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Profesor:Daniel Moena
DNA recombinante
3.- Cuáles son las tres características que tienen los plásmidos usados como
vector de clonamiento
R: Son moléculas de ADN circular relativamente pequeñas de varios miles pares de
nucleótidos que pueden replicarse dentro de la bacteria, este vector contiene un origen de
replicación que le permite replicarse en una célula bacteriana de forma independiente del
cromosoma bacteriano. Este además tiene un sitio de corte para una enzima de
restricción específica, de modo que se pueda abrir el plásmido e insertar el fragmento de
DNA extraño.
los plásmidos, además suelen contener un gen que codifica algunas propiedades
seleccionables, como la resistencia a los antibióticos, lo que le permite identificar las
bacterias que ingresan al DNA recombinante.
Pasos:
Primero se extrae el ADN humano a partir
de una muestra de tejido o cultivo celular
y se corta con una enzima, que produce
millones de fragmento diferentes de DNA.
A continuación, se realiza la ligación en
vectores plasmídicos de la mezcla de los
fragmentos de DNA en condiciones que
favorecen la inserción de un fragmento
de DNA para cada molécula de plásmido.
Estos plásmidos recombinantes se
mezclan con un cultivo de E. coli a una
concentración que asegure que no se
incorpora más de una molécula de
plásmido por cada bacteria.
Pasos:
Se extrae el mRNA total de las células, y
las copias de DNA de las moléculas de
mRNA son producidas por la enzima
transcriptasa inversa.
A continuación, se clonan las moléculas
de DNA complementario o cDNA, como se
realiza con los fragmentos de DNA
genómico descritos antes, para producir la
genoteca de cDNA.
7.- La técnica de PCR permite amplificar una región del DNA. Para ello se
deben realizar alrededor de 24 ciclos. Cada ciclo de amplificación consiste
en:
R: ¿Que es la PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común
utilizada para hacer muchas copias (¡millones o miles de millones!) de una región
particular de ADN. Esta región de ADN puede ser cualquier cosa que le interese al
experimentador. Por ejemplo, podría ser un gen cuya función quiere entender un
investigador o un marcador genético usado por científicos forenses para relacionar el ADN
de la escena del crimen con los sospechosos.
Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco para
que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN amplificado
por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en gel o clonar en un plásmido
para otros experimentos.
PASOS DE LA PCR:
a) Desnaturalización (96°C): la reacción se calienta bastante para separar, o
desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para
el siguiente paso.
b) Templado (55- 65°C): la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a
sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.
c) Extensión (72°C): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa
extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.
8.- Cuándo se utiliza la técnica de RT-PCR?
R: Se utiliza para la detección y amplificación de ARN. Permite estudiar la expresión de
determinados genes (su traducción a proteínas). En primer lugar, se extrae el ARNtotal de
las células en estudio y se separa la fracción correspondiente al mensajero (ARNm). Tras
purificarlo el ARN se transcribe a ADN mediante una transcriptasa inversa, por cada
molécula de ARNm se sintetiza una molécula de cADN monocatenaria que
posteriormente se ha de convertir en bicatenaria utilizando una ADN polimerasa (la rTth
ADN polimerasa de Thermus thermophilus es un enzima recombinante y termoestable
que actúa como transcriptasa inversa y como ADN polimerasa simultáneamente). A partir
de aquí se aplica la técnica de PCR lo que permite una detección de la expresión de
ARNm mucho más sensible que con Northern blot o con hibridación in situl76. La,80.
secuencia del fragmento amplificado se determina mediante secuenciación automática de
ADN.
9.- En el método de secuenciación de Sanger se utiliza principalmente:
DNA polimerasa, dXTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) y ddXTP
Cuál es el rol de c/u ?
DNA polimerasa: se utiliza para producir copias parciales de fragmentos de DNA a ser
secuenciados.
dATP: es el nucleótido precursor utilizado en la célula para incorporar la base nitrogenada
adenina al DNA durante el proceso de replicación de éste.
dTTP: es uno de los cuatro nucleótidos trifosfato que se utilizan en la síntesis de ADN en
la célula. En el laboratorio es usado por la ADN ligasa para crear extremos protuberantes
durante un experimento de clonación.
dGTP: se utiliza para la síntesis de ADN.
dCTP:
ddXTP: Los didesoxinucleótidos (abreviados como ddNTP) son nucleótidos que carecen
de un grupo 3'-hidroxilo (-OH) en la desoxirribosa.
La falta de este grupo hidroxilo implica la imposibilidad de formar un enlace fosfodiéster
con otros nucleótidos, el cual se produce entre el grupo 5'-fosfato de uno y el grupo 3'-
hidroxilo de otro. Por tanto, durante la replicación de una molécula de ADN, la adición de
un ddNTP a la cadena de nueva síntesis supone que el proceso se detenga. Esto es útil
en procesos de secuenciación de ADN, como en el método de Sanger.
10.- En la tecnología del DNA recombinante se utilizan varias enzimas, indique rol de c/u
- DNA ligasa: Enzima que une dos cadenas de DNA por sus extremos.
- DNA polimerasa Taq: la polimerasa Taq es un tipo de ADN polimerasa termoestable,
nombrada de esta forma debido a que es producida por la bacteria Thermus aquaticus (T-
aq) y a partir de la cual fue aislada en el año 1968 por Thomas D. Brock. A menudo suele
abreviarse como "Taq Pol" (o simplemente como "Taq"), y es frecuentemente utilizada en
las técnicas de PCR, un método que se utiliza para amplificar secuencias cortas de ADN.
- Transcriptasa inversa: Enzima que fabrica una copia de DNA bicatenario a partir de
una molécula molde de RNA monocatenario. Presente en los retrovirus y parte de la
maquinaria de transposición de los retrotansposones.
- Enzimas de restricción: Es aquella que puede reconocer una secuencia característica
de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto,
llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a este. Los sitios de
restricción cuentan con entre cuatro y seis pares de bases, con las que son reconocidos.
11.- Defina:
- Animal transgénico: Son organismos a los cuales se les ha agregado un nuevo gen o
aquellos que cuyos genomas han sido modificados de otros modos usando recombinación
de ADN.
- Clon: Seres genéticamente idénticos que descienden de un mismo individuo, pero por
reproducción asexual.
- partidor o primer: Secuencia de nucleótidos que sirve de punto de partida para la
replicación de ADN.
Figura 2: Osmosis
Tráfico de proteínas
Las vesiculas revestidas de tipo COPI y COPII tienen un tamaño de 60-90 nanometros.
Independiente del tipo de cubierta utilizada la Clatrina, COPI y COP II, el mecanismo que
dirige la formación de vesículas revestidas es básicamente el mismo en los tres complejos
proteicos (aunque difieren en los detalles específicos).
Metabolismo celular
1.- En una reacción de óxido-reducción, A le entrega electrones a B. ¿Quién
se oxida? ¿Quién se reduce? ¿Cuál es el reductor? ¿Cuál es el oxidante?
R: Las reacciones de oxidación -reducción se deben, principalmente, a la transferencia de
electrones desde un agente reductor a un agente oxidante.
En una reacción REDOX u óxido reducción, una especie se oxida (cede electrones) y la
otra especie se reduce (gana electrones). Como estas dos situaciones ocurren en la
misma reacción, los electrones cedidos por la especie que se oxida, son empleados por la
especie que se reduce, que debe ganar electrones.
gente oxidante
En toda reacción redox, el agente oxidante es la especie química que se reduce, es decir,
la que recibe los electrones. Tengan en cuenta, que en la semir-reacción de reducción, se
consumen los electrones.
En la ecuación, observamos que el ion cobre (Cu2+) se reduce, porque recibe los
electrones que provienen del zinc y se convierte en cobre elemental, Cu(s) eléctricamente
neutro.
Por lo tanto el ion Cu2+ es el agente oxidante.
Agente Reductor
En toda reacción redox, el agente reductor es la especie química que se oxida, es decir, la
que cede electrones. Tengan en cuenta que en la semi-reacción de oxidación, se
producirán electrones.
En la ecuación, el Zn(s) es el agente reductor, ya que en la semireacción se producen
electrones, lo que significa que el zinc se oxida y se transforma Zn2+.
Por lo tanto el Zn, es el agente reductor.
Especie Oxidada
Será la especie que recibió los electrones, en nuestro ejemplo el Zn2+.
Especie Reducida
Será la especie que perdió los electrones, en nuestro ejemplo el Cu.
2.- Describa como el NADH permite la síntesis de ATP. ¿Cuáles son los
productos finales de la fosforilación oxidativa?
R:
11.- Por qué el rendimiento en ATP es menor cuando se reoxida el FADH2 en la cadena
transportadora de electrones comparado con el rendimiento en ATP para reoxidación del
NADH + H+ ?
Citoesqueleto