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CONCLUSIÓN
Las estrategias de la ingeniería de la proteína se utilizan a menudo para optimizar
rasgos de la enzima. Tanto el diseño racional como la evolución dirigida se han
utilizado para adaptar las propiedades enzimáticas (74, 75). El diseño racional
requiere un conocimiento profundo de las estructuras parentales, secuencias de
consenso e interacciones entre residuos de aminoácidos para identificar
mutaciones que conducirían a propiedades enzimáticas deseadas, especialmente
el alto nivel de termoestabilidad y eficiencia catalítica requerida para aplicaciones
industriales. En el presente trabajo, aplicamos un método de diseño racional para
diseñar una nueva α-amilasa adaptada al frío con termoestabilidad mejorada,
afinidad de unión al sustrato y eficacia catalítica en varias extensiones. En una
variante (E166P / S185P / T350P), introdujimos residuos Pro en los dominios A y
B en bucles superficiales. En la segunda variante (V212T / V232T), facilitaron
interacciones extra moleculares en el núcleo catalítico de la proteína. El objetivo
de estas sustituciones era rigidizar la estructura molecular de la enzima. De
hecho, la variante dirigida al sitio E166P / S185P / T350P mostró un fuerte
incremento en la termoestabilidad con respecto al tipo salvaje, mientras que la
variante dirigida al sitio V212T / V232T mostró un mayor impacto a la eficacia
catalítica en comparación con las enzimas con superficie Mutaciones. Todos
nuestros sitios de mutación se seleccionaron sobre la base de los análisis
estructurales y de consenso entre la enzima adaptada al frío y su contraparte
mesófilo. A diferencia de la mutagénesis dirigida únicamente basada en el análisis
estructural de proteínas que a menudo muestra un impacto adverso a los
parámetros cinéticos, el enfoque de consenso guiado por la estructura supone
que la naturaleza ha optimizado eficientemente el espacio de secuencia de la
proteína. Por consiguiente, un único punto de interés mutacional para posiciones
que coinciden con el deseado límite de consenso ha demostrado ser un enfoque
exitoso para ser usado en enzimas de ingeniería con parámetros cinéticos
mejorados (29, 77, 78). La combinación de análisis de secuencia y comparación
de modelos basados en homología parece ser un buen enfoque para el diseño
racional de las mutaciones para mejorar la estabilidad térmica y la eficiencia
catalítica de esta enzima (79, 80). Nuestro estudio apoya este enfoque
multidisciplinario para engendrar diversidades estructurales en catálisis y para la
optimización de aplicaciones industriales particulares. La α-amilasa de E. focardii
que hemos diseñado es prometedora para aplicaciones industriales no sólo por
su eficiencia en el frío, sino también porque representa una enzima alcalina,
similar a la α-amilasa de los Bacillus spp. (11, 54) y diferente de la mayor parte
de la Α-amilasas caracterizadas hasta ahora. Esta característica puede
considerarse una propiedad importante para ser utilizada en las industrias
detergentes y textiles y en otras aplicaciones industriales.