UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE QUÍMICA Y FARMACIA

“EXTRACCIÓN, FRACCIONAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS

FITOQUÍMICOS A PARTIR DE HOJAS DE Schinus molle var. areira L. (DC)”

Unidad de investigación para optar al Título de Químico Farmacéutico

DIEGO NICOLÁS FERNANDO MOLINA BUSTAMANTE

Laboratorio de Investigación Escuela de Química y Farmacia, Universidad Andrés Bello.

Maité Rodríguez Díaz

Director

Santiago, 2018
 UNIVERSIDAD ANDRES BELLO
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE QUÍMICA Y FARMACIA

““EXTRACCIÓN, FRACCIONAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS

FITOQUÍMICOS A PARTIR DE HOJAS DE Schinus molle var. areira L.. (DC)”

DIEGO NICOLÁS FERNANDO MOLINA BUSTAMANTE

TESIS PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO

Comisión correctora:

- Profesor corrector: José Manuel Delgado Pérez

- Profesor corrector: Lorena Sáez Lancien

Santiago, 2018
DIRECTOR

Directora de Tesis: Maité Rodríguez Díaz, Químico Farmacéutico Universidad Central

de Las Villas (UCLV), Santa Clara, Cuba. Magister en Química Farmacéutica, Instituto
de Farmacia y Alimentos, Universidad de la Habana. Doctor en Ciencias Mención
Química, Universidad de Chile. Profesora de Botánica y Farmacognosia, Farmacoquímica
I y II, Universidad Andrés Bello.

COMISIÓN CORRECTORA
Profesor Corrector: José Manuel Delgado, Químico Farmacéutico, Universidad Andrés
Bello. Licenciado en Farmacia, Universidad Andrés Bello. Magíster en Farmacia Mención
Clínica y en Docencia para la Educación Superior, Universidad Andrés Bello. Secretario
académico Escuela de Química y Farmacia. Profesor de Farmacocinética y Biofarmacia.
Coordinador Internado Farmacéutico.

Lorena Sáez Lancien, Químico Farmacéutico, U. de Valparaíso. Magíster en

Administración de Empresas (MBA) Universidad del Desarrollo. Directora Carrera de
Química y Farmacia, sede Viña del Mar. Profesora de Introducción a las Ciencias
Farmacéuticas. Profesora de Tecnología Farmacéutica y Tecnología Cosmética.
 ÍNDICE DE CONTENIDOS

ÍNDICE DE TABLAS………………………………………………………………………v
ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………….vi
ABREVIATURAS………………………………………………………………………....vii
RESUMEN..............................................................................................................................1

1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………2

1.1. Farmacognosia y fitoquímica………………………………………………..……..4

1.2. Metabolismo secundario de las plantas…………………………………………...5

1.2.1. Alcaloides………………………………………………………………….7
1.2.2. Terpenos o isoprenoides………………………………………………….8
1.2.3. Compuestos fenólicos…………………………………………………….9
1.3. Métodos extractivos para plantas medicinales…………………….……………10
1.3.1. Métodos clásicos de extracción…………………………………………12
1.3.2. Extracción con disolventes……………………………………………...13
1.3.2.1. Extracciones discontinuas o simultáneas…………………….15
1.3.2.1.1. Maceración…………………………………………...15

1.3.2.1.2. Infusión……………………………………………….15

1.3.2.1.3. Decocción……………………………………………..16

1.3.2.2. Extracción continua o progresiva……………………………..16

1.3.2.2.1. Percolación………………………………………….16
1.3.2.2.2. Extracción continua en caliente (Soxhlet)…...……...17

i
1.4. Técnicas de separación, identificación y caracterización de compuestos
bioactivos…………………………………………………………………………….…18
1.4.1. Cromatografía…………………………………………………………...18

1.4.1.1. Cromatografía en capa fina (CCF)……………………………20

1.4.1.2. Cromatografía en columna (CC)……………………………...21

1.4.1.3. Cromatografía de gases (GC)…………………………………21

1.4.2 Espectrometría de Masas (MS)...……………………………………….22

1.4.3. Cromatografía de gases y Espectrometría de masas (GC-MS)……….24
1.4.4. Cromatografía líquida de alta resolución (CLAR).................................25

1.4.4.1. Detector de diodos......................................................................26

1.4.5. Cromatografía líquida de alta resolución/Espectrometría de masas

(HPLC/MS) ........................................................................................................27
1.4.5.1. Ionización química a presión atmosférica (APCI)..................28

1.4.5.2. Ionización por Electrospray (ESI)............................................29

1.5 Antecedentes de Schinus molle var. areira L. (DC)................................................31
1.5.1. Clasificación taxonómica..........................................................................31

1.5.2. Descripción botánica................................................................................32

1.5.3. Hábitat y distribución geográfica............................................................33

1.5.4. Usos terapéuticos.......................................................................................34

1.5.5. Efectos farmacológicos de S. areira L. ....................................................35

2. OBJETIVOS....................................................................................................36
2.1. Objetivo general.......................................................................................................37
2.2. Objetivos específicos................................................................................................37

3. METODOLOGÍA............................................................................................38

ii
3.1 Reactivos y equipos...................................................................................................39
3.1.1. Reactivos........................................................................................39
3.1.2. Equipos..........................................................................................39
3.2 Obtención de extractos crudos.................................................................................40

3.2.1 Recolección de hojas de S. areira L...........................................................40

3.2.2 Secado..........................................................................................................40

3.2.3 Molienda.....................................................................................................40

3.2.4 Extracción discontinua por maceración..................................................40

3.3 Fraccionamiento de los extractos crudos y cálculo de rendimientos....................41

3.3.1 Cálculo de rendimientos............................................................................41

3.4 Identificación cualitativa de metabolitos primarios y secundarios presentes en
hojas de Schinus molle var. areira L. (DC)...................................................................43
3.4.1 Tamizaje fitoquímico.................................................................................43
3.5 Purificación de las fracciones de interés mediante técnicas cromatográficas......48

3.5.1 Cromatografía en columna (CC)...............................................................48

3.5.2 Cromatografía en capa fina (CCF)...........................................................48

3.5.3 Cromatografía en capa fina preparativa de cristal (PTLC)...................49

3.6 Identificación de los productos aislados a partir de las Fracción B presente en el

extracto purificado final.................................................................................................50

3.6.1 Caracterización del extracto purificado final de S. areira L. por HPLC-

DAD-ESI-MS / MS..........................................................................................................50

4. RESULTADOS...........................................................................................................52

4.1 Fraccionamiento de extractos crudos y cálculo de rendimientos..........................53

4.1.1. Cálculo de rendimiento de extracto crudo....................................................53

iii
 4.1.2. Cálculo de rendimientos para fracciones del extracto crudo....................53
4.1.2.1. Fracción A.................................................................................................53
4.1.2.2. Fracción B..................................................................................................53
4.1.2.3. Fracción C.................................................................................................54
4.1.2.4. Fracción D.................................................................................................54

4.2 Identificación cualitativa de metabolitos primarios y secundarios presentes en

hojas de Schinus molle var. areira L. (DC)....................................................................54
4.2.1 Tamizaje fitoquímico.................................................................................54
4.2.1.1. Fracción A...................................................................................55
4.2.1.2. Fracción B...................................................................................56
4.2.1.3. Fracción C...................................................................................57
4.2.1.4. Fracción D...................................................................................58

4.3. Purificación de las fracciones de interés mediante técnicas cromatográfica......59

4.3.1 Cromatografía en Columna............................................................................59
4.3.2 Cromatografía en Capa fina...........................................................................59
4.3.3 Cromatografía en capa fina preparativa de cristal (PTLC)........................60

4.4 Identificación de los productos aislados a partir de las Fracciones B presentes en

el extracto purificado final.............................................................................................61

4.4.1 Análisis de HPLC-DAD-ESI-MS / MS de extracto de S. areira L...........61

5. DISCUSIÓN..............................................................................................................62
6. CONCLUSIONES....................................................................................................71
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................74
ANEXOS.........................................................................................................................79
Anexo 1................................................................................................................79
Anexo 2................................................................................................................81
Anexo 3................................................................................................................82

iv
 ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Compuestos orgánicos presentes en las especies vegetales ……………………7
Tabla 2. Tipos de fitoquímicos extraídos según distintos solventes y sus polaridades…...14
Tabla 3. Técnicas cromatográficas utilizadas para separar biomoléculas según sus
propiedades específicas…………………………………………………………………19
Tabla 4. Pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa de
metabolitos de la Fracción A……………………………………………………………43
Tabla 5. Pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa de
metabolitos presentes en la Fracción B…………………………………………………45
Tabla 6. Pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa de
metabolitos presentes en la Fracción C…………………………………………………46
Tabla 7. Pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa de
metabolitos presentes en la Fracción D…………………………………………………47
Tabla 8. Porcentaje de rendimiento para las fracciones obtenidas del extracto crudo...53
Tabla 9. Resultados de pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa
de metabolitos presentes en la Fracción A………………………………………………55
Tabla 10. Resultados de pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación
cualitativa de metabolitos presentes en la Fracción B…..……………………………....56
Tabla 11. Resultados de pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación
cualitativa de metabolitos presentes en la Fracción C………………………………….57
Tabla 12. Resultados de pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación
cualitativa de metabolitos presentes en la Fracción D…………………………………..58
Tabla 13. Resultados de CCF para la Fracción B obtenida a partir del extracto
crudo……………………………………………............................………………....….59
Tabla 14. Compuestos presentes en los extractos purificados finales, junto a su relación
masa/carga y sus tiempos de retención…………………………………………………61
Tabla 15. Resumen de los resultados encontrados en nuestro estudio correlacionando:
parte de la planta ó fracción analizada, solvente empleado y tipo de extracción,
metabolitos presentes según la literatura y los ensayos realizados..................………...66

v
 ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Elementos básicos del metabolismo primario y su relación con el metabolismo
secundario en las plantas………………………………………………………..……..…6

Figura 2. Biosíntesis y tipos de alcaloides..........................................................................8

Figura 3. Biosíntesis de los isoprenoides……………………………………………...…9

Figura 4. Estructuras fenólicas procedentes de la ruta del ácido shikímico o ruta del
acetato…………………………………………………………………………………..10
Figura 5. Métodos extractivos comunes a partir de drogas vegetales…………………..12
Figura 6. Esquema de un extractor Soxhlet……………………………………………..17
Figura 7. Espectro de masas de metanol obtenido por ionización electrónica………….22
Figura 8. Diagrama básico de un espectrómetro de masas……………………………..23
Figura 9. Diagrama esquemático de GC-MS…………………………………………...24
Figura 10. Diseño esquemático de un espectrómetro con detector de diodo…………...26
Figura 11. Esquema general de una interfase de Ionización química a Presión
atmosférica (API) acoplada a un espectrómetro de masas……………………………..28

Figura 12. Fuente de API-ionización química a presión atmosférica…………………..29

Figura 13. Elementos básicos que constituyen una configuración representativa de una
fuente API-electrospray…………………………………………………………………30

Figura 14. Schinus molle var. areira L. (DC)………………………………………….32

Figura 15. Hojas, flores y frutos de Schinus molle var. areira L. (DC)..........................33

Figura 16. Esquema de la marcha fitoquímica empleada para fraccionar los extractos
crudos…………………………………………………………………………………...42
Figura 17. Factores que afectan la recolección y extracción de principios activos de
especies vegetales.............................................................................................................63
Figura 18. Estructuras químicas de algunos fitoquímicos presentes en los frutos de S.
molle var. areira L. (DC)…....…………………………………………………..67

vi
ABREVIATURAS

AE: acetato de etilo

API: Ionización a presión atmosférica
APCI: Ionización química a presión atmosférica
cm: centímetros
°C: Grados Celsius
CHCl3: Cloroformo
CC: Cromatografía en columna
CCF: Cromatografía en Capa fina
DAD: Detector de diodos
ESI: Ionización por electrospray
FeCl3: Cloruro férrico
g: gramos
GC: Cromatografía de gases
GC-MS: Cromatografía de gases acopada a Espectrómetro de masas
h: horas
HCl: ácido clorhídrico
HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución
HPLC/MS: Cromatografía líquida de alta resolución/Espectrómetro de masas
H2SO4: ácido sulfúrico
kV: kilo Volts
m: metros
MeOH: Metanol
Mg: Magnesio
mg: miligramos
min: minutos
ml: mililitros
ml/min: mililitros por minuto
mm: milímetros
MS: Espectrómetro de masas
m/z: relación masa/carga
N2: Nitrógeno gaseoso
Na2SO4: Sulfato de sodio anhidro
NaOH: Hidróxido de Sodio
NH3: Amoníaco
PTLC: Cromatografía en capa fina preparativa de cristal
S. areira L.: Schinus molle var. areira L. (DC)
um: micrometros
uma: unidades de masa atómica
UV: ultravioleta
var.: variedad
Zn: Zinc

vii
RESUMEN

Durante miles de años la humanidad ha utilizado plantas medicinales para aliviar o curar
enfermedades. En la cultura popular existe la idea de que las plantas presentan componentes
en su interior que son los responsables de muchas de sus propiedades y este saber tradicional
ha sido avalado por los estudios químicos y farmacológicos realizados a las diversas especies
de plantas que se conocen con acción terapéutica.
El estudio de las plantas medicinales generalmente involucra procedimientos extractivos, de
fraccionamiento e identificación con el fin de determinar cualitativa y cuantitativamente los
principales constituyentes químicos presentes en una planta.
Schinus molle var. areira L. (DC.) (S. areira L.) es un árbol nativo de la región Andina, del
cual han sido descritos múltiples usos farmacológicos: antimicrobiano, para el tratamiento
de la bronquitis y asma, en malestares reumáticos, hepáticos o estomacales; como regulador
del ciclo menstrual y para la curación de heridas, entre otros.
El objetivo de esta investigación fue la extracción, el fraccionamiento e identificación de
compuestos fitoquímicos presentes en la especie S. areira L. Para alcanzar el objetivo
propuesto se preparó un extracto crudo etanólico de hojas de S. areira. L. el cual fue
fraccionado a través de una marcha fitoquímica, obteniendo finalmente 4 fracciones (A, B,
C y D), cada una de las cuales fue sometida a pruebas cualitativas de tamizaje fitoquímico,
con el fin de conocer la presencia y/o ausencia de metabolitos.
Luego cada fracción fue purificada por técnicas cromatográficas, especialmente para separar
mejor los compuestos de interés en la fracción B, de naturaleza terpénica. Esta fue sometida
a una separación en columna cromatográfica clásica, empleando como medio de solvente una
mezcla de acetato de etilo:metanol (8:2). Según los resultados que arrojó el análisis inicial
mediante cromatografía en capa fina de cada fracción eluída, se recogieron y juntaron
aquellas muestras que dieron positivo para fluorescencia al observar los cromatogramas en
la lámpara UV. Finalmente se identificaron los compuestos presentes mediante HPLC/MS,
determinándose la presencia de espatulenol, quercetina, isoquercetina, miricetina, ácido
cafeico y ácido gálico.

1
_____________________________________________________________________________Introducción

1. INTRODUCCIÓN

2
_____________________________________________________________________________Introducción

En la época colonial, el encuentro entre los pueblos indígenas y los españoles trajo como
consecuencia la diseminación de enfermedades que produjo el contagio entre ellos. La
medicina mapuche, que se remonta a la edad del bronce (4000 años a.c.), fue un pilar
importante de este encuentro, debido a que los mapuches en beneficio de la salud conocían
el herbolario que representaba su suelo y sacaban provecho de sus hierbas, de las flores, de
los árboles, de las cortezas, de las ramas, de las raíces, de los frutos en sus diversos estados
de madurez, de las hojas y de los brotes mismos.
La medicina mapuche era naturalista y de carácter mágico-religioso. Sus elementos
terapéuticos empíricos eran tres: cirugía, preparación y uso de hierbas o plantas medicinales
y utilización de aguas termales que ejecutaban o preparaban El o La machi en una práctica
colectiva. De estos tres elementos el uso de plantas medicinales resulta ser el más eficiente y
al alcance del pueblo. La riqueza de la flora chilena, con más de mil plantas con propiedades
medicinales de múltiples efectos benéficos es el recurso más a mano, al que se accede
generalmente a la hora de la automedicación. (1)

Se entiende por planta medicinal cualquier planta que en uno o más de sus órganos contenga
sustancias que puedan ser usadas terapéuticamente o que son precursores para la hemisíntesis
químico-farmacéutica. (2) Las plantas y los árboles son la base para el desarrollo de la
medicina moderna. En algunas zonas rurales e indígenas son el único recurso del que
disponen a falta de instituciones médicas y recursos monetarios para la adquisición de
medicina moderna. (3)

En la actualidad, el uso de plantas medicinales es un recurso terapéutico empleado como

fuente de preparados medicamentosos y su práctica se debe a que se conoce que dentro de
las plantas y de sus anexos existen principios activos o constituyentes con acción terapéutica.
(4) Nuestra realidad terapéutica hoy en día está regida por la química sintética, dado que
gracias al desarrollo de la síntesis química hombres de ciencia lograron “copiar” núcleos
básicos de moléculas exitosas que la naturaleza crea de forma espontánea. (5)

3
_____________________________________________________________________________Introducción

1.1. Farmacognosia y fitoquímica

La Farmacognosia es la ciencia que se ocupa del estudio de las drogas y las sustancias
medicamentosas de origen natural: vegetal, microbiano (hongos, bacterias) y animal. Estudia
tanto sustancias con propiedades terapéuticas como sustancias tóxicas, excipientes u otras
sustancias de interés farmacológico sin uso terapéutico (ej. algodón, almidón). Dentro de sus
objetivos considera establecer la composición química de las drogas, tanto cualitativa como
cuantitativamente, sobre todo lo que se refiere a los principios activos, además de obtener
extractos de dichas drogas que contengan estos principios activos, para poder así establecer
las propiedades farmacológicas, o bien dicho, su actividad. (6)

La fitoquímica es un tema importante dentro del currículum de la farmacognosia. En el año

1747 el químico analítico alemán Andreas Sigismund Margraff aisló la sucralosa a partir de
la remolacha. Sin embargo, es ampliamente considerado que el nacimiento de la fitoquímica
fue el aislamiento del ácido tartárico de las uvas en 1769 por el químico suizo Carl Wilhelm
Scheele. (7)

Fitoquímica se define como el estudio de la composición química de las plantas medicinales

o fitoquímicos. “Fito” en griego significa planta, por lo tanto, fitoquímico literalmente
significa químicos producidos por las plantas. El término es reservado para aquellos
fitoquímicos que tienen un efecto beneficioso en la salud humana pero que no son esenciales
desde el punto de vista nutritivo. (8) Esta ciencia se preocupa principalmente de dos
problemas: el estudio de la composición química de las plantas y de la explicación de varios
procesos vegetales en los cuales están involucrados fenómenos químicos. El primer problema
incluye: la detección cualitativa, el aislamiento y la estimación cuantitava de los componentes
de la planta. (9)

La investigación fitoquímica de una planta puede implicar los siguientes pasos: autenticación
y extracción del material vegetal, separación y aislamiento de los constituyentes de interés,
caracterización de los compuestos aislados y evaluación cuantitativa (10).

4
_____________________________________________________________________________Introducción

El tamizaje fitoquímico o “screening” fitoquímico es una de las etapas iniciales de la

investigación fitoquímica, que permite determinar cualitativamente los principales grupos de

constituyentes químicos presentes en una planta y, a partir de allí, orientar la extracción y/o
fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor interés. El
tamizaje fitoquímico consiste en la extracción de la planta con solventes apropiados para la
determinación de presencia o ausencia de metabolitos, mediante la aplicación de reacciones
químicas. Debe permitir la evaluación rápida, con reacciones sensibles, reproducibles y de
bajo costo. Los resultados del tamizaje fitoquímico se observan en base a productos de
precipitación, formación de colores, turbidez, aparición de fluorescencia, entre otros. El
tamizaje fitoquímico nos orienta acerca de los componentes químicos analizados y que deben
interpretarse en conjunto con posteriores resultados de estudios farmacológicos. (11)

Los componentes químicos de las drogas son generalmente abundantes y según su naturaleza
química se pueden clasificar en:

1. Inorgánicos: agua, minerales.

2. Orgánicos: compuestos de naturaleza orgánica proveniente del metabolismo de las
plantas.

1.2. Metabolismo secundario de las plantas

El conjunto de reacciones químicas que tienen lugar en un organismo constituye el

metabolismo (Figura 1). La mayor parte del carbono, nitrógeno y de la energía terminan en
aminoácidos, nucléotidos, azúcares y lípidos; moléculas comunes a todas las células que son
necesarias para su funcionamiento y el de todos los organismos. Estas moléculas se
denominan metabolitos primarios y están presentes en todas las plantas ejerciendo las mismas
funciones. Pero a diferencia de otros organismos, las plantas destinan una cantidad
significativa del carbono asimilado y de la energía a la síntesis de una amplia variedad de
moléculas orgánicas que no parecen tener una función directa en procesos fotosintéticos,
respiratorios, asimilación de nutrientes, transportes de solutos o síntesis de proteínas,
carbohidratos o lípidos, que se denominan metabolitos secundarios. (12)

5
_____________________________________________________________________________Introducción

Figura 1. Elementos básicos del metabolismo primario y su relación con el metabolismo

secundario en las plantas. (12)

Los metabolitos secundarios son reconocidos por mostrar actividad curativa frente a
dolencias, síntomas y patologías que aquejan al ser humano, lo que podría explicar el uso
tradicional de plantas medicinales para el tratamiento de algunas enfermedades. Son
sintetizados por las plantas como defensa en contra de seres herbívoros y patógenos o para
la atracción de agentes polinizadores. (13) En la actualidad tienen una importancia
considerable debido a que a pesar del desarrollo de la industria farmacéutica, continúan
siendo la gran fuente de fitoquímicos que puede llevar al desarrollo de drogas innovadoras.
Los metabolitos secundarios se pueden agrupar en tres principales familias químicas:
alcaloides, terpenos o isoprenoides y compuestos fenólicos como se muestra en la Tabla 1.
(14)

6
 _____________________________________________________________________________Introducción

Tabla 1. Compuestos orgánicos presentes en las especies vegetales (6)

Compuestos procedentes del metabolismo primario Compuestos procedentes del metabolismo secundario

Glúcidos Isoprenoides: terpenos, aceites esenciales, saponinas

Lípidos y ceras vegetales y cardiotónicos.
Aminoácidos y proteínas Derivados fenólicos: Shikimatos (fenoles y ácidos
Ácidos nucleicos fenólicos, cumarinas, taninos, flavonoides, lignanos,
Compuestos nitrogenados (glucósidos, enzimas, etc.) antocianinas) y Acetatos (quinonas, antracenósidos)
Alcaloides

1.2.1. Alcaloides

Una definición precisa del término “alcaloide” (similar a álcali) es un tanto difícil porque no
hay un límite claro entre los alcaloides y las aminas complejas de origen natural. La
innumerable cantidad de productos descritos, la diversidad estructural y el abanico de
actividades farmacológicas, hacen de los alcaloides uno de los grupos más importantes dentro
de las sustancias de origen natural con interés terapéutico. (15) Fueron definidos en un
principio como sustancias orgánicas provenientes únicamente del reino vegetal y que
contienen uno o más átomos de nitrógeno, (usualmente en un anillo heterocíclico) de carácter
básico y de actividad farmacológica significativa. (10) La descripción anterior, en la
actualidad se refiere exclusivamente a los alcaloides típicos o verdaderos, pero existen
diferentes tipos de alcaloides que son sintetizados por diversas rutas bioquímicas que se
muestran en la Figura 2. Los pseudoalcaloides poseen normalmente todas las características
de los alcaloides típicos, lo único que los diferencia es que no derivan de aminoácidos. Los
protoalcaloides son aminas simples cuyo nitrógeno no pertenece a un heterociclo. Se puede
decir en definitiva, que un alcaloide es un compuesto orgánico de origen natural
(normalmente vegetal), nitrogenado, de carácter relativamente básico y dotado, a bajas dosis,
de marcadas propiedades farmacológicas. (15)

7
_____________________________________________________________________________Introducción

Figura 2. Biosíntesis y tipos de Alcaloides (15)

1.2.2. Terpenos o isoprenoides

Los terpenos o isoprenoides son metabolitos secundarios formados a través de la ruta de

condensación isoprénica, o ruta del ácido mevalónico, en la que, mediante reacciones
catalizadas por enzimas, se adicionan secuencialmente cinco unidades de Carbono (C5) en
forma de pirofosfato de isopentenilo (IPP), sobre ésteres pirofosfóricos de alcoholes que son
los principales precursores de los principales tipos de terpenos. En la Figura 3 se muestra la
ruta del ácido mevalónico, los principales tipos de terpenos y los precursores de los cuales
provienen. Cada grupo de terpenos es el resultado de la condensación “cabeza-cola” de un
número variable de unidades isoprénicas. Los compuestos isoprenoides son muy numerosos
y de estructura diversa, se pueden encontrar tal cual o formando parte de estructuras más
complejas (saponinas) o de mezclas complejas (aceites esenciales). (6)

8
_____________________________________________________________________________Introducción

Figura 3. Biosíntesis de los Isoprenoides (6)

Según el número de unidades de isopreno que forman la estructura de los terpenos, se pueden
clasificar en: hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), diterpenos (C20), triterpenos (C30),
tetraterpenos (C40) y poliisoprenoides ((C5)n). (6)

1.2.3. Compuestos fenólicos

Los compuestos fenólicos constituyen un amplísimo conjunto de sustancias de difícil

definición. El elemento estructural fundamental que los caracteriza es la presencia de al
menos un núcleo bencénico que contiene como mínimo un grupo hidroxílico, libre o
formando parte de otra función: éter, éster, heterósido. Una definición exclusivamente
química de los fenoles es insuficiente para la caracterización de los compuestos vegetales,
por lo tanto, es necesario introducir un criterio biosintético para delimitar este tipo de
compuestos. (15) Las estructuras fenólicas son metabolitos secundarios que pueden proceder
de la ruta del ácido shikímico (Figura 4): fenoles sencillos, ácidos fenólicos, cumarinas,
lignanos, flavonoides, antocianos y taninos; o de la ruta de los acetatos o ruta del ácido
mevalónico: antraquinonas y heterósidos antracénicos.

9
_____________________________________________________________________________Introducción

Figura 4. Estructuras fenólicas procedentes de la ruta del ácido Shikímico o ruta del
acetato (6)

El estudio de las plantas medicinales y de sus metabolitos primarios y secundarios comienza

con procedimientos de preextracción y de extracción y termina con análisis cualitativos y
cuantitativos, los cuales son pasos importantes en el procesamiento y obtención de los
componentes bioactivos de los materiales vegetales.

1.3. Métodos extractivos para plantas medicinales

La etapa inicial en el estudio de las plantas medicinales es la preparación de muestras (hojas,

cortezas, raíces, frutas y flores) para preservar las biomoléculas en las plantas previa a la
extracción, las cuales pueden ser extraídas desde el material vegetal fresco o seco. En la
mayoría de los casos, se prefieren las muestras secas considerando el tiempo necesario para
el diseño experimental. El secado y la disminución del tamaño de partícula son procesos
claves en la preparación de muestras vegetales que serán sometidas a procesos de extracción.
(16)

10
_____________________________________________________________________________Introducción

Secado

El proceso de secado de las muestras vegetales puede ser realizado utilizando diferentes
métodos: secado al aire libre, secado al microondas, secado en estufa y secado en frío o
liofilización

El secado al aire libre usualmente toma desde 3-7 días a meses e incluso un año dependiendo
del tipo de muestra a secar (ej. Hojas o semillas). Este método de secado no obliga a secar el
material vegetal a altas temperaturas, por lo tanto, los compuestos lábiles al calor se
mantienen, sin embargo, toma más tiempo en comparación al secado en microondas o en
frío. Además, las muestras están más expuestas a la contaminación dado a la condición de
temperatura inestable.

El uso del microondas puede acortar el tiempo de secado, pero a veces causa la degradación
de los fitoquímicos, debido a que el microondas usa radiación electromagnética la cual posee
campos magnéticos y eléctricos. El campo eléctrico causa calor simultáneo a través de la
rotación dipolar; alineando el campo eléctrico de las moléculas que poseen un momento
dipolar permanente o inducido (ej. Solventes y muestras), e inducción iónica, que produce
oscilación entre las moléculas lo que causa la colisión de éstas y como resultado el
calentamiento simultáneo de las muestras vegetales. (16)

El secado en estufa es un método que usa la energía térmica para remover la humedad desde
las muestras. Se considera como uno de los procesos térmicos más fáciles y rápidos que
puede preservar los fitoquímicos.

La liofilización es un método basado en el principio de la sublimación (proceso donde un

sólido se transforma en gas sin entrar en fase líquida). En este método las muestras son
congeladas en un intervalo de -80°C a -20°C para solidificar cualquier líquido (ej. Solvente
o agua). Luego de transcurrir una noche (12 horas) las muestras son inmediatamente
liofilizadas para evitar que el líquido congelado en la muestra se derrita. La liofilización es
un método complejo y costoso de secado, comparado a secar regularmente las muestras al
aire libre o a través del uso de microondas. Por lo tanto, su uso se reserva a materiales de alto
valor que sean delicados y sensibles al calor.

11
_____________________________________________________________________________Introducción

Disminución del tamaño de partícula

El objetivo de pulverizar el material vegetal de las plantas es romper sus órganos, tejidos y
estructuras celulares de modo que sus ingredientes medicinales estén expuestos al momento
de la extracción con solventes. Además, la reducción del tamaño de partícula maximiza el
área de contacto, que a su vez mejora la transferencia de principios activos desde el material
vegetal al solvente. (17) Para ello, el mortero convencional y los molinos eléctricos son
utilizados comúnmente para reducir el tamaño de partícula.

1.3.1. Métodos clásicos de extracción.

Extracción implica la separación de porciones medicinalmente activas presentes en plantas o

en tejidos animales desde sus componentes inertes o inactivos usando solventes
seleccionados en procesos de extracciones estándar. Los productos obtenidos por extracción
desde las plantas son relativamente líquidos impuros, semisólidos o polvos destinados solo
para uso oral o externo. Estos incluyen clases de preparaciones conocidas como, decocciones,
infusiones, extractos fluidos, tinturas, extractos semisólidos y extractos en polvo. Tales
preparaciones son conocidas como galénicas, en honor al médico griego del segundo siglo,
Galeno. (17) Los compuestos bioactivos de las plantas medicinales pueden ser extraídos
mediante varias técnicas clásicas de extracción que se muestran en la Figura 5. La mayoría
de estas técnicas están basadas en el poder extractivo de distintos solventes y en la aplicación
de calor y/o agitación.
Métodos extractivos

Extracción Extracción Extracción con

mecánica Destilación con gases disolventes

Por
Discontinua Continua
expresión

Por calor Maceración Percolación

Con
incisiones Digestión Soxhlet

Infusión

Decocción

Figura 5. Métodos extractivos comunes a partir de drogas vegetales (6)

12
_____________________________________________________________________________Introducción

El propósito de toda extracción es separar los metabolitos solubles de la planta, dejando

detrás el marco celular insoluble (residuo). El extracto inicial crudo utilizando los métodos
de extracción contiene una compleja mezcla de muchos metabolitos presentes en las plantas,
tales como: alcaloides, glicósidos, fenoles, terpenoides y flavonoides. Algunos de los
extractos iniciales obtenidos pueden estar listos para su uso como agentes medicinales en la
forma de tinturas o extractos fluidos, pero algunos necesitan procesamientos adicionales. (16)

1.3.2. Extracción con disolventes

La extracción con disolventes es el método más popular. El principio de la extracción sólido-

líquido es que cuando el material sólido entra en contacto con un solvente, los componentes
solubles del material sólido se mueven hacia el solvente. Así, la extracción con solventes a
partir de materiales vegetales resulta en la transferencia de masa del principio activo soluble
hacia el solvente, lo que toma lugar en una gradiente de concentración. (17)

Para que la extracción con disolventes se lleve a cabo correctamente hay que tener en cuenta
los siguientes factores:

a. Característica de la droga: se debe trabajar con drogas desecadas y con un grado de

división adecuado (mayor en drogas duras como las cortezas y menor en drogas más
blandas como flores y hojas) para facilitar el máximo contacto entre los principios
activos y el disolvente. (6)

b. Naturaleza del disolvente: principalmente se utilizan en las extracciones el agua y las

mezclas hidroalcohólicas (agua y alcohol etílico) en proporción variable. También es
posible utilizar otros solventes orgánicos como acetona, éter etílico, hexano,
propilenglicol, etc. El agua es un buen disolvente de muchos principios activos de las
drogas, pero por esta misma razón resulta generalmente poco selectivo. (6) Cabe
señalar que la elección apropiada del disolvente es de esencial importancia junto con
la aplicación de un método de extracción compatible. Para la selección de solventes
el principio de “lo semejante disuelve a lo semejante” se aplica. Así, los solventes
polares extraerán sustancias polares y los solventes apolares extraerán los compuestos

13
_____________________________________________________________________________Introducción

apolares. (13) La Tabla 2 muestra el tipo de fitoquímicos que pueden ser extraídos
utilizando solventes de distintas polaridades.

c. Temperatura: el aumento de temperatura favorece la extracción de principios activos

de las drogas porque aumenta su solubilidad en los disolventes utilizados, pero a su
vez puede favorecer la degradación de dichos principios activos, por lo que es
necesario controlarla para conseguir una máxima extracción sin consecuencias
indeseables para los principios activos. En ningún caso se pueden utilizar
temperaturas elevadas para la extracción de principios activos termolábiles.

Tabla 2. Tipos de fitoquímicos extraídos según distintos solventes y sus polaridades (18)

Polaridad Solvente Fitoquímico extraído

Baja Cloroformo Terpenoides, flavonoides, alcaloides,
agliconas
Ciclohexano Ceras, grasas
Hexano Ceras, grasas
Diclorometano Terpenoides, flavonoides, agliconas
Dietiléter Alcaloides, agliconas
Etilo acetato Terpenoides, flavonoides, agliconas
Acetona Flavonoles, Alcaloides, agliconas
Media Etanol Taninos, polifenoles, flavonoles,
terpenoides, esteroles, alcaloides,
poliacetilenos, propóleos
Metanol Saponinas, taninos, fenonas, flavonas,
azúcares, aminoácidos, antoacianinas,
terpenoides, xantofilinas, totarol,
quasinoides, lactonas polifenoles
Alta Agua Azúcar, aminoácidos, saponinas,
taninos, lectinas, terpenoides,
antocianinas, almidones, polipéptidos

14
_____________________________________________________________________________Introducción

d. Tiempo de contacto entre la droga y el disolvente: depende de las características de

la droga y de la naturaleza de los principios activos. (6)

Los diferentes tipos de extracciones se pueden englobar en dos grupos: extracciones

discontinuas y extracciones continuas.

1.3.2.1 Extracciones discontinuas o simultáneas.

Se sumerge la droga en el disolvente, por lo que la totalidad de la droga contacta con el

disolvente utilizado para la extracción y la difusión de principios activos se producirá en
todas direcciones hasta alcanzar el equilibrio.

1.3.2.1.1 Maceración

En este proceso, se sumerge el material vegetal grueso o en polvo en un contenedor tapado

que contiene el solvente (generalmente agua, glicerina o mezclas hidroalcohólicas) y se deja
reposar con agitación frecuente y a temperatura ambiente durante un tiempo determinado
(normalmente días). El proceso intenta suavizar y romper la pared celular de las plantas para
así liberar los fitoquímicos solubles. Transcurrido el tiempo de espera, la mezcla es filtrada,
el marco (el material sólido desechado) es presionado, y los líquidos combinados son
clarificados por filtración o decantación después de detenerse. (17)

1.3.2.1.2. Infusión

Las infusiones frescas se preparan mediante la maceración de la droga cruda durante un corto
período de tiempo con agua fría o hirviendo. Estas son soluciones diluidas de los
constituyentes fácilmente solubles de las drogas crudas.

Se trabaja con un disolvente (agua) a temperatura próxima a la ebullición, en el que se

introduce la droga que se quiere extraer y a continuación se deja enfriar el conjunto hasta
temperatura ambiente (17)

15
_____________________________________________________________________________Introducción

1.3.2.1.3. Decocción

En este proceso, la droga cruda se hierve en un volumen específico de agua durante un tiempo
definido, luego se presiona o filtra. La proporción inicial de droga cruda y agua es fija, por
ejemplo 1:4 o 1:16, el volumen luego se reduce a un cuarto de su volumen original
hirviéndolo durante el proceso de extracción. Luego el extracto concentrado se filtra y se usa
como tal o se procesa aún más. (17)

Se pone en contacto la droga con el disolvente (agua) y el conjunto se lleva hasta la

temperatura de ebullición, manteniendo dicha ebullición durante 15-30 minutos. Una vez
enfriado, se filtra y exprime el residuo.

Tanto en las infusiones como en las decocciones el solvente es agua, por lo cual este método
no es adecuado para extraer principios activos hidrolizables. Además, los extractos acuosos
que se obtienen son inestables, de ahí la conveniencia de preparar las infusiones y las
decocciones en el momento en que se van a utilizar. (6)

1.3.2.2. Extracción continua o progresiva

El disolvente utilizado para la extracción se va renovando y actúa en una sola dirección. Son
métodos que consisten en poner en contacto la droga con el disolvente adecuado y mantener
en todo momento el desequilibrio entre la concentración del principio activo en la droga y en
el disolvente para que se produzca difusión celular. Mediante estos procesos se puede llegar
a la extracción prácticamente completa de los principios activos de las drogas. (6)

1.3.2.2.1 Percolación
Es el procedimiento utilizado con más frecuencia para extraer ingredientes activos en la
preparación de tinturas o extractos fluidos. Se utiliza un percolador (un recipiente estrecho
con forma de cono abierto por ambos costados). Los ingredientes sólidos son humedecidos
con una cantidad apropiada del solvente específico y se dejan reposar durante
aproximadamente cuatro horas en un recipiente bien cerrado, después de que la masa haya
sido comprimida y la parte superior del percolador haya sido cerrada. Se agrega solvente
adicional hasta formar una capa superficial sobre la masa y la mezcla se deja macerar en el
percolador cerrado durante un día. La salida del percolador es abierta y el líquido contenido

16
_____________________________________________________________________________Introducción

se deja gotear lentamente. Se agrega solvente adicional según sea necesario, hasta que el
percolado mida sobre tres cuartos del volumen requerido del producto final. El marco es
presionado y el líquido exprimido es añadido al percolado. Se agrega suficiente solvente para
producir el volumen requerido, el líquido mezclado se clarifica por filtración o dejándolo
decantar. (17)

1.3.2.2.2 Extracción continua en caliente (extracción Soxhlet)

El extractor Soxhlet (esquematizado en la Figura 6) fue propuesto por primera vez por el
químico alemán Franz Ritter von Soxhlet en 1879. Fue diseñado principalmente para la
extracción de lípidos, pero ahora no está limitado solamente para ese propósito. La extracción
Soxhlet ha sido ampliamente usada para la extracción de valiosos compuestos bioactivos
desde varias fuentes naturales. Es usado como modelo para la comparación de nuevas
alternativas de extracción. Generalmente, una pequeña cantidad de muestra seca es ubicada
en una bolsa porosa o dedal. El dedal es ubicado en un matraz de destilación que contiene el
solvente de interés. Luego de alcanzar un nivel de sobreflujo, el solvente dentro del extractor
es aspirado por un sifón. El sifón descarga la solución de vuelta en el matraz de destilación.
El soluto permanece en el matraz de destilación y el solvente pasa de vuelta al lecho sólido
de la planta. El proceso se lleva a cabo repetidamente hasta que la extracción esté completada.
(19)

Figura 6. Esquema de un extractor Soxhlet. (19)

17
_____________________________________________________________________________Introducción

1.4. Técnicas de separación, identificación y caracterización de compuestos bioactivos

Debido al hecho de que los extractos de plantas usualmente ocurren como una combinación
de varios tipos de compuestos bioactivos o fitoquímicos con diferentes polaridades, su
separación sigue siendo un gran desafío para los procesos de identificación y caracterización
de compuestos bioactivos. Es una práctica común en el aislamiento de dichos compuestos
bioactivos que varias técnicas de separación diferentes tales como, la cromatografía en capa
fina (CCF o TLC del inglés thin layer chromatography), cromatografía en columna (CC),
cromatografía flash, cromatografía Sephadex y HPLC (high performance liquid
chromatography), sean usadas para obtener compuestos puros. (20)

1.4.1 Cromatografía

Cromatografía es un término colectivo para una serie de técnicas de laboratorio que tiene
como fin la separación de una mezcla en sus componentes. (21). La cromatografía se basa en
el principio de que las moléculas contenidas en una mezcla se aplican sobre la superficie o
sobre el sólido de la fase estacionaria, la fase móvil fluye a través de la fase estacionaria y
transporta los componentes de la mezcla con ella. Estas fases se componen de la siguiente
manera:

 Fase estacionaria: Está compuesta de una fase “sólida” o “una capa de un líquido
adsorbido en la superficie de un soporte sólido”.
 Fase móvil: Está compuesta de un “líquido” o de un componente gaseoso

Los factores efectivos para este proceso de separación incluyen las características
moleculares relacionadas a la adsorción (líquido-sólido), partición (líquido-sólido) y afinidad
o diferencia entre sus pesos moleculares. (22) Las diferencias de afinidades entre las distintas
partes están manejadas por dos propiedades del átomo: Adsorción y disolubilidad. Adsorción
es la propiedad de qué tan bien una parte de la mezcla se adhiere a la fase estacionaria,
mientras que la disolubilidad es la propiedad de qué tan bien un segmento de la mezcla se
desintegra en la fase móvil. (23) Debido a estas diferencias, algunos componentes en las
mezclas permanecen mayor tiempo en la fase estacionaria, y se mueven lentamente en el
sistema cromatográfico, mientras que otros pasan rápidamente a la fase móvil y eluyen del

18
_____________________________________________________________________________Introducción

sistema más rápido. (22) En la Tabla 3 se muestran algunos ejemplos de dichas propiedades
y el tipo de cromatografía correspondiente, según estas propiedades.

Tabla 3. Técnicas cromatográficas utilizadas para separar biomoléculas según sus propiedades
específicas. (24)

Propiedad Cromatografía Esquema

Tamaño Filtración en gel (GF: gel filtration),

también conocida como
cromatografía de exclusión por
tamaño

Hidrofobicidad Cromatografía de interacción

hidrofóbica (HIC: hydrophobic
interaction chromatography).
Cromatografía en fase reversa
(RPC: reversed phase
chromatography)
Carga Cromatografía de intercambio iónico
(IEX: ion Exchange
chromatography)

Bioreconocimiento (especificidad Cromatografía de afinidad

ligando) (AC: affinity chromatography)

Punto isoeléctrico Cromatoenfoque (chromatofocusing)

19
_____________________________________________________________________________Introducción

1.4.1.1. Cromatografía en capa fina (CCF)

La cromatografía en capa fina es una cromatografía del tipo “adsorción sólido-líquido” que
puede tener carácter cuantitativo o cualitativo. La CCF es un procedimiento simple, rápido y
de bajo costo que otorga rápidas respuestas acerca de cuántos componentes hay en una
mezcla. (20) Utiliza placas de vidrio, metal o plástico que están cubiertas con la fase
estacionaria, siendo más común la sílica gel. Pequeñas gotas de la mezcla que está siendo
investigada se siembran sobre la base de la placa que sea utilizada, luego la placa es puesta
dentro de una cámara o tanque con la fase móvil, que puede ser agua, etanol, una mezcla de
solventes, etc. El solvente o mezcla de solventes se estira a través de las partículas en la placa
gracias a la acción capilar, y a medida que el solvente se mueve sobre la mezcla, cada
compuesto permanecerá en la fase estacionaria o se disolverá en el solvente y se subirá por
la placa. Que los compuestos suban por la placa o permanezcan en el sólido depende de las
propiedades físicas de cada componente individual y por lo tanto de su estructura molecular,
especialmente de sus grupos funcionales. (21)

La cromatografía en capa fina es utilizada también para determinar el solvente apropiado

para realizar separaciones utilizando una cromatografía en columna. (23)

1.4.1.2. Cromatografía en columna (CC)

La cromatografía en columna es otra técnica de separación común y útil en la química

orgánica. Involucra el mismo principio que la cromatografía en capa fina, pero puede separar
mayores cantidades de muestra, debido a que la fase estacionaria se encuentra empaquetada
en una columna de vidrio que acepta mayores cantidades de fase móvil en comparación a la
CCF.

Desde la introducción de Sephadex hace más de 50 años atrás, la filtración en gel ha jugado
un rol clave en la purificación de proteínas y enzimas, polisacáridos, ácidos nucleicos y otras
macromoléculas biológicas. (24)

Sephadex LH-20 está hecho de perlas de dextrano hidroxipropilado que han sido reticuladas
para producir una red de polisacáridos. Sephadex LH-20 fue especialmente diseñado para la

20
_____________________________________________________________________________Introducción

separación y purificación de productos naturales incluyendo moléculas como esteroides,

terpenoides, lípidos y péptidos de bajo peso molecular que requieren la presencia de solventes
orgánicos (metanol, etanol, cloroformo, acetona, etc.) para mantener su solubilidad. Los
compuestos usualmente son separados por una forma de partición líquido/líquido o por
cromatografía de adsorción. Sephadex LH-20 exhibe propiedades hidrofílicas e hidrofóbicas,
cuya combinación puede ofrecer una selectividad cromatográfica única para ciertas
aplicaciones. (24)

1.4.1.3 Cromatografía de gases (GC)

La cromatografía de gases es el método más útil, simple, multifacético, altamente sensible y

de rápida aplicación para el análisis de compuestos no polares, volátiles y altamente volátiles,
que estén en cantidades traza y que sean orgánicamente extraíbles. (25) La cromatografía de
gases es una cromatografía “gas-líquido”, por lo tanto, las especies se distribuyen entre una
fase líquida y una fase gaseosa. En este método, la fase móvil es un gas portador, usualmente
un gas inerte como el helio (He) o un gas no reactivo como el nitrógeno molecular (N2), y la
fase estacionaria es una capa microscópica de líquido o polímero sobre un soporte sólido
inerte, dentro de un tubo de vidrio o metal, llamado columna. (26) La fase móvil pasa a través
de la columna sometida a altas presiones. La muestra por analizar es vaporizada, y entra en
una fase móvil gaseosa. Los componentes contenidos en la muestra son dispersados entre la
fase móvil y la fase estacionaria sobre el soporte sólido. (22) La tasa de migración depende
de qué tantas especies químicas estén distribuidas en la fase líquida. Mientras mayor sea el
porcentaje de material en estado gaseoso más rápida será la migración. La cromatografía de
gases otorga la cantidad total de vapor, por lo tanto, es la más utilizada para el análisis
cuantitativo. (27)

1.4.2 Espectrometría de Masas (MS)

El primer paso en la espectroscopía de masas es convertir el compuesto a ser analizado en
moléculas en estado cargado (iones) en fase gaseosa, lo que se conoce como ionización.
Todos estos iones son separados en el espectrómetro de masas de acuerdo con su relación
masa/carga y detectados en proporción a su abundancia. (28) De esta forma se produce un
espectro de masas que proporciona como resultado un diagrama de abundancia de iones

21
_____________________________________________________________________________Introducción

versus la relación masa/carga y que puede ser representado como un gráfico o como una
tabla, como representa la Figura 7:

Figura 7. Espectro de masas de metanol obtenido por ionización electrónica (28)

El peak más intenso se llama peak base y es arbitrariamente asignado con la abundancia
relativa del 100%. Las abundancias del resto de los peak son entregadas en valores
proporcionales como porcentajes del peak base.

Un espectrómetro de masas siempre contiene los siguientes elementos representados en la

Figura 8: una entrada de muestra para introducir el compuesto que se analiza, por ejemplo,
un cromatógrafo de gases o una sonda de inserción directa; una fuente de ionización para
producir iones a partir de una muestra; uno o varios analizadores para separar los diversos
iones; un detector para contar los iones emergentes desde el último analizador; y finalmente
un sistema de procesamiento de datos que produce el espectro de masas en una forma
adecuada. Sin embargo, algunos espectrómetros de masas combinan la entrada de muestra y
la fuente de ionización y otros combinan el analizador de masas y el detector. Todos los
espectrómetros de masas deben funcionar bajo alto vacío (baja presión). Esto es necesario
para permitir que los iones lleguen al detector sin sufrir colisiones con otras moléculas
gaseosas. De hecho, las colisiones producirían una desviación de la trayectoria y el ión
perdería su carga con las paredes del instrumento. (28)

22
_____________________________________________________________________________Introducción

Figura 8. Diagrama básico de un espectrómetro de masas. (28)

Un espectrómetro de masas debe realizar siempre los siguientes procesos:

1. Producir iones desde la muestra en la fuente ionizadora

2. Separar estos iones de acuerdo con su relación masa/carga en el analizador de masas
3. Eventualmente, fragmentar los iones seleccionados y analizar los fragmentos en un
segundo analizador
4. Detectar los iones emergentes desde el último analizador y medir su abundancia con
el detector que convierte los iones en señales eléctricas
5. Procesar las señales del detector que son transmitidas a la computadora y controlar el
instrumento a través de la retroalimentación. (28)

23
_____________________________________________________________________________Introducción

1.4.3. Cromatografía de gases y Espectrometría de masas (GC-MS)

Es la combinación de dos técnicas analíticas diferentes, la cromatografía de gases y la
espectrometría de masas. Se utiliza para analizar mezclas orgánicas y bioquímicas complejas.
El instrumento GC-MS consiste en dos componentes principalmente que se muestran en la
Figura 9: la porción de cromatografía de gases separa los diferentes compuestos de la
muestra en pulsos de productos químicos puros en función de su volatilidad, haciendo fluir
un gas inerte (fase móvil) que transporta la muestra, a través de una fase estacionaria fija en
la columna. Los espectros de los compuestos se recogen cuando salen de la columna
cromatográfica mediante el espectrómetro de masas, que identifica y cuantifica los productos
químicos según su relación masa/carga (m/z). Estos espectros pueden almacenarse en la
computadora y analizarse. (29)

Figura 9. Diagrama esquemático de GC-MS. (29)

1.4.4. Cromatografía líquida de alta resolución (CLAR)

Cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) ó High pressure liquid chromatography
por sus siglas en inglés HPLC, es una técnica cromatográfica versátil, robusta y ampliamente
utilizada para el aislamiento de productos naturales. Es una forma específica de
cromatografía en columna que puede separar mezclas de compuestos y es utilizada en
fitoquímica y química analítica para identificar, cuantificar y purificar los componentes
individuales presentes en los compuestos activos. (25)

Esta técnica utiliza principalmente una columna compacta que contiene la fase estacionaria,
una bomba que mueve la fase móvil a través de la columna y un detector que muestra los

24
_____________________________________________________________________________Introducción

tiempos de retención de las moléculas. Los tiempos de retención (tiempo que tarda un analito
en específico en eluir de la columna cromatográfica) varían dependiendo de las interacciones
entre la fase estacionaria, las moléculas que están siendo analizadas y el/los solventes
utilizados. La muestra por analizar es introducida en un pequeño volumen al flujo de la fase
móvil y es retardado por interacciones físicas o químicas específicas con la fase estacionaria.
El equipo HPLC separa los compuestos en función de su interacción con partículas sólidas
presentes en la columna compacta y el disolvente de la fase móvil (los más comunes incluyen
mezclas de agua y líquidos orgánicos siendo el más común metanol y acetonitrilo). La
separación es realizada de forma que la composición de la fase móvil varíe durante el análisis,
esto se conoce como gradiente de elución. El gradiente separa el analito en función de la
afinidad que posea por la fase móvil. (30) Se requieren altas presiones de hasta 400 bar para
eluir el analito a través de la columna antes de que pase por el detector. (27) Existen varias
formas de detectar una sustancia cuando ha atravesado la columna, generalmente se adjunta
espectroscopía UV, la cual detecta compuestos específicos, dado que muchos compuestos
orgánicos absorben luz UV en distintas longitudes de onda. La salida del analito de la
columna se registra como una serie de picos, cada uno representa un compuesto en la mezcla
que pasa a través del detector y absorbe luz UV. El área debajo del pico es proporcional a la
cantidad de analito que pasa a través del detector y ésta puede calcularse automáticamente
mediante una computadora. (30)

1.4.4.1. Detector de diodos

En un espectrómetro con detector de diodos, todas las longitudes de onda se registran

simultáneamente, lo que permite la adquisición rápida del espectro o una mayor relación
señal/ruido, o una combinación de ambos. En el espectrómetro con detector de diodos la luz
blanca (con todas las longitudes de onda) pasa a través de la muestra. La luz luego entra en
un policromador, que dispersa la luz en las longitudes de onda de los componentes y dirige
la luz a la matriz de diodos. Cada diodo recibe una longitud de onda diferente, y todas las
longitudes de onda se miden simultáneamente. La Figura 10 muestra esquemáticamente el
paso de la luz por las distintas partes del espectrómetro hasta la llegada a cada diodo del
detector. La resolución depende de cuán espaciados estén los diodos y cuánta dispersión
produce el policromador. (31)

25
_____________________________________________________________________________Introducción

Figura 10. Diseño esquemático de un espectrómetro con detector de diodos (31)

El HPLC es útil para compuestos que no pueden ser vaporizados o que se descomponen a
altas temperaturas y proporciona información analítica cuantitativa y cualitativa en una sola
operación. (27) Para obtener una separación óptima de cada compuesto, el cromatógrafo debe
escoger las condiciones apropiadas, tales como, la fase móvil apropiada, la tasa de flujo,
detectores adecuados y columnas, basado en el hecho de que cada compuesto posee un peak
característico bajo ciertas condiciones cromatográficas.

1.4.5. Cromatografía líquida de alta resolución/Espectrometría de masas (HPLC/MS)

La HPLC/MS es una poderosa técnica analítica que combina el poder de separación del
HPLC con la gran selectividad, sensibilidad y precisión en la determinación de la masa
molecular de la espectrometría de masas, proporcionando información cualitativa y
cuantitativa.

El acoplamiento de un detector de espectrometría de masas a un sistema de separación de

alta resolución cromatográfica (HPLC/MS) permite que la muestra separada en el HPLC pase
al espectrómetro de masa a través de una interfaz donde son ionizados. Dicho acoplamiento
aplica una tecnología diferente para resolver dos problemas principales que planteó este tipo
de conexión: (32) el primer problema, fue superar la dificultad que significaba la entrega de
la fase móvil líquida hacia el espectrómetro de masas a una velocidad de flujo de 1 ml/min y
aun así mantener las condiciones de alto vacío requeridas para el análisis de los iones del

26
_____________________________________________________________________________Introducción

soluto. El segundo problema fue cómo generar iones en fase gaseosa a partir de los solutos
en la fase móvil líquida y cómo transferirlos al espectrómetro de masas. (33)

Las primeras técnicas comercializadas presentaban ciertas dificultades fundamentalmente a

su baja sensibilidad y su falta de robustez, sin embargo, la introducción de la interfase
denominada API (Atmospheric Pressure Ionization) engloba todas las técnicas en la que los
iones se forman a presión atmosférica y presenta ciertas ventajas: el volumen de fase móvil
utilizado en API se acerca más a los valores típicamente utilizados en cromatografía líquida;
las técnicas API son adecuadas para el análisis de compuestos no volátiles, polares y
termolábiles; el acoplamiento API-MS proporciona alta sensibilidad; y los sistemas API son
muy estables y relativamente fáciles de manejar. (32)

Una fuente API consta de cuatro componentes básicos:

- Dispositivo de introducción de muestra

- Cámara de ionización, en donde se generan los iones mediante ionización (interfase)
- Cono de muestreo (orificio de entrada de iones)
- Sistema de transferencia de iones, en el que éstos son transportados hacia la región
de alto vacío del MS.

En las técnicas API los iones formados a presión atmosférica son transportados desde la
fuente a las regiones de alto vacío del analizador a través de diferentes etapas de vacío
separada por diferentes lentes y éstos son guiados a través de los orificios de los lentes hacia
el interior del espectrómetro de masas gracias a la aplicación de campos eléctricos adecuados,
como se muestra en la Figura 11.

27
_____________________________________________________________________________Introducción

Figura 11. Esquema general de una interfase de Ionización química a Presión atmosférica
(API) acoplada a un espectrómetro de masas (32)

Dentro de las técnicas API se diferencian dos modalidades de interfase que han logrado
mayor éxito analítico: ESI (Electrospray Ionization) y APCI (Atmospheric, Pressure
Chemical Ionization) (32)

1.4.5.1. Ionización química a presión atmosférica (APCI)

Utilizando una sonda el líquido que procede del HPLC es nebulizado y rápidamente
evaporado por la acción de una alta temperatura (300-500°C), teóricamente ciertos analitos
son degradados a esa temperatura, pero los altos flujos de gas de nebulización y de N2 coaxial
(gas make-up) previenen la ruptura de las moléculas, además el tiempo que permanecen las
moléculas a dicha temperatura es muy pequeño. De esta forma los iones que están presentes
en la disolución pueden pasar a fase gaseosa.

28
_____________________________________________________________________________Introducción

Para incrementar el proceso de ionización se suele aplicar una descarga en corona del orden
de los 2-6 kV, justo a la salida de la sonda de APCI en el spray. La mezcla de líquido y vapor
calientes se expande en la interfase a presión atmosférica, donde se produce una primera
ionización mediante la descarga en corona. Los iones formados a partir de las moléculas del
solvente transfieren su carga a los analitos, produciéndose así su ionización química, esto se
representa en la Figura 12 (32)

Figura 12. Fuente de API-ionización química a presión atmosférica (32)

1.4.5.2. Ionización por Electrospray (ESI)

En la ESI las muestras líquidas son bombeadas a través de un capilar metálico mantenido a
3-5 kV y se nebulizan en la punta del capilar para formar una fina pulverización de gotas
cargadas. El capilar es usualmente ortogonal (o fuera del eje) a la entrada del espectrómetro
de masas con el fin de minimizar la contaminación. Las gotitas se evaporan rápidamente
mediante la aplicación de calor y nitrógeno seco, y la carga residual en las gotitas se transfiere
a los analitos. Los analitos ionizados se transfieren luego al alto vacío del espectrómetro de
masas a través de una serie de pequeñas aberturas y voltajes de enfoque. (32) Para entender
mejor esta explicación, la Figura 13 muestra los elementos básicos de una fuente API-ESI.

29
_____________________________________________________________________________Introducción

Figura 13. Elementos básicos que constituyen una configuración representativa de una
fuente API-electrospray (32)

30
_____________________________________________________________________________Introducción

1.5. Antecedentes de Schinus molle var. areira L. (DC)

1.5.1. Clasificación taxonómica

El género Schinus pertenece al Reino Plantae, a la Clase Magnoliopsida, Subclase Rosidae,

Orden Sapindales, Familia Anacardiaceae. (34)

La Familia Anacardiaceae posee más de 70 géneros y 600 especies, distribuidas en regiones

tropicales y subtropicales de todo el mundo, con pocas especies en zonas templadas. (35)

En el género Schinus existen unas 30 especies, todas sudamericanas. (36) Este género
presenta 9 especies en Chile, todas integrantes de bosques y matorrales esclerófilos de Chile
central: Schinus kaseii F.A Barkley., Schinus latifolius (Gillies ex Lindl.) Engl., Schinus
marchandii F.A Barkley., Schinus molle (L.) DC. var. rusbyi F.A Barkley., Schinus montana
Engl., Schinus patagonicus (Phil.) I.M. Johnst, Schinus pearcei Engl., Schinus polygama
(Cav.) Cabrera., Schinus velutinus (Turcz.) I.M. Johnst. (37)

En Chile existen dos variedades de S. molle: S. molle. var. areira (L.) DC. (Figura 14) y S.
molle var. rusbyi Barkley. (34)

Existen dos especies del género Schinus estrechamente relacionadas desde el punto de vista
taxonómico: S. molle L. y S. areira L. (Schinus molle var. areira L. (DC)). Si se revisa
bibliografía existente, la mayoría de los autores se refieren a estas plantas identificándolas
como S. molle. Sin embargo, Linneo en el año 1753 diferenció ambas especies, mientras que
De Candolle en 1825 redujo la S. areira a una variedad de S. molle y la clasificó como S.
molle var. areira. (38) Situación que persiste hasta mediados del siglo XX: Cabrera y Fred
Barkley afirman que la planta conocida como S. areira L. era considerada hasta hace poco
como la variedad areira de la especie Schinus molle L. En mitad del siglo XX estudios
taxonómicos y biométricos de Martinez Crovetto R. presentan a S. areira (Schinus molle var.
areira L. (DC)) y S. molle como dos especies distintas y diferenciables. (36)

Sinónimos: Schinus molle var. areira L. (DC) Schinus angustifolius Sessé et Moc., Schinus
bituminosus Salisb, Schinus molle L. var hiungan (Mol.) March., Schinus occidentalis Sessé
et Moc., (34)

31
_____________________________________________________________________________Introducción

Nombres vernáculos: molle, muelle, pimiento, pimentero. (34)

Figura 14. Especie vegetal Schinus molle var. areira L. (DC) en su hábitat natural. (39)

1.5.2. Descripción botánica

Es un árbol perennifolio de 4-8 m de altura, de copa redondeada y abierta que proporciona

sombra moderada, frecuentemente distribuido en regiones secas (1900-3300m) (39) Son
árboles de corteza color marrón oscuro, rugosa y fisurada, la cual exuda una savia lechosa al
ser dañada, sus ramas son flexibles y colgantes, como se observa en la Figura 15 las hojas
son imparipinnadas compuestas, glabras, de forma lanceolada y de folíolos generalmente
apareados color verde amarillento; sus flores son panículas color amarillento, muy pequeñas
(de 6mm aproximadamente) y numerosas y sus frutos son drupas en racimos colgantes, de
alrededor de 7 mm de diámetro, color rosado o rojizo, cada uno contiene una o dos semillas.
(38)

32
_____________________________________________________________________________Introducción

Figura 15. Hojas, flores y frutos de Schinus molle var. areira L. (DC). (39)

1.5.3. Hábitat y distribución geográfica

Schinus molle L. var. areira (L.) DC. es una especie nativa de Bolivia, del sur de Brasil,
Paraguay y del norte de Argentina, aunque actualmente se está estableciendo en las regiones
más templadas del mundo, siendo distribuida de manera muy temprana por los colonos
españoles como ornamental en México, América central y el sur de los Estados Unidos. En
Chile, donde el molle se cultiva, las plantaciones se distribuyen desde el límite norte hasta la
Región Metropolitana. (40)

El hábitat natural de S. areira L. es la región de los Andes, es propio de las regiones cálidas
y secas de Sudamérica, principalmente Perú. Vive en las laderas occidentales de la región
interandina, vertientes occidentales de los andes peruanos, en la costa y en sus valles. (41)
Se encuentra en altitudes hasta 3900m de altura, en áreas con 300-700mm lluvia por año.
Tolera altas temperaturas y una vez establecido es extremadamente resistente a las sequías,
a los climas fríos también es resistente pero no por períodos largos. (42)

33
_____________________________________________________________________________Introducción

1.5.4. Usos y propiedades terapéuticas

En el aspecto medicinal esta especie es muy utilizada. Su resina blanquecina es usada en

América del Sur como goma de mascar, se dice que fortalece las encías y sana las úlceras de
la boca. La cocción de la corteza se usa como remedio en pies hinchados y como purgante
para animales domésticos; mezclada la corteza junto con las hojas, se utiliza para combatir
la hinchazón y dolor en el tratamiento de enfermedades venéreas. La emulsión de la goma se
usa para tratar cataratas y manchas de las córneas de los ojos. El fruto para el tratamiento de
la gonorrea y jarabe para la bronquitis. Las semillas se usan para adulterar la pimienta por su
sabor semejante. El molle se emplea en las llamadas “limpias” o “barridos”, para curar el mal
de aire, susto y espanto. El aceite esencial de las hojas frescas posee actividad antibacteriana,
antiviral, antifúngica y antimicrobiana. En cuanto a otros usos, el cocimiento de hojas, ramas,
corteza y raíz se emplea para el teñido amarillo pálido de tejidos de lana. La corteza sirve
para teñir pieles. De las hojas se extrae un aceite aromatizante que se usa en enjuagues
bucales y como dentífrico. Las semillas contienen aceites de los cuales se obtiene un fijador
que se emplea en la elaboración de perfumes, lociones, talcos y desodorantes. En el aspecto
forrajero es un importante alimento para pájaros. La madera de esta especie se utiliza para
fabricar implementos de trabajo, tales como mangos de herramientas, estacas, enseres rurales
y fustes de sillas de montar. La resina se podría utilizar en la fabricación de barnices. Su
ceniza rica en potasa se usa como blanqueador de ropa, así como en la purificación del azúcar
(43)
Se emplean las hojas y la corteza en infusión para el tratamiento de la bronquitis y en especial
para el asma, en malestares reumáticos, hepáticos o estomacales; también se utilizan para
regular el ciclo menstrual; las hojas frescas o hervidas se usan como cataplasmas para tratar
el reumatismo, la ciática, la hinchazón de las extremidades y para curar heridas. (40)

34
_____________________________________________________________________________Introducción

1.5.5. Efectos farmacológicos de S. areira L.

El aceite esencial de S. molle var. areira L. (DC.) posee actividades citotóxicas y alergénicas.
Además, tiene efectos antibacterianos (Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus) y
antimicótico (Microsporum gypseum, Aspergillus niger), mientras que los frutos tienen
actividad hipotensora y estimulante de la contracción uterina. Estudios farmacológicos con
extractos de hojas, realizados in vitro mediante fraccionamientos bioguiados, han conducido
al aislamiento de triterpenos esteroidales del tipo eufano con actividad inhibitoria sobre la
enzima convertidora de angiotensina (ECA). El uso de inhibidores de ECA en el tratamiento
de la hipertensión es una terapia bien establecida en la medicina moderna, cuya principal
acción farmacológica es la vasodilatación que reduce la presión arterial al disminuir la
resistencia vascular periférica. (34)

35
__________________________________________________________________________Objetivos

2. OBJETIVOS

36
__________________________________________________________________________Objetivos

2.1 Objetivo general

Identificar los compuestos fitoquímicos presentes en fracciones purificadas provenientes
de las hojas de S. areira L.

2.2 Objetivos específicos

- Obtener extractos crudos a partir de hojas de S. areira L.

- Llevar a cabo una marcha fitoquímica de fraccionamiento de los extractos crudos
- Identificar cualitativamente los distintos metabolitos primarios y secundarios
presentes en las fracciones obtenidas

- Purificar las fracciones de interés obtenidas mediante técnicas cromatográficas

- Separar e identificar mediante HPLC/MS los compuestos fitoquímicos en las
fracciones de interés

37
__________________________________________________________________________Metodología

3. METODOLOGÍA

38
__________________________________________________________________________Metodología

3.1 Reactivos y equipos

3.1.1. Reactivos
Acetato de Etilo p.a. (Merck) Hidróxido de Sodio p.a. (Winkler)
Ácido fórmico (ISN) Nihindrina (Merck)
Ácido clorhídrico p.a. (Merck) Metanol (J.T. Baker)
Ácido sulfúrico p.a. (Arquimed) Reactivo Dragendorff
Agua destilada Reactivo Liebermann-Burchard
Anhídrido acético (J.T. Baker) Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich)
Amoníaco (Merck) Sulfato de sodio anhidro (Sigma-Aldrich)
Cloroformo p.a (J.T. Baker)
Cinta de Magnesio
Etanol 96° (Health Equipment Supply)
Cloruro de hierro (III) (ISN)
Fehling A
Gelatina 0.5% (Winkler)
3.1.2 Equipos
 Balanza analítica FA2004
 Baño termorregulado, modelo HS-2
 Batidora manual (Minipimer) Phillips, modelo HR1366
 Columna Phenomenex Kinetex Biphenyl (100mm x 2.10mm x 2.6um)
 Detector de diodos Accela
 Espectrómetro de masas LTQ Orbitrap
 Estufa de secado, Memmert Ule-600
 HPLC ThermoScientific LTQ Orbitrap Discovery con Software XCalibur v. 2.0
 Lámpara UV/Vis, Spectroline, modelo CM10-A
 Micropipetas Jetpip 20-1000 µL
 Rotavapor, Stuart, modelo RE300
 Liofilizador HES, Modelo BK-FD18S

39
__________________________________________________________________________Metodología

3.2 Obtención de extractos crudos

El estudio basado en una marcha fitoquímica consiste en efectuar una extracción (del material
previamente colectado, secado y molido) que permita obtener la mayor parte de los
constituyentes químicos (extracto total o crudo). Por ello se debe utilizar un solvente
universal que solubilice la mayoría de los compuestos, siendo los más utilizados el metanol
y el etanol. Posteriormente el extracto total se fracciona mediante un cambio de pH y
partición con solventes de menor polaridad (generalmente cloroformo), obteniéndose una
serie de fracciones sobre las que se realizan ensayos que permitirán obtener datos sobre los
grupos fitoquímicos presentes.

3.2.1 Recolección de hojas de S. areira L.

El material vegetal, correspondiente a hojas y frutos de Schinus molle var. areira L. (DC),
fue recolectado durante horas de la mañana, en el mes de noviembre del 2017 en la localidad
de Los Molles perteneciente a la comuna de La Ligua, provincia de Petorca, ubicada en la
quinta región de Valparaíso.

3.2.2 Secado

Las hojas y frutos de Schinus molle var. areira L. (DC) fueron secadas en el laboratorio de
investigación de la Universidad Andrés Bello, en primera instancia al aire libre durante 7 días
y posteriormente a 40°C durante un período de 6 horas.

3.2.3 Molienda

Las hojas de Schinus molle var. areira L. (DC) fueron separadas de los frutos y de las ramas.
El material vegetal seco fue posteriormente pulverizado utilizando una batidora manual
(minipimer Phillips).

3.2.4 Extracción discontinua por maceración

Se preparó un extracto crudo a partir del material vegetal seco y molido de Schinus molle
var. areira L. (DC). Se pesaron 30,12 g de material vegetal en un vaso de 250ml tarado
previamente, los cuales fueron macerados a 65°C en un baño termorregulador durante un

40
__________________________________________________________________________Metodología

período de dos horas y media utilizando etanol 96° en cantidades suficientes para embeber y
cubrir la droga durante dicho período.

3.3 Fraccionamiento de los extractos crudos y cálculo de rendimientos

Se realizó una marcha fitoquímica con el fin de separar el extracto crudo en cuatro fracciones
distintas: A, B, C y D, las cuales poseen diversos metabolitos secundarios que serán
identificados por medio de un tamizaje fitoquímico a través de técnicas de laboratorio
estandarizadas en Monografías de la OMS y Farmacopeas. Dicha marcha fitoquímica se
esquematiza en la Figura 16.

3.3.1 Cálculo de rendimientos

Se calculó el rendimiento del extracto crudo, dejando evaporar completamente el etanol
presente en el extracto, luego se pesó la cantidad de extracto crudo sin solvente y se utilizó
la Ecuación 1 para obtener el resultado.

Ecuación 1. Porcentaje de rendimiento del extracto crudo

𝒈 𝒅𝒆 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒐 𝒄𝒓𝒖𝒅𝒐
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 = 𝒙𝟏𝟎𝟎
𝒈 𝒅𝒆 𝒎𝒂𝒕𝒆𝒓𝒊𝒂𝒍 𝒗𝒆𝒈𝒆𝒕𝒂𝒍 𝒔𝒆𝒄𝒐

Se calculó el rendimiento de cada fracción obtenida (A, B, C y D) tomando el peso del

extracto crudo sin etanol (100%). Cada fracción fue rotaevaporada a excepción de la
Fracción D, la cual es acuosa y tuvo que ser liofilizada (ver Anexo 1). Para obtener el
rendimiento de cada fracción respecto al extracto crudo total se utilizó la Ecuación 2.

Ecuación 2. Porcentaje de rendimiento de cada fracción respecto al extracto crudo

𝒈 𝒅𝒆 𝑿 𝒇𝒓𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 = 𝒙𝟏𝟎𝟎
𝒈 𝒅𝒆 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒐 𝒄𝒓𝒖𝒅𝒐

41
 __________________________________________________________________________Metodología

Pesar 30-50 g de droga seca y

molida

Maceración a 65°C, 2.5h,

utilizar etanol 96° c.s.p
embeber y cubrir droga.
Filtrar en caliente
Filtrado = Extracto crudo Marco
Separar la tercera parte del
extracto total: Fracción A

Llevar a seco el volumen

restante y agregar HCl 2% (3x15
mL), calentar suavemente y
filtrar en caliente

Marco

Agregar 20mL de CHCl3

/etanol y filtrar
Filtrado ácido, alcalinizar con
NH3 hasta pH=10. Extraer con
CHCl3 (3x15mL)
Filtrado Residuo insoluble
clorofórmico/etanol:
Separar en embudo Fracción B
de decantación

Técnicas
Fracción clorofórmica Fracción acuosa: cromatográficas
Fracción D

Agregar Na2SO4
anhidro y filtrar
Técnicas de
identificación y
caracterización
Fracción C Residuo

Figura 16. Esquema de la marcha fitoquímica empleada para fraccionar los extractos
crudos

42
 __________________________________________________________________________Metodología

3.4 Identificación cualitativa de metabolitos primarios y secundarios presentes en hojas

de Schinus molle var. areira L. (DC)

3.4.1 Tamizaje fitoquímico

Cada fracción (A, B, C y D) obtenida desde el extracto etanólico crudo de hojas de Schinus
molle var. areira L. (DC) fue sometida a ensayos químicos cualitativos, conocido como
tamizaje fitoquímico, con el fin de obtener información cualitativa sobre los distintos
metabolitos secundarios que están presentes y/o ausentes en cada una de las distintas
fracciones. A continuación, se mencionan las diferentes pruebas de tamizaje fitoquímico
realizadas a las fracciones A, B, C y D:

En la Fracción A, la cual corresponde a la tercera parte del extracto crudo etanólico, se

llevaron a cabo ensayos cualitativos para determinar la presencia o ausencia de los
metabolitos que por afinidad al solvente pudieran estar presentes, tales como flavonoides,
taninos, lípidos e hidratos de carbono. En la Tabla 4 se muestran la reacciones o ensayos
según tipo de familia estructural y el resultado previsto.

Tabla 4. Pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa de metabolitos

de la Fracción A
Metabolito Nombre de la reacción Metodología Resultado previsto

Flavonoides Shinoda Secar 0.5ml de Fracción A y Color púrpura (varía desde el

retomar 0.5ml de agua rosa muy tenue hasta el color
destilada. Agregar unas guinda), que pasa a la fase
granallas de cinta de Zn o Mg orgánica. Se debe dejar
y 0,2ml de HCl concentrado. reaccionar completamente
Observar la aparición de antes de agregar alcohol
color. Posteriormente agregar amílico, a veces más de 1 h
0.2ml etanol, se diluye con para informar un negativo.
2ml de agua destilada, y (44)
observar el color en la fase
orgánica.

43
 __________________________________________________________________________Metodología

Taninos y OH Reacción de FeCl3 Secar 3ml de la Fracción A a 1 OH = amarillo

fenólicos baño María. El residuo seco se 2 OH = verde grisáceo
disuelve en 1ml de agua 3 OH = azul negro (44)
destilada y se le agregan 3
gotas de FeCl3 al 1% acuoso.
Gelatina Llevar a seco otros 3ml de Aparición de turbidez hasta
Fracción A calentando a baño observar un precipitado
María. El residuo seco se abundante lo que indica
disuelve en 1ml de agua presencia de taninos. (44)
destilada y se le agregan 10
gotas de una solución acuosa
de gelatina al 0.5%
Lípidos Sudán III Agregar 1ml de la Fracción A Precipitado anaranjado que
en un tubo de ensayo y 1ml indica la presencia de lípidos
del reactivo Sudán III (44)
Hidratos de carbono Fehling Agregar 1ml de la Fracción A Observar aparición de
en un tubo de ensayo y precipitado de color rojo
adicionar 6 gotas del reactivo (44)
de Fehling A. Agitar la
mezcla y calentar suavemente
a baño maría. Observar la
aparición de color

La Fracción B, es una fracción clorofórmica obtenida a partir del marco luego de los tres
tratamientos sucesivos con porciones de 15ml de HCl 2%. Sobre esta fracción se realizaron
pruebas fitoquímicas cualitativas para determinar la presencia o ausencia de antraquinonas,
esteroides y triterpenos. En la Tabla 5 se muestran las reacciones o ensayos según tipo de
familia estructural y resultado previsto.

44
 __________________________________________________________________________Metodología
Tabla 5. Pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa de metabolitos
presentes en la Fracción B
Metabolito Nombre de la reacción Metodología
Flavonoides Shinoda Proceder según lo descrito en
la fracción A
Esteroides y triterpenos Prueba de Liebermann- Mezclar 1ml de anhídrido
Burchard acético y 1ml de cloroformo
(Reactivo LB). Enfriar a 0°C
en baño de hielo. Luego, 2ml
de la Fracción B se ponen en
contacto con el reactivo
anterior y el tubo se coloca en
baño de hielo. Agregar 1 gota
de H2SO4 previamente
enfriado a 0°C por las paredes
del tubo. Enfriar nuevamente
y observar la coloración.
Antraquinonas Reacción de Bornträger Se agitan suavemente 3ml de
la Fracción B con 5ml de
NaOH 5% y se observa el
color.
Resultado previsto
Color púrpura (varía desde el
rosa muy tenue hasta el color
guinda), que pasa a la fase
orgánica. Se debe dejar
reaccionar completamente
antes de agregar alcohol
amílico, a veces más de 1 h
para informar un negativo.
(44)
coloración verdeazulada
indica la presencia de grupo
esteroide, coloración rojo-
naranja evidencia al grupo
terpénico. (45)
fase acuosa roja, o amarilla
con fluorescencia roja. (45)
45
 __________________________________________________________________________Metodología

La Fracción C, proviene del filtrado ácido obtenido de los tratamientos sucesivos con HCl
2% sobre la Fracción A (ver Figura 16). Fue extraído utilizando tres alícuotas de 15ml de
CHCl3 y puesto en un embudo de decantación, obteniéndose dos fracciones: la Fracción C
clorofórmica y una fracción acuosa. Sobre esta fracción clorofórmica se llevaron a cabo
pruebas de identificación cualitativas para alcaloides, esteroides y triterpenos. La Tabla 6
muestra las reacciones o ensayos según tipo de familia estructural y resultados previstos.

Tabla 6. Pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa de metabolitos

presentes en la Fracción C

Metabolito Nombre de la reacción Metodología Resultado previsto

Alcaloides Prueba de Dragendorff Para la reacción, tomar 0.2ml se observará la formación de

de la Fracción C, llevar a un precipitado pardo
sequedad, retomar con 2ml de anaranjado (44)
HCl 1% y agregar dos gotas
del reactivo de Dragendorff
Esteroides y triterpenos Prueba de Liebermann- Proceder según lo descrito en coloración verdeazulada
Burchard la fracción B indica la presencia de grupo
esteroide, coloración rojo-
naranja evidencia al grupo
terpénico. (45)

Finalmente, la Fracción D, corresponde a la fracción acuosa obtenida a partir del embudo de

decantación (ver Figura 16). Sobre esta fracción se realizaron pruebas fitoquímicas para
determinar la presencia o ausencia de saponinas, taninos, flavonoides, alcaloides, proteínas
y aminoácidos. En la Tabla 7 se muestran las reacciones o ensayos según tipo de familia
estructural y resultados previstos.

46
 __________________________________________________________________________Metodología

Tabla 7. Pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa de metabolitos

presentes en la Fracción D
Metabolito Nombre de la reacción Metodología Resultados esperados

Saponinas Reacción directa de Tomar 1ml de Fracción D y Producción de espuma

Saponinas llevar a un tubo de ensayo de (poder afrógeno de las
5ml. Tapar con el dedo y saponinas) (44)
agitar fuertemente durante 15
segundos. Medir la altura de
la espuma producida a los 5 y
15 min
Taninos Reacción de FeCl3 Proceder según lo descrito en 1 OH = amarillo
la fracción A 2 OH = verde grisáceo
3 OH = azul negro (44)
Gelatina Proceder según lo descrito en Aparición de turbidez hasta
la fracción A observar un precipitado
abundante lo que indica
presencia de taninos. (44)
Flavonoides Shinoda Proceder según lo descrito en Color púrpura (varía desde el
la fracción A rosa muy tenue hasta el color
guinda), que pasa a la fase
orgánica. Se debe dejar
reaccionar completamente
antes de agregar alcohol
amílico, a veces más de 1 h
para informar un negativo.
(44)
Alcaloides Prueba de Dragendorff Proceder según lo descrito en se observará la formación de
la fracción C un precipitado pardo
anaranjado (44)
Proteínas y Prueba de la Nihindrina Tomar 1ml de Fracción D y Coloración azul-violeta (45)
aminoácidos agregar 5 gotas de solución
etanólica de Nihindrina al
0.2%

47
__________________________________________________________________________Metodología

3.5 Purificación de las fracciones de interés mediante técnicas cromatográficas

Una vez obtenidos los resultados de las pruebas de tamizaje fitoquímico, se llevaron a cabo
técnicas cromatográficas que permitieron purificar los metabolitos de interés presentes en
cada fracción. Respecto a esto, la Fracción B muestra gran presencia de terpenos/esteroides,
a diferencia de las demás fracciones que no tuvieron un resultado positivo notorio en relación
con estos metabolitos de naturaleza terpénica. Es por ello, que la Fracción B fue sometida a
una serie de técnicas cromatográficas y posteriormente a HPLC/MS, lo cual permitió
identificar cuáles son los metabolitos secundarios presentes en esta fracción.

3.5.1 Cromatografía en columna (CC)

La Fracción B obtenida luego de la marcha fitoquímica fue sometida a purificación por

cromatografía en columna. Esta cromatografía está compuesta por una columna de vidrio
vertical que contiene la fase estacionaria compuesta por Sephadex LH-20. En el extremo
inferior de la columna, se agregó lana de vidrio como filtro, justo antes de la llave de paso.

Como fase móvil se utilizó en primera instancia metanol (MeOH) y posteriormente una
mezcla de solventes compuesta de acetato de etilo (AE) y metanol en proporción 8:2. Se le
agregó una cabeza de 5 ml de Fracción B obtenida en el fraccionamiento y se procedió a
eluir seriadamente la columna hasta agotar totalmente la fracción B. Las fracciones eluídas
fueron recolectadas en tubos de ensayo de 5 ml y fueron sembradas en cromatografía en capa
fina.

3.5.2 Cromatografía en capa fina (CCF)

En esta cromatografía, la fase estacionaria corresponde a láminas de aluminio cubiertas con

gel de sílice 60F254, estas láminas tienen dimensión 20cm de ancho y 20cm de alto, por lo
tanto, fueron separadas en pequeñas placas cromatográficas de 5cm de ancho y 8cm de alto,
obteniendo un total de 8 placas por lámina. En cada placa se trazó un límite superior e inferior
midiendo 1cm desde cada extremo de la placa y trazando una línea con lápiz mina a lo ancho
de ésta. Dichos límites inferior y superior sirven como línea de siembra para las fracciones
purificadas y como línea de llegada para las eluciones, respectivamente.

48
__________________________________________________________________________Metodología

Las fracciones obtenidas en cromatografía en columna fueron sembradas a razón de tres

sembrados por placa cromatográfica utilizando un capilar de vidrio, con el cual se toma un
pequeño volumen de cada fracción purificada y se siembra sobre la base de la placa. Luego
la placa se introdujo en una cámara cromatográfica que contiene 10ml de fase móvil en su
interior (en este caso una mezcla de AE:MeOH 8:2) y se dejó eluir hasta el límite que fue
trazado al extremo superior de la placa cromatográfica.

Una vez eluidas las placas, fueron observadas en luz UV para determinar la presencia de
algún metabolito secundario de interés. Además, fueron reveladas utilizando un reactivo de
coloración específica para esteroides y terpenoides (Liebermann-Burchard), el cual muestra
su coloración al aplicar calor sobre la placa.

Cada fracción purificada obtenida a partir de la Fracción B, que mostró fluorescencia al ser
observada en luz UV luego de ser sometida a CC y CCF, fue recolectada en un balón de
vidrio. Se recolectó la totalidad de las fracciones purificadas en un balón de 500ml. Este
balón fue pesado previamente y rotaevaporado hasta agotar completamente el solvente, con
el fin de determinar la cantidad en masa del extracto purificado que contiene los compuestos
de interés. Posteriormente fue sometido nuevamente a purificación, esta vez utilizando la
técnica cromatográfica PTLC: Preparative thin layer chromatography o Cromatografía en
capa fina preparativa de cristal

3.5.3 Cromatografía en capa fina preparativa de cristal (PTLC)

Obtenido el peso del extracto en el balón de vidrio, se procedió a realizar una CCF
preparativa. La CCF preparativa es una técnica útil para la purificación de pequeñas
cantidades de muestra (muestras cuya cantidad oscila entre miligramos y gramos).

Para lograr esto se utilizó una espátula de aluminio para obtener desde el fondo del balón de
vidrio una cantidad en masa de extracto concentrado de a lo menos 300mg y se depositó en
un tubo Eppendorf (previamente pesado) de 1ml, la muestra se disolvió en 1ml de acetato de
etilo y fue sembrada en la placa cromatográfica de cristal. A diferencia de la CCF común en
la cual se siembran las muestras en puntos localizados, en la CCF preparativa la muestra se
sembró cubriendo totalmente el largo del límite inferior de la placa (1cm sobre la base)
utilizando un pincel fabricado en el laboratorio con una pipeta de vidrio y algodón. La fase

49
__________________________________________________________________________Metodología

estacionaria corresponde a la placa de cristal cubierta con sílice, como fase móvil se utilizaron
100ml de una mezcla de AE:MeOH 8:2, la cual fue depositada al final de la cámara
cromatográfica de cristal.

Luego de realizar la siembra, la placa de cristal se depositó en la cámara cromatográfica de

cristal y se eluyó hasta llegar a la línea límite superior. Se dejó secar, y posterior a esto se
utilizó una espátula de aluminio para recolectar todo el gel de sílice que contiene los
compuestos purificados obtenidos.

Esta mezcla se juntó en un vaso precipitado de 25ml, se le añadió 10ml de acetato de etilo y
se dejó reposar para decantar el gel de sílice. Posteriormente, se filtró la muestra en un vaso
precipitado de 25ml para obtener el extracto purificado final, el cual se sembró directamente
en CCF para ver presencia de metabolitos en luz UV. Luego, se dejó evaporar el solvente
(acetato de etilo) a temperatura ambiente y el resultado de esto es el extracto purificado final
obtenido a partir de la Fracción B del extracto crudo etanólico que fue preparado en un
comienzo, el cual será sometido a HPLC/MS para poder conocer de manera concreta los
fitoquímicos que están presentes en este extracto purificado final.

50
__________________________________________________________________________Metodología

3.6 Identificación de los productos aislados a partir de la Fracción B presente en el

extracto purificado final

3.6.1 Caracterización del extracto purificado final de S. areira L. por HPLC-DAD-

ESI-MS / MS

El extracto fue analizado por HPLC-DAD-MS utilizando un sistema Thermo Scientific LTQ
Orbitrap Discovery (Bremen, Alemania) equipado con un detector de matriz de diodos
Accela (automático) y bomba de alta velocidad, y con un espectrómetro de masas LTQ
Orbitrap. La separación se llevó a cabo usando una columna Phenomenex Kinetex Biphenyl
(100 mm x 2.10 mm x 2.6 μm) a 25 ° C. Las muestras (25 μL) se eluyeron a través de la
columna con una fase móvil de gradiente que consta de A: agua acidificada con ácido fórmico
al 0,1% v / v y B: metanol acidificado con ácido fórmico al 0,1% v / v, con un flujo de 0,15
ml / min. El gradiente utilizado fue: 0-0.5 min, 50% B; 0.5-5 min, 50-90% B; 5-7,5 min, 90%
de B; 7.5-8.5 min, 90-50% B; 8,5-12 min, 50% B. Se usó una longitud de onda entre 200-
400 nm para la detección por arreglo de diodos (DAD), y los espectros de masas se
registraron en modo de iones negativos y positivos con un rango m / z de 150-600 uma. Los
datos se procesaron utilizando el software XCalibur v. 2.0. La identificación de compuestos
fenólicos y terpénicos se basó en la cromatografía con estándares disponibles cuando fue
posible. DAD y espectros de masas se utilizaron para confirmar la identidad tentativa de los
compuestos informados previamente en la literatura y base de datos.

51
_______________________________________________________________________________Resultados

4. RESULTADOS

52
_______________________________________________________________________________Resultados

4.1. Fraccionamiento de extractos crudos y cálculo de rendimientos

A continuación, se muestran los resultados obtenidos en rendimientos para cada fracción

obtenida en la marcha fitoquímica presentada en la Figura 16, en el Anexo 1 se muestra el
detalle del cálculo realizado para cada fracción y para el rendimiento del extracto crudo

4.1.1 Cálculo de rendimiento de extracto crudo

Utilizando la Ecuación 1 se obtuvo el siguiente resultado:

2.24𝑔
% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥100
30.12𝑔

% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒐 𝒄𝒓𝒖𝒅𝒐 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍 = 𝟕. 𝟒𝟑%

4.1.2 Cálculo de rendimientos para fracciones del extracto crudo

Utilizando la Ecuación 2 se obtuvieron los siguientes rendimientos para las fracciones A, B,

C y D: (El detalle del cálculo se muestra en el Anexo 1)

Tabla 8. Porcentaje de rendimiento para las fracciones obtenidas del extracto crudo

Fracción Rendimiento obtenido (%)

A 28.13

B 18.30

C 0.446

D 54.91

53
_______________________________________________________________________________Resultados

4.2 Identificación cualitativa de metabolitos primarios y secundarios presentes en hojas

de Schinus molle var. areira L. (DC)

4.2.1 Tamizaje fitoquímico

A continuación, se muestran en tablas los resultados de las pruebas de tamizaje fitoquímico

realizadas para determinar la presencia o ausencia de los distintos metabolitos investigados
para cada fracción analizada, según tipo de familia estructural y la evidencia fotográfica de
los resultados obtenidos.

En la Fracción A, las pruebas de tamizaje fitoquímico resultaron ser positivas para

metabolitos secundarios del tipo flavonoides y taninos. Por otra parte, no fue posible
identificar presencia de metabolitos primarios del tipo lípido e hidratos de carbono. La Tabla
9 muestra el tipo de metabolito analizado, la prueba de tamizaje fitoquímico a la cual fue
sometido, el resultado (positivo/negativo) y la evidencia fotográfica del resultado.

54
_______________________________________________________________________________Resultados

Tabla 9. Resultados de pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa

de metabolitos presentes en la Fracción A

Metabolito Nombre de la reacción Resultado Evidencia fotográfica

Flavonoides Shinoda Positivo

Taninos y OH Reacción de FeCl3 Positivo

fenólicos

Gelatina Negativo

Lípidos Sudán III Negativo

Hidratos de Fehling Negativo

carbono

55
_______________________________________________________________________________Resultados

En la Fracción B del extracto crudo fue posible identificar la presencia de flavonoides,

esteroides y triterpenos; y la ausencia de antraquinonas. La Tabla 10 muestra el tipo de
metabolito analizado, la prueba de tamizaje fitoquímico a la cual fue sometido, el resultado
(positivo/negativo) y la evidencia fotográfica del resultado.

Tabla 10. Resultados de pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa

de metabolitos presentes en la Fracción B

Metabolito Nombre de la reacción Resultado Evidencia fotográfica

Flavonoides Shinoda ó Shivata Positivo

Esteroides y Prueba de Liebermann- Positivo

triterpenos Burchard

Antraquinonas Reacción de Negativo

Bornträger

56
 _______________________________________________________________________________Resultados

Las pruebas realizadas sobre la Fracción C fueron negativas tanto para alcaloides como para
esteroides y triterpenos. La Tabla 11 muestra el tipo de metabolito analizado, la prueba de
tamizaje fitoquímico a la cual fue sometido, el resultado (positivo/negativo) y la evidencia
fotográfica del resultado.

Tabla 11. Resultados de pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa

de metabolitos presentes en la Fracción C

Metabolito Nombre de la reacción Resultado Evidencia fotográfica

Alcaloides Prueba de Dragendorff Negativo

Esteroides y Prueba de Liebermann- Negativo

triterpenos Burchard

Finalmente, no fue posible identificar la presencia de ninguno de los metabolitos estudiados

sobre la Fracción D, sin embargo por el aspecto de esta fracción al parecer es rica en
mucílagos. En la Tabla 12 se muestra el tipo de metabolito analizado, la prueba de tamizaje
fitoquímico a la cual fue sometido, el resultado (positivo/negativo) y la evidencia fotográfica
del resultado.

57
_______________________________________________________________________________Resultados

Tabla 12. Resultados de pruebas de tamizaje fitoquímico para la determinación cualitativa

de metabolitos presentes en la Fracción D
Metabolito Nombre de la reacción Resultado Evidencia fotográfica
Flavonoides Shinoda Negativo

Taninos Reacción de FeCl3 Negativo

Prueba de Gelatina Negativo

Alcaloides Prueba de Dragendorff Negativo

Saponinas Reacción directa de Negativo

saponinas

58
_______________________________________________________________________________Resultados

Proteínas y Prueba de Nihindrina Negativo

aminoácidos

4.3. Purificación de las fracciones de interés mediante técnicas cromatográficas

4.3.1 Cromatografía en Columna

Se realizaron un total de siete eluciones en CC para la Fracción B del extracto crudo

etanólico preparado. Las fracciones semipurificadas obtenidas en este proceso, fueron
recolectadas en tubos de ensayo de 5ml.

4.3.2 Cromatografía en Capa fina

Las fracciones semipurificadas obtenidas en CC, fueron sembradas en CCF, observadas en

luz UV y reveladas con el reactivo de Liebermann-Burchard. La Tabla 13 muestra la totalidad
de las eluciones, las fracciones obtenidas por cada elución, las fracciones que mostraron
fluorescencia en UV (o fracciones purificadas) y el color obtenido luego de utilizar el
revelador de coloración específica Liebermann-Burchard.

Tabla 13. Resultados de CCF para la Fracción B obtenida a partir del extracto crudo

Elución Fracciones obtenidas Fracciones purificadas Color al revelar

totales fluorescentes
1 15 7-12 (5) Verde azulado
2 18 9-13 (4) Verde azulado
3 15 5-11 (6) Verde azulado
4 18 10-13 (3) Verde azulado
5 18 7-13 (6) Verde azulado
6 15 7-12 (5) Verde azulado
7 15 3-12 (9) Verde azulado
Total 114 38 -

59
_______________________________________________________________________________Resultados

Las 38 fracciones purificadas fueron recolectadas en un balón de vidrio de 500ml y

rotaevaporadas a sequedad para poder obtener su cantidad en masa, la cual fue de 830mg.
(ver Anexo 2)

4.3.3 Cromatografía en capa fina preparativa de cristal (PTLC)

Se realizó una PTLC para la muestra obtenida (830mg) y se obtuvo un extracto purificado
final que contiene los compuestos de interés que serán analizados por técnicas
cromatográficas y espectroscópicas de identificación.

El extracto purificado final de la muestra de 830mg tuvo como resultado un total de 70mg
luego de ser sometido al proceso de PTLC. El detalle del cálculo del extracto purificado final
se encuentra en el Anexo 2. Este extracto purificado final fue enviado al Centro de Estudios
para el Desarrollo de la Química (CEPEDEQ) de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacéuticas de la Universidad de Chile, para completar su análisis.

60
_______________________________________________________________________________Resultados

4.4 Identificación de los productos aislados a partir de las Fracciones B presentes en el

extracto purificado final

4.4.1 Análisis de HPLC-DAD-ESI-MS / MS de la fracción B purificada por

cromatografía de S. areira L.

La identificación tentativa de siete compuestos de origen fenólico y terpénico en el extracto

basado en una combinación de datos espectrales de UV y MS reveló la presencia de derivados
de quercetina y espatulenol como compuestos de interés. Se detectaron rastros de ésteres de
ácido gálico, entre otros compuestos que se muestran en la Tabla 14. En Anexos 3 se puede
apreciar la abundancia relativa de cada uno de los compuestos (según N° de pico) y su tiempo
de retención.

Tabla 14. Compuestos presentes en los extractos purificados finales, junto a su relación
masa/carga y sus tiempos de retención.

N° tR [M-H]-
Identificación tentativa Referencia
Pico (min) (m/z)

Muñoz y
1 3.78 219 Espatulenol
Wilkomirsky (34)
Silva-Júnior, et al.
2 4.86 169 Ácido gálico (trazas)
2015 (46)
3 10.26 543 Éster de ácido gálico -
Silva-Júnior, et al.
4 10.94 301 Quercetina
2015 (46)
Silva-Júnior, et al.
463 Isoquercetina
2015 (46)
5 11.96 329 Ácido vaníllico hexósido -
6 13.22 311 Ácido cafeico -
Silva-Júnior, et al.
7 15.72 170 Miricetina
2015 (46)

61
______________________________________________________________________________Discusión

5. DISCUSIÓN

62
______________________________________________________________________________Discusión

La recolección y extracción de principios activos de especies vegetales depende de las

características de cada especie. La recolección condiciona notablemente la calidad y la
cantidad de principio activo presente en la especie recolectada, así mismo es preciso tener en
cuenta una serie de factores que afectarán la calidad del material vegetal recolectado, tales
como: la edad de la especie vegetal, el estado del vegetal, la época del año y el momento del
día. Estos factores se relacionan entre sí, lo que se representa en la Figura 17 (6) (10) (15).

Edad de la especie
estado vegetativo
época de recolección
momento del día

Cantidad y calidad de Proceso de recolección y de

principio activo extracción

Figura 17. Factores que afectan la recolección y extracción de principios activos de

especies vegetales

En adición a los factores mencionados anteriormente, es importante considerar que al llevar

a cabo la extracción de drogas vegetales, se debe escoger el tipo de extracción adecuada
según los requerimientos del material vegetal, una vez escogido el método, en nuestro caso
la extracción con solventes, hay que tener en cuenta diversos factores que afectarían la
calidad del proceso extractivo, entre ellos: las características de la droga, la naturaleza del
solvente, la temperatura a la cual se ejecutó la extracción, el tiempo de contacto existente
entre la droga y el solvente, el control de difusión celular, el pH y otros factores
fisicoquímicos. (6)

63
______________________________________________________________________________Discusión

Considerando estos antecedentes, en nuestro trabajo se tuvo en cuenta la parte u órgano de la

especie vegetal objeto de estudio, S. areira, ya que estas partes pueden ser extraídas con
diferentes tipos de solvente según sea el fin de la extracción, por ejemplo:

- Hojas: solventes apolares y polares según metabolitos de interés

- Frutos: solventes apolares en caso de extraer metabolitos ricos en terpenos, así mismo
por destilación se pueden obtener los aceites esenciales que han mostrado una
significante actividad antimicrobiana y antifúngica. (46)

Tomando en cuenta que en esta investigación el extracto crudo fue preparado utilizando
extracción discontinua por maceración, la eficacia del proceso de maceración está
determinada por dos principales factores: el control de difusión celular y la solubilidad. (47)

Respecto al control de difusión celular, se refiere al momento en que la droga contacta con
el solvente, produciéndose la difusión desde la droga, que posee mayor concentración de
principios activos, hacia el solvente que esté siendo utilizado en la extracción. Esta difusión
se produce hasta alcanzar un equilibrio (6), por lo tanto, es recomendable renovar el solvente
que se esté utilizando. En la maceración, la droga es puesta en contacto con el solvente y éste
nunca es renovado, por ende, la difusión podría alcanzar el equilibrio sin haber transferido la
totalidad de principios activos hacia el solvente. Además, el proceso de maceración se realiza
normalmente a temperatura ambiente, con agitación y durante días. En el caso de esta
investigación, el extracto crudo fue macerado durante dos horas y media a 65°C, por lo cual,
es probable que no se haya alcanzado el total de la difusión de los principios activos desde el
material vegetal hacia el solvente de extracción.

El rendimiento del extracto crudo preparado durante esta investigación fue de 7.43%, un
resultado bajo, lo que podría confirmar lo nombrado anteriormente. A partir del extracto
crudo, se calcularon los rendimientos de las distintas fracciones obtenidas a partir de éste,
obteniéndose un 28.13%, 18.30%, 0.446% y 54.91% para las fracciones A, B, C y D
respectivamente.

La cantidad de metabolitos presentes en el extracto crudo etanólico inicial y en las fracciones

obtenidas de éste dependerá directamente de la solubilidad, es decir, de si los metabolitos y
los solventes en juego son polares o apolares. Los solventes utilizados a lo largo del

64
______________________________________________________________________________Discusión

procedimiento corresponden principalmente a etanol, cloroformo, acetato de etilo y en menor

cantidad metanol. Según los datos presentados en la Tabla 2 y los resultados mostrados en la
Tabla 14, existe una relación correcta entre los compuestos obtenidos y los solventes
utilizados. En la Tabla 15 se resume esta consideración respecto a la especie estudiada.

La especie Schinus molle var. areira L. (DC) contiene en sus hojas flavonoides, saponinas
esferoidales, esteroles, terpenos, gomas resinas y aceites esenciales, estos últimos incluyen
20 o más compuestos diferentes. (48) Además las hojas contienen, pigmentos antocianídicos,
triterpenos, β-sitosterol, taninos, ácido gálico, ácido protocatéquico, glucosa, fructosa y
aceite esencial (0.5%). Los ácidos linolénico, linoleico, lignocérico y esteárico aislados de
aceites esenciales obtenidos de frutos, corteza y semillas contienen entre su composición α-
bergamonstranseno, bourboneno, α y δ-cadineno, α y γ-calacoreno, calameneno, canfeno,
carvacrol, β-cariofileno, γ-copaeno, croweacina, γ-cubeneno, p-cimeno, butirato de geraniol,
hexanoato de nerol, α y β-felandreno, α y β-pineno, α-terpineol, γ-terpineno, α y γ-muuroleno
además de cianidina-3-galactósido, cianidina-3-rutinósido y peonidina-3-glucósido, los
cuales han demostrado efecto tóxico y repelente sobre algunos insectos. (48)

Los aceites esenciales se presentan en un 2% en las hojas de S. molle y contienen terpenoides,

siendo el cis-menth-2-en-1-ol y el trans-piperitol los que han sido involucrados en las
actividades insecticidas de la planta. Por otro lado, se ha encontrado que canfeno, mirceno,
β-felandreno y α-felandreno son los principales compuestos de los aceites esenciales de las
hojas de S. molle relacionados con la actividad de repelencia e insecticida. (50)

De las moléculas nombradas anteriormente, cabe destacar que durante el procedimiento

realizado sobre hojas de S. areira, fue posible identificar mediante HPLC-DAD-ESI-MS la
presencia de los siguientes metabolitos secundarios (en orden de abundancia relativa): el
flavonoide quercetina, el sesquiterpeno espatulenol, los flavonoides isoquercetina y
miricetina; y ácido gálico y cafeico. En la Figura 18, se muestran las estructuras químicas de
los algunos de los compuestos fitoquímicos nombrados anteriormente y otros que están
presentes en las hojas y frutos de S. areira.

65
 ______________________________________________________________________________Discusión

Tabla 15. Resumen de los resultados encontrados en nuestro estudio correlacionando: parte
de la planta ó fracción analizada, solvente empleado y tipo de extracción, metabolitos
presentes según la literatura y los ensayos realizados.

Parte del Solvente de Tipo de extracción/ Metabolitos Metabolitos encontrados

vegetal/Fracción extracción Fraccionamiento esperados según según:
literatura (18) Tamizaje fitoquímico (1)
HPLC/MS (2)
Hojas Etanol Maceración Taninos Estos ensayos corresponden a
Polifenoles los realizados sobre la fracción
Flavonoles A.
Terpenoides
Esteroles
Alcaloides
Fracción A Etanol Marcha experimental Taninos Flavonoides (1)
(Figura 13) Polifenoles Taninos (1)
Flavonoles
Terpenoides
Esteroles
Alcaloides
Fracción B Cloroformo/etanol Terpenoides - Flavonoides (1): quercetina,
Flavonoides isoquercetina y miricetina (2)
Alcaloides - Terpenos (1): espatulenol (2)
- ácido gálico (2)
- ácido cafeico (2)
Fracción C Cloroformo Terpenoides No se encontró presencia de
Flavonoides metabolitos en esta fracción
Alcaloides

Fracción D Agua Azúcar No se encontró presencia de

Aminoácidos metabolitos en esta fracción
Saponinas
Taninos
Terpenoides
Antocianinas
Almidones

66
______________________________________________________________________________Discusión

Figura 18. Estructuras químicas de algunos compuestos presentes en los frutos y hojas de S.

molle var. areira L. (DC): α y β felandreno [1 y 2], (±) canfeno [3], mirceno [4], (-) α y (+)

β pineno [5 y 6], carvacrol [7], (-)-limoneno [8], espatulenol [9], O-etil fenol, p-cimeno, p-

cimol y otros. Por su parte las hojas solo de 0.2 a 1% de aceite esencial y, además los
flavonoides quercetina [10], kaempferol [11], rutina [12], miricetina [13], quercitrina [14],
isoquercitrina [15], leucodelfinidina [16], ácido lignocérico, esteroles, galotaninos,
triterpenos y otros compuestos. (34)

De todo el análisis anterior se verifica que nuestros resultados de HPLC/MS coinciden con
los encontrados en la literatura.

67
______________________________________________________________________________Discusión

Las moléculas encontradas durante esta investigación han sido estudiadas previamente (34)
y poseen distintas actividades farmacológicas y algunos usos no farmacológicos que serán
presentados a continuación.

Estudios de aceites esenciales donde el espatulenol constituye el componente principal

(80.71%), han reportado algunas actividades biológicas asociadas a este compuesto, tales
como: antiproliferativo, antiinflamatorio, antimicrobianas, antiulcerosas, antioxidantes y
actividad repelente contra algunos organismos biológicos. (51) Por otra parte, este
sesquiterpeno tricíclico es utilizado saborizante en bebidas, en composiciones aromáticas
para alimentos, además de aplicarse en productos y preparaciones cosméticas. (51) Se ha
encontrado además en diversos extractos de plantas, entre ellas el molle, en forma de
heterósido, como sesquiterpeno libre o como trazas. (34) (51)

Los compuestos fenólicos se encuentran universalmente en el reino vegetal y son parte de un

complejo grupo de sustancias orgánicas. Las plantas sintetizan y acumulan una amplia
variedad de compuestos fenólicos que los protegen contra los ataques de los radicales libres.
Pueden ser divididos en dos grupos: compuestos fenólicos simples (cumarinas y ácidos
fenólicos como el ácido hidroxibenzoico e hidroxicinámico) y compuestos polifenólicos
(taninos y flavonoides). El ácido cafeico (3,4-dihidroxicinámico) es un derivado del ácido
cinámico presente en muchas fuentes alimenticias, tales como, café, arándanos, manzanas y
sidra. Además, posee propiedades farmacológicas tales como: actividad antioxidante,
actividad antimicrobiana, citotoxicidad y puede contribuir a la prevención de aterosclerosis
y otras enfermedades cardiovasculares. (52)

El ácido gálico es un compuesto polifenólico encontrado en brebajes procesados como el

vino rojo y el té verde. Es conocido ampliamente por sus fuertes y naturales actividades
antioxidantes, antimutagénicas, anticarcinogénicas, antialérgicas, antiinflamatorias,
antivirales, antibacterianas y antiateroesclerosis. (53) También se ha encontrado que induce
la apotosis en algunas líneas de células tumorales y juega un importante rol en la prevención
de transformación maligna y el desarrollo de cáncer in vivo. (53)

68
______________________________________________________________________________Discusión

Los flavonoides constituyen un grupo de sustancias naturales polifenólicas que se encuentran

presentes de forma natural en diferentes flores, frutas, verduras, semillas y bebidas derivadas
de plantas como el té y el vino tinto, y son los responsables de su color característico. Se han
identificado más de 5000 variedades de flavonoides que se agrupan en flavonas, flavonoles,
antocianinas, flavanoles, flavanonas e isoflavonas. De todos estos compuestos, la quercetina
es el más abundante. Las propiedades beneficiosas de la quercetina se relacionan
estrechamente con su estructura química, que le confiere propiedades antioxidantes. Actúa
como protector frente a las especies reactivas de oxígeno, mediante la neutralización de
radicales libres como aniones superóxido, óxido nítrico y peroxinitritos, entre otros. (54)

La quercetina es una molécula versátil que incluye las siguientes propiedades

farmacológicas: antioxidante, neurológicas, antivirales, anticancerígenas, cardiovasculares,
antimicrobianas, antiinflamatorias, hepatoprotectoras, protectoras del sistema reproductivo y
agente antiobesidad. (55)

La isoquercitrina es un monoglucósido de quercetina ampliamente distribuido en el reino

vegetal y es comúnmente encontrado en frutas, vegetales, cereales y varios brebajes
derivados de plantas como el té y el vino. Posee dentro de sus potenciales farmacológicos
actividades antioxidantes, antiinflamatorias, anticarcinógenas, cardioprotectoras,
antidiabéticas, antialérgicas y neurofarmacológicas. (56)

La miricetina (o hidroxiquercetina por su similitud estructural con la quercetina) posee

propiedades nutracéuticas y antioxidantes. La evidencia científica afirma que las actividades
farmacológicas de la miricetina incluyen: antioxidante, anti-foto envejecimiento,
anticancerígena, antiagregación plaquetaria, antihipertensiva, inmunomoduladora,
antiinflamatoria, antialérgica, analgésica, actividad en desórdenes óseos, oculares y del
sistema nervioso central, hepatoprotectora, hipouricémica, cardioprotectora, antidiabética y
antiobesidad y antimicrobianas. (57)

69
______________________________________________________________________________Discusión

Los antecedentes discutidos previamente motivan a la realización de futuros estudios donde

se puedan investigar distintas partes de la especie Schinus molle var. areira L (DC), como
sus frutos o raíces, debido a que poseen evidencia de distintas actividades farmacológicas.
Los estudios hasta la fecha avalan el uso medicinal de la especie S. molle debido a sus
propiedades como: hipotensor, antiinflamatorio, analgésico, depresor del sistema nervioso
central, antiespasmódico (58), purgante, diurético y parasiticida, entre otros. (59)

Con este trabajo se exploró una nueva metodología extractiva para obtener extractos ricos en
metabolitos bioactivos de esta especie. Aunque en la literatura científica se ha abordado
ampliamente la obtención de aceites esenciales, pudimos constatar que los extractos de S.
molle presentan un alto contenido de metabolitos de interés para la salud humana.

70
______________________________________________________________Referencias Bibliográficas

6. CONCLUSIONES

71
______________________________________________________________Referencias Bibliográficas

Se realizó la extracción, el fraccionamiento e identificación de fitoquímicos presentes en las

hojas de la especie Schinus molle var. areira L (DC.), llegando a las siguientes conclusiones:

- Se obtuvo un extracto etanólico crudo. El rendimiento para éste respecto al material

vegetal original (30.12g) fue de 7.43% utilizando extracción discontinua por
maceración durante un período de dos horas y media a una temperatura de 65°C

- Se fraccionó el extracto crudo y se obtuvo el rendimiento de las fracciones obtenidas

a partir de éste, dando como resultado los siguientes rendimientos para las fracciones
A, B, C y D, siendo el porcentaje de 28.13%, 18.30%, 0.446% y 54.91%
respectivamente.

- Las fracciones del extracto crudo fueron sometidas a pruebas de tamizaje fitoquímico
para determinar la presencia o ausencia de distintos metabolitos secundarios que
pudieran estar presentes en las hojas de S. areira L. Las fracciones mostraron la
presencia de los siguientes metabolitos: Fracción A: flavonoides y taninos; Fracción
B: esteroides y triterpenos; Fracción C: No mostró presencia de metabolitos; Fracción
D: No mostró presencia de metabolitos

- Se determinó la Fracción B como de interés y fue sometida a purificaciones mediante

técnicas cromatográficas como: cromatografía en columna (CC), cromatografía en
capa fina (CCF) y cromatografía preparativa de cristal (PTLC). Realizándose un total
de 7 eluciones para la Fracción B del extracto etanólico crudo, obteniéndose un total
de 38 fracciones purificadas que fueron sembradas en CCF, observadas en luz UV y
recolectadas en un balón de vidrio de 500ml. Las fracciones purificadas fueron
concentradas en rotaevaporador y se obtuvo un peso de 0.83g (830mg)

- Se purificó la muestra de 830mg en PLTC y se obtuvo un total de 70mg de extracto

purificado final.

- Se identificaron las muestras utilizando HPLC-DAD-ESI-MS en el Centro

de Estudios para el Desarrollo de la Química (CEPEDEQ) de la Facultad de Ciencias

72
______________________________________________________________Referencias Bibliográficas

Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile y se encontró la presencia de

los siguientes metabolitos secundarios en la muestra purificada: espatulenol,
quercetina, isoquercetina y miricetina; entre otros.

- Se recomienda buscar nuevas metodologías extractivas para obtener y aislar con

amplios rendimientos, algún compuesto que revista interés por su potencial uso
farmacológico, dentro de los metabolitos secundarios de la especie Schinus molle var.
areira L (DC.)

73
______________________________________________________________Referencias Bibliográficas

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

74
______________________________________________________________Referencias Bibliográficas

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78
_________________________________________________________________________________Anexos

ANEXOS

Anexo 1. Cálculo de rendimientos de extracto crudo y sus fracciones

Cálculo de rendimiento del extracto crudo

Masa de material vegetal seco inicial: 30.12g

Masa de balón de vidrio de 250ml vacío: 113.56g

Masa de balón de vidrio de 250ml más extracto crudo rotaevaporado: 115.80g

Masa de extracto crudo: 2.24g (corresponde al 100% para calcular los rendimientos de las
fracciones obtenidas)

𝒈 𝒅𝒆 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒐 𝒄𝒓𝒖𝒅𝒐 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍

% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 = 𝒙𝟏𝟎𝟎
𝒈 𝒅𝒆 𝒎𝒂𝒕𝒆𝒓𝒊𝒂𝒍 𝒗𝒆𝒈𝒆𝒕𝒂𝒍 𝒔𝒆𝒄𝒐

2.24𝑔
% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥100
30.12𝑔

% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒐 𝒄𝒓𝒖𝒅𝒐 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍 = 𝟕. 𝟒𝟑%

Cálculo de rendimientos para fracciones del extracto crudo

Fracción A

Masa de balón de vidrio de 100ml vacío: 62.33g

Masa de balón de vidrio de 100ml más Fracción A rotaevaporada: 62.96g

Masa Fracción A: 0.63g

𝒈 𝒅𝒆 𝑿 𝒇𝒓𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 = 𝒙𝟏𝟎𝟎
𝒈 𝒅𝒆 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒐 𝒄𝒓𝒖𝒅𝒐 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍

0.63𝑔
% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥10
2.24𝑔

% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝑭𝒓𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏 𝑨 = 𝟐𝟖. 𝟏𝟑%

79
_________________________________________________________________________________Anexos

Fracción B

Masa de balón de vidrio de 100ml vacío: 43.44g

Masa de balón de vidrio de 100ml más Fracción B rotaevaporada: 43.85g

Masa de Fracción B: 0.41g

𝒈 𝒅𝒆 𝑿 𝒇𝒓𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 = 𝒙𝟏𝟎𝟎
𝒈 𝒅𝒆 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒐 𝒄𝒓𝒖𝒅𝒐 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍

0.41𝑔
% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥100
2.24𝑔

% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝑭𝒓𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏 𝑩 = 𝟏𝟖. 𝟑𝟎%

Fracción C

Masa de balón de vidrio de 250ml vacío: 114.32g

Masa de balón de vidrio de 250ml más Fracción C rotaevaporada: 114.33g

Masa de Fracción C: 0.01g

𝒈 𝒅𝒆 𝑿 𝒇𝒓𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 = 𝒙𝟏𝟎𝟎
𝒈 𝒅𝒆 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒐 𝒄𝒓𝒖𝒅𝒐 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍

0.01𝑔
% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥100
2.24𝑔

% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝑭𝒓𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏 𝑪 = 𝟎. 𝟒𝟒𝟔%

Fracción D

La Fracción D fue sometida al liofilizador durante dos períodos, el primero de 7.5 horas y el
segundo de 9 horas y 14 minutos. Los resultados son detallados a continuación:

80
_________________________________________________________________________________Anexos

Masa de tubo Falcon de plástico de 50ml vacío: 13.11 g

Masa de tubo Falcon de plástico de 50ml más Fracción D liofilizada: 14.34g

Masa de Fracción D liofilizada: 1.23g

𝒈 𝒅𝒆 𝑿 𝒇𝒓𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 = 𝒙𝟏𝟎𝟎
𝒈 𝒅𝒆 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒐 𝒄𝒓𝒖𝒅𝒐 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍

1.23𝑔
% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥100
2.24𝑔

% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝑭𝒓𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏 𝑫 = 𝟓𝟒. 𝟗𝟏%

Anexo 2. Cálculos para la Cromatografía en capa fina preparativa de cristal

Cálculo de masa del extracto contenido en el balón de vidrio de 500ml

- Balón de 500ml

Masa de balón vacío de 500ml: 163.13g

Masa de balón + fracciones purificadas en CC: 163.96g

Masa de las fracciones purificadas para el balón de 500ml: 0.83g ~ 830mg (sembrado en
PTLC)

- Cálculo de PLTC para la muestra de 830mg

Masa tubo Eppendorf 1ml: 1.0126g

Masa tubo Eppendorf 1ml + Muestra250: 1.1704g

Masa de Muestra830: 0.1578g ~ 157.8mg

Peso de vaso precipitado de 25ml: 20.35g

Peso de vaso precipitado + extracto obtenido por PTLC: 20.42g

Peso del extracto purificado a partir de la Muestra830: 0.07g ~ 70mg

81
_________________________________________________________________________________Anexos

Anexo 3. Diagrama de abundancia relativa (%) versus tiempo de retención

82