MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

PRACTICA No 6. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS NMP

INTRODUCCIÓN

La investigación sobre los productos alimenticios o sus constituyentes requiere

especial atención para detectar aquellos microorganismos que los deterioran o que
son patógenos para el consumidor. El exámen microbiológico permite obtener
pautas para el establecimiento de normas de higiene aplicables durante la
producción y de métodos eficaces de conservación.

Microorganismos indicadores: Este término se aplica a cualquier taxonómico,

fisiológico o ecológico de microorganismos cuya presencia proporciones evidencia
indirecta de que los alimentos estuvieron expuestos a condiciones que pudieron
determinar la llegada de microorganismos peligrosos o permitir la proliferación de
especies patógenas o toxigénicas. Los organismos patógenos son de gran utilidad
tanto para determinar la calidad bacteriológica como la garantía que ofrecen al
consumidor.

Escherichia coli y coliformes: Son organismos que habitan en el tracto digestivo de

los hombre y los animales. Su presencia en un alimento indica contaminación
directa o indirecta de origen fecal. La presncia de E. coli advierte el riego de que
pudieran estar presentes bacterias patógenas entéricas, entre ellas algunas de los
géneros Salmonella, Shigella y Vibrio, así como virus entéricos y parásitos diversos.

Los otros coliformes (especies de varios géneros de la familia Enterobacteriaceae),

son buenos indicadores de limpieza y desinfección inadecuadas, o de una
industrialización o tratamiento incorrecto de los alimentos.. La presencia de niveles
altos de coliformes en un alimento tratado, no indica necesariamente un contacto
inmediato con heces o con superfícies contaminadas con heces. Indica que
pudieron existir circunstancias favorecedoras de la multiplicación de estos
microorganismos introducidos probablemente por deficiente limpieza o desinfección.

Streptococcus salivarus: Se ha utilizado como indicador de contaminación oral,

debido a que está casdi siempre presente en la boca humana.

Staphylococcus aureus: Su presencia se interpreta como contaminación

proveniente de la piel, boca o fosas nasales de los manipuladores.

Clostridium botulinum y Clostridium perfringens : La presencia de esporas en

alimentos enlatados no ácidos, es señal de que posiblemente el trtamiento térmico
fue insuficiente.

OBJETIVOS
1
Determinar la calidad del producto en términos de contaminación microbiana

Establecer el número y tipo de microorganismos que se encuentran en distintos

alimentos.

MATERIALES

- Cajas de petri esterilizadas

- Pipetas esterilizadas
- Pipetas pasteur esterilizadas
- Frasco con 90 ml de agua peptonada
- Tubos de ensayo con 9 mL de caldo lactosado
- Erlemeyer con agar cuenta gérmenes
- Erlemeyer con agar McConkey
- Erlemeyer con agar saboraud
- Erlemeyer con agar AMB
- Gradilla para tubos
- Mechero
- Cinta de enmascarar
- Caldo lauryl sulfato
- Caldo brila
- Caldo triptona
- Reactivo de Kovacks
- Agar cristal violeta
- Rojo neutro bilis glucosa
- Reactivo de catalasa

METODOS

1. Dilución de la muestra de alimento:

a) Comenzar el trabajo lo más pronto posible. Mantener en refrigeración hasta
24 horas después de tomada la muestra.
b) Antes de abrir los envases que contienen se deben desinfectar con alcohol al
70% y agitarse vigorosamente para homogenizar. Si es un material sólido se
debe utilizar unmortero estéril para obtener fragmentos muy pequeños.
c) Se preparan las diluciones del alimento 10-1 a 10-3
d) La dilución 10-1 se prepara midiendo 10 mL o 1 gramo de la muestra en un
frasco que contenga 90 mL de diluyente agua peptonada..
e) Transferir 1 mL de la dilución 10-1 a un tuibo que contenga 9 mL de diluyente
para obtener la dilución 10-2 y así sucesivamente se preparan las siguientes
diluciones. (Ver figura 1).
f) Cada dilución sucesiva disminuirá 10 veces la concentración. No olvidar
marcar convenientemente los tubos.

2
Figura 1. Método de diluciones sucesivas

2. Inoculación del alimento

2.1 Número más probable de coliformes totales y fecales:

2.1.1 Prueba presuntiva para coliformes totales:

a) Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones (10-1 a 10-3) en tubos con
caldo lauryl sulfato, utilizando tres tubos por dilución.
b) Inocular los tubos a 37oC por 24-48 horas.

c) Pasadas las 24-48 horas anotar los tubos que muestren producción de gas,
que se puede observar por el desplazamiento del tubo Durham. (ver figura)

Figura 2. Tubos positivos con producción de gas para prueba presuntiva

3
 2.1.2 prueba confirmativa para coliformes totales:

a) Confirmar que los tubos con producción de gas en la prueba pesuntiva son
positivos inoculando 3 a 5 gotas en otros tubos con caldo brila y triptona.
b) Inocular los tubos a 44.5 oC por 24 horas en baño de maría.
c) Pasadas las 24 horas anotar los tubos que muestren producción de gas.
d) Anotar los tubos quemuestren producción de gas y revelar el caldo triptona
con el reactivo de Kovacs, agitar suavemente y observar la presencia de un
anillo rojo en la superfície cuando el tubo es positivo; cuando el tubo es
negativo no se observa cambio.

Figura 3. Prueba positiva para el reactivo de Kovacs con formación de anillo rojo.

2.2 Interpretación de los resultados

a) Leer la tabla del NMP (Número más probable) para saber el resultado de
acuerdo con el número de tubos positivos, tanto para los coliformes totales,
según el resultado de la prueba confirmativa y para los coliformes fecales,
según el caldo brila y el caldo triptona incubados a 44.5oC. (ver tabla)
b) Los tubos positivos de la prueba confirmativa, se deben sembrar por estría,
tomando una asada de cada uno de los tubos en la superfície de la placa de
agar EMB (Eosina azul de metileno).
c) Incubar las cajas invertidas a 37oC por 24-48 horas.
d) Pasado este tiempo se hacen las lecturas de las colonias típicas de
coliformes, aquellas que presentan un brillo verde metálico.

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 Tablas del número más probable
Número de tubos con Número de tubos con
turbidez inoculados a turbidez inoculados a
NMP NMP
partir de tres diluciones partir de tres diluciones
sucesivas sucesivas
0 1 0 0,18 5 0 0 2,3
1 0 0 0,20 5 0 1 3,1
1 1 0 0,40 5 1 0 3,3
2 0 0 0,45 5 1 1 4,6
2 0 1 0,68 5 2 0 4,9
2 1 0 0,68 5 2 1 7,0
2 2 0 0,93 5 2 2 9,5
3 0 0 0,78 5 3 0 7,9
3 0 1 1,1 5 3 1 11,0
3 1 0 1,1 5 3 2 14,0
3 2 0 1,4 5 4 0 13,0
4 0 0 1,3 5 4 1 17,0
4 0 1 1,7 5 4 2 22,0
4 1 0 1,7 5 4 3 28,0
4 1 1 2,1 5 5 0 24,0
4 2 0 2,2 5 5 1 35,0
4 2 1 2,6 5 5 2 54,0
4 3 0 2,7 5 5 3 92,0
5 5 4 160,0

3. Recuento de mesífilos (agar cuenta gérmenes)

Su presencia puede reflejar deficiencias en el proceso de elaboración, su

contaminación en la manipulación durante el empaque.

a) Transferir por duplicado alícuotas de 1 mL de cada una de las diluciones

10-1 a 10-5 en cajas de petri vacías estériles y previamente marcadas.
b) Inmediatamente verter en las cajas agar cuenta gérmenes fundido
manteniendo a una temperatura de 45oC.
c) Inmediatamente mezclar el inóculo con el mediofundido; la manera más
indicada para hacer esta operación es moviendo suavemente la caja en
forma cirlular.
d) Dejar solidificar el agar
e) Invertir e incubar las cajas de petri a 37oC durante 24 horas
f) Leer los resultados

Los resultados deben ser expresados con dos dígitos y el resto en potencia de 10

5
Ej: Si el recuento se realiza en una dilución de 10-2 y fue de 148 colonias, el tercer
dígito por ser mayor a 5 permite adicionar una unidad al segundo, o sea el recuento
será de 15000= 1.5 X 103.

Si el recuento fue 234 por ser el tercer dígito menor que 5 se anula y se expresa
23000= 2.3X103.

4. Recuento de enterobacterias totales.

La contaminación de alimentos generalmente se adquiere por un proceso de

manipulación inadecuada y posterior a la preparación misma del producto.

a) Transferir por duplicado alícuotas de 1 mL de cada una de las diluciones

10-1
a 10-3 en cajas de petri estériles, previamente marcadas.
b) Inmediatamente verter el agar cristal violeta rojo neutro bilis glucosa.
c) Mezclar las diluciones con el medio, agregar 5 mL del anterior agar
d)Después de solidificada la cepa, incube por 24 horas
e) Seleccionar las placas que contengan entre 30 y 300 colonias violetas,
rodeadas de precipitado rojo violeta.
f) Confirmar estas colonias con la prueba de oxidasa.

5. Pruebas de oxidasa
Tomar una colonia del crecimiento del agar cristal violeta rojo neutro bilis
glucosa, sembrar en la supeefície de agar nutritivo inclinado, incubar a 37oC
por 24 horas.

Después de la incubación realizar la prueba, tomando una colonia del

crecimiento del agar nutritivo, colocándola sobre un papel blanco, adicionarle
una gota del reactivo de oxidasa; si la colonia se torna de color rosado la
prueba es positiva; si permanece del mismo color, la prueba será negativa.

6. Recuento de hongos y levaduras

La presencia de hongos y levaduras en los alimentos se da generalmente por
contaminación del aire en el momento de empaque, por manipulación de
personas con lesiones en la piel ocasionadas por hongos o por mal
almacenamiento del producto.

a) Transferir por duplicado alícuotas de 1 mL de cada una de las diluciones

(10-1 a 10-3) en cajas de petri estériles previamente marcadas.
b) Inmediatamente verter el agar Saboraud fundido y mantenido a 45oC ,
mezclar suavemente.
c) Dejar solidificar
d) Invertir e incubar a temperatura ambiente durante 5 a 8 dias
e) Se procede de aquí en adelante igual que en el recuento de mesófilas.

7. Cuestionario

1. Cual es fundamento de las diferente pruebas que ha realizado?

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2. Cuales son los componentes de cada uno de los medios de cultivo y por que
se utilizan.