/intranet/libretti/libretto14427-01-1.pdf

Vizcarrondo, M. (2008). Morfología y tinción de los microorganismos. Obtenido de

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Morfolog%C3%ADa_y_Tinci%C3%B3n.pdf