LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

SEMESTER GENAP 2015 – 2016

ANALISIS KUALITATIF PROTEIN

(XANTOPROTEIN) DAN ANALISIS KUANTITATIF
KADAR PROTEIN TOTAL (METODE BIURET)

Hari / Jam Praktikum : Senin / 13.00-16.00 WIB

Tanggal Praktikum : 6 April 2016

Kelompok :5

Asisten : 1. Alsya Utami Rahayu

2. Yulina Saragih

LABORATORIUM BIOKIMIA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

JATINANGOR
 2016

I. TUJUAN
1.1. Mengidentifikasi protein pada suatu sampel menggunakan pereaksi
xantoprotein.
1.2. Menentukan kadar protein dari suatu sampel menggunakan uji biuret.

II. PRINSIP
2.1. Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif merupakan analisis untuk melakukan identifikasi
elemen, spesies dan/atau senyawa senyawa yang ada di dalam sampel
(Gandjar dan Abdul, 2012).
2.2. Pereaksi Xantoproteat
Pereaksi xantoproteat adalah reagen yang digunakan dalam salah satu
metode penghitungan jumlah protein yang ada di dalam larutan
menggunakan asam nitrat (Chatterjea, 2004).
2.3. Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif adalah penyelidikan kimia mengenai kadar unsur atau
senyawa ion yang terdapat dalam suatu zat tunggal/campuran (Sukardjo,
1985).
2.4. Metode Biuret
Metode biuret didasarkan pada kompleksisasi ion Cu 2+ terhadap gugus
fungsional pada ikatan peptide protein (Keppy and Michael, 2009).
2.5. Kolorimetri
Kolorimetri adalah metode perbandingan menggunakan perbedaan
warna. Metode kolorimetri mengukur warna suatu zat sebagai
perbandingan (Bassett dkk., 1991).
III. REAKSI
3.1. Sampel + HNO3

(Sundin, 2004).
3.2. Sampel + NH4OH

(Sundin, 2004).
3.3. Sampel + Pereaksi Biuret

(Sundin, 2004).
IV. TEORI DASAR
Kata protein berasal dari protos atau proteos yang berarti pertama atau
utama. Protein ialah ikatan peptida yaitu terjadi antara atom C dari gugus –
COOH dengan atom N dari gugus NH2. Protein merupakan komponen
penting atau komponen utama sel hewan atau manusia. Oleh karena sel itu
merupakan pembentuk tubuh kita, maka protein yang terdapat dalam
makanan berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan dan pertumbuhan
tubuh. Kita memperoleh protein dari makanan yang berasal dari hewan atau
tumbuhan. Protein yang berasal dari hewan disebut protein hewani,
sedangkan yang berasal dari tumbuhan disebut protein nabati. Beberapa
makanan sumber protein adalah daging, telur, susu, ikan, beras, kacang,
kedelai, gandum, jagung dan buah-buahan (Poedjiadi, 1994).
Berdasarkan molekulnya digolongkan menjadi dua, yaitu protein
globular dan protein fibrosa. Pada protein globular mempunyai bentuk bulat
atau hampir bulat atau hampir bulat dan bentuk molekul umumnya mudah
ditentukan. Larut dalam larutan garam, asam, basa atau alkohol. Contohnya
antara lain, albumin, globulin, proteonzim, proteohormon. Pada protein
fibrosa mempunyai bentuk memanjang, bentuk amorphous dan bentuk
molekul sukar ditentukan, dan tidak larut dalam larutan garam, asam, basa,
dan alkohol. Contohnya antara lain, keratin dan rambut, Fibroin dan sutra,
Kolagen dan tulang (Almatsier, 2001).
Ada beberapa metode pengujian protein yaitu:
1. Uji Biuret adalah salah satu cara pengujian yang memberikan hasil positif
pada senyawa-senyawa yang memiliki ikatan peptida. Pengujiannya dapat
dilakukan dengan cara berikut. Larutan yang mengandung protein ditetesi
larutan NaOH, kemudian diberi beberapa tetes larutan CuSO4 encer.
Terbentuknya warna ungu, menunjukkan hasil positif adanya protein.
2. Uji Xantoprotein, Pengujian ini memberikan hasil positif terhadap asam
amino yang mengandung cincin benzena, seperti fenilalanin, tirosin, dan
triptofan. Cara pengujiannya yaitu Ke dalam protein ini ditambahkan asam
nitrat pekat sehingga terbentuk endapan putih karena terjadi proses nitrasi
 terhadap cincin benzena. Jika dipanaskan, warna putih tersebut akan berubah
menjadi kuning.
3. Uji Millon, Pengujian ini memberikan hasil positif terhada protein yang
mengandung asam amino yang memiliki gugus fenol, misalnya tirosin.
Pereaksi Millon terdiri atasa larutan merkuro nitrat dan merkuri nitrat dalam
asam nitrat. Protein dengan pereaksi Millon akan membentuk endapan putih.
Jika dipanaskan, warnanya berubah menjadi merah (Lehninger,1982).
Pembagian tingkat organisasi protein ada empat yaitu: struktur primer
yaitu ikatan antar asam amino hanya ikatan peptida (ikatan kovalen), pada
struktur sekunder dimana rantai asam amino bukan hanya dihubungkan oleh
ikatan peptida tetapi juga diperkuat oleh (ikatan hidrogen) dan pada struktur
tersier terbentuk karena terjadinya polipeptida (folding) dan yang terahir pada
struktur kuartener juga terbentuk tersier dan bisa terdiri dari prometer yang
sama atau berlainan (Keppy and Michael, 2009).
Melalui reaksi hidrolisis protein telah di dapatkan 20 macam asam amino
yang dibagi berdasarkan gugus R-nya berikut dijabarkan penggolongan
tersebut. Asam amino nonpolar dengan gugus R yang dihidrofolik antra lain:
alanin, valin, leusin, isoleusin, prolin, fenilalanin, triptofan, dan metionin.
Asam amino polar tanpa muatan pada gugus R yang beranggotakan: lisin,
serin, treonin, sistein, trirosin, asparagin, dan glutamin (Samadi, 2012).
Kasein adalah protein yang paling banyak tersedia di susu. Protein ini
relatif tidak bisa larut, lambat dicerna dan cenderung membentuk struktur
yang disebut misel yang meningkatkan kelarutannya di air. Protein dalam
susu terdiriatas 80% kasein dan 20% whey (Martoharsono, 1975).
Kasein termasuk jenis phospor protein, terdiri dari beberapa unit asam
amino yang terikat dengan ikatan peptida. Kasein didalam susu merupakan
partikel yang besar. Didalamnya tidak hanya terdiri dari zat-zat
organik,melainkan mengandung zat-zat anorganik seperti
kalsium,phosphor,dan magnesium (Martoharsono, 1975).
Kasein adalah protein yang khusus terdapat dalam susu. Dalam keadaan
murni, kasein berwarna putih seperti salju, tidak berbau dan tidak mempunyai
rasa yang khas. Kasein dapat diendapkan oleh asam, enzimerenner dan
alkohol. Oleh karena itu kasein dalam susu dapat dikoagulasikan atau
digumpalkan oleh asam yang terbentuk didalam susu sebagai aktivitas dari
mikroba. Kasein termasuk jenus phospoprotein,terdiri dari beberapa unit
asam amino yang terikat dengan ikatan peptida (Martoharsono, 1975).
Kasein merupakan protein yang stabil terhadap pemanasan dan tidak
mengalami denaturasi bila air susu dipanaskan. Kasein di dalam air
merupakan molekul besar yang terdiri dari zat-zat anorganik seperti kalsium,
fosfor dan sedikit magnesium serta sitrat. Kasein merupakan suatu misel yang
mengandung kalsium dan fosfat yang membentuk kalsium kaseinat
phosphatase kompleks. Titik isoelektris kasein pH 4,6 – 5,0 dan pada titik ini
kasein mudah sekali mengendap. Kasein dapat pula mengendap dengan
naiknya keasaman, perubahan Ca dan P yang larut menjadi menjadi tidak
larut dan terjadinya interaksi antara protein yang ada. (Anwar, 1994).
Wortel merupakan tanaman denganbetakaroten terkaya, unsur yang
mampu melindungi tubuh dari kerusakan sel. Sementara vitamin A dalam
wortel membantu menjaga kesehatan mata, kulit, dan rambut, serta
memperbaiki system imun tubuh. Kalsiumnya menjaga kesehatan tulang dan
gigi dan membantu kerja berbagai otot dan saraf (Pertiwi dan Arif, 2007).

Tabel Kandungan Nutrisi Wortel (Pertiwi dan Arif, 2007)

V. ALAT DAN BAHAN
5.1. Alat
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah bulb, beaker glass,
gelas ukur, penangas air, penjepit kayu, pipet tetes, pipet ukur, rak tabung
reaksi, spektrofotometer UV-Vis, dan tabung reaksi.
5.2. Bahan
Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah larutan
aquades, kasein, KI, larutan CuSO4 0,5%, larutan HNO3 pekat, larutan
sampel, larutan NaOH 10%, dan larutan NH4OH.
5.3. Gambar Alat

Bulb Beaker Glass

www.caesarvery.com labsuppliesusa.com

Gelas Ukur Penangas Air

sinarkimia.com www.indotekhnoplus.com

Penjepit Kayu Pipet Tetes

onemedhealthcare.com www.apotikpintar.com
 Pipet Ukur Rak Tabung Reaksi
jasakalibrasi.net www.jogjalabware.com

Spektrofotometer UV-Vis Tabung Reaksi

www.indotekhnoplus.com www.alfakimia.com

VI. PROSEDUR
6.1. Preparasi sampel
Sampel berupa wortel dipotong menjadi bagian bagian yang kecil.
Potongan wortel ditimbang seberat 100 mg. Wortel 100 mg diblender
dengan ditambahkan NaCl 100 ml. Setelah diblender wortel disaring
menggunakan kain saring. Setelah didapatkan filtrat sebagian sampel di
sentrifugasi dengan 30 rpm selama 5 menit. Dipisahkan dengan
endapannya.
6.2. Analisis kualitatif
Sampel sebanyak 1 ml didapatkan didalam tabung reaksi,
ditambahkan HNO3 3 tetes. Dipanaskan dalam penangas air yang sudah
mendidih. Sampel dibiarkan pada suhu ruangan sampai suhu normal.
Ditambahkan NH4OH sebanyak 10 tetes. Diamati perubahan warna yang
terjadi.
6.3. Pereaksi biuret
150 mg CuSO4 . 5H2O dan 600 mg Na-K-Tartrat dilarutkan kedalam
50 ml H2O. Ditambahkan larutan NaOH 10%. Ditambahkan H2O hingga
 batas 100 ml. Disimpan dalam botol gelap atau disimpan pada tempat
gelap. Jika akan digunakan dalam jangka waktu yang lama ditambahkan
KI 100 mg untuk menghambat reduksi.
6.4. Analisis kuantitatif
Kasein ditimbang 10 mg lalu dilarutkan dalam aquades sebanyak 10
ml pada labu ukur. Dimasukkan aquades sebanyak 50 µl pada kolom 1
dan 2. Kasein diambil 50 µl dimasukkan kedalam kolom B1 dan B2.
Melakukan pengenceran dengan diambil 50 µl dari kolom B1 dan B2 dan
dimasukkan ke dalam kolom C1 dan C2. Dilakukan pengenceran
bertingkat hingga kolom H1 da H2. Ditambahkan biuret sebanyak 150 µl
kedalam tiap kolom. Diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan.
Diamati absorbansinya pada gelombang 530 nm. Dilihat data
absorbansinya. Lalu dibuat kurva baku dan regresi linearnya.
Sampel yang sudah disentrifugasi sebanyak 5 ml dimasukkan
kedalam labu ukur 100 ml. Lalu ditambahkan aquades hingga batas
volume labu ukur. Dimasukkan aquades sebanyak 50 µl pada kolom 1, 2
dan 3. Sampel diambil 50 µl dimasukkan kedalam kolom E1, E2, dan
E3. Ditambahkan biuret sebanyak 150 µl kedalam tiap kolom. Diinkubasi
selama 30 menit pada suhu ruangan. Diamati absorbansinya pada
gelombang 530 nm. Dilihat data absorbansinya.Lalu ditentukan
konsentrasi protein.
VII. DATA PENGAMATAN
7.1. Data Pengamatan Kualitatif
No Perlakuan Hasil Foto
1. Memipet 1 ml sampel Didapatkan 1 ml sampel
menggunakan pipet volum. didalam piper volum.
2. Memasukkan sampel Didapatkan sampel
kedalam tabung reaksi. didalam tabung reaksi.

3. Menambhankan 3 tetes Didapatkan sampel

larutan HNO3 pekat. yang telah tercampur
dengan HNO3 dan
larutan terdapat
endapan putih.
4. Memanaskan air dengan Didapatkan air panas
beaker glass. didalam beaker glass.

5. Memasukkan tabung reaksi Didapatkan sampek

kedalam beaker glass. berwarna kuning.

6. Mendinginkan sampel Didapatkan sampel

didalam beaker glass yang dengan suhu ruangan.
berisi air.

7. Meneteskan NH4ON Didapatkan sampel

sebanyak 10 tetes kedalam berwarna kuning tua
tabung reaksi. dan endapan oranye.

7.2. Data Pengamatan Kuantitatif

No Perlakuan Hasil Foto
.
1. Memipet 5 ml Didapatkan sampel
sampel didalam pipet volum.
menggunakan pipet
volum.
2. Memasukkan Didapatkan sampel
kedalam labu ukur didalam labu ukur 100
100 ml. ml.

3. Menambahkan Didapatkan sampel yang

aquades hingga telah diencerkan
tanda batas. sebanyak 100 ml.

4. Mengisi mikroplate Didapatkan 50µl aquades

dengan 50µl pada mikroplate kolom
aquades pada kolom 1,2,3.
1,2 dan 3.

5. Menambahkan 50µl Didapatkan sampel

sampel kedalam sebanyak 50µl pada B1,
B1,B2,B3. B2, B3.

6. Mengencerkan dan Didapatkan sampel

mengambil 50µl sebanyak 50µ dikolom
kemudian C1, C2, C3.
memasukkan
kedalam kolom
C1,C2,C3.
7. Melakukan Didapatkan konsentrasi
pengenceran yang semakin kecil.
bertingkat hingga
koom H1,H3 dan
H3.
8. Menambahkan Didapatkan biuret
biuret sebanyak sebanyak 150µl pada tiap
150µl kedalam tiap kolom .
kolom .
9. Melakukan inkubasi Didapatkan sampel yang
selama 30 menit bereaksi dengan biuret.
pada suhu ruangan.
10. Mengganti Didapatkan data berupa
absorbansi dengan angka.
panjang gelombang
530 nm.
11. Mengisi mikroplate Didapatkan 50µl aquades
dengan 50µl pada mikroplate.
aquades pada kolom
1 dan 2.
12. Menambahkan 50µl Didapatkan sampel
kasein pada kolom sebanyak 50µl pada B1
B1 dan B2. dan B2.

13. Mengencerkan dan Didapatkan sampel

mengambil 50µl sebanyak 50µl dikolom
kasein kemudian C1 dan C2.
memasukkan
kedalam kolom C1
dan C2.
14. Melakukan Didapatkan konsentrasi
pengenceran yang semakin kecil.
bertingkat hingga
kolom H1 dan H2.
15. Menambahkan Didapatkan biuret
biuret sebanyak sebanyak 150 µl pada tiap
150µl kedalam tiap kolom.
kolom.
16. Melakukan inkubasi Didapatkan sampel yang
selama 30 menit bereaksi dengan biuret.
pada suhu ruang.
17. Mengamati Didapatkan data berupa
absorbansi dengan angka.
panjang gelombang
530 nm.
18. Membuat kurva Didapatkan kurva baku.
baku.
19. Mencari regresi Didapatkan regresi linear
linear dan R2. sebesar 0,9749.
20. Menghitung Didapatkan konsentrasi
konsentrasi protein. protein sebesar
3050,952381 µg/ml .

7.3. Data Absorbansi Kasein

Absorbansi Absorbansi -Blanko Rata-rata
No Konsentrasi absorbans
1 2 1 2
i
1. 100 0,250 0,108 0,127 0,03 0,0785
2. 50 0,150 0,086 0,072 -0,006 0,0330
3. 25 0,092 0,117 0,014 0,039 0,0265
4. 12,5 0,093 0,088 0,015 0,01 0,0125
5. 6,25 0,064 0,101 -0,014 0,023 0,0045
6. 3,125 0,083 0,105 0,005 0,027 0,016
7. 1,5625 0,091 0,106 0,013 0,028 0,0205
 7.4. Data Absorbansi Sampel
Absorbansi Konsentrasi
No Percobaan Absorbansi
blanko (µg/ml)
1. 1 0,342 0,264 3741,428571
2. 2 0,298 0,22 3112,857143
3. 3 0,241 0,163 2298,571429

7.5. Kurva Standar

KURVA BAKU

f(x) = 0x + 0
R² = 0.97
Linear ()

7.6. Perhitungan
Absorbansi Blanko = 0,080 dan 0,076
0,080+ 0,076
Rata-rata Absorbansi Blanko = =0,078
2

Perhitungan konsentrasi sampel

y = ax + b
Absorbansi = Slope [ ] + Intersep
1. Absorbansi = 0,264
y = 0,00007x + 0,0021
0,264 = 0,00007x + 0,0021
x = 3741,428571 µg/ml
2. Absorbansi = 0,22
y = 0,00007x + 0,0021
0,22 = 0,00007x + 0,0021
 x = 3112,857143 µg/ml
3. Absorbansi = 0,163
y = 0,00007x + 0,0021
0,163 = 0,00007x + 0,0021
x = 2298,571429 µg/ml

Rata-rata kadar
3741,428571+3112,857143+ 2298,571429
= =3050,952381µg /ml
3

VIII. PEMBAHASAN
8.1. Analisis Kualitatif
Protein merupakan unit penyusun utama tubuh. Protein juga merupakan
suatu polimer yang mempunyai monomer suatu asam amino. Asam amino
sendiri merupakan senyawa kimia yang mengandung 2 gugus fungsi yang
berbeda. Maka dari itu reaksi identifikasi suatu protein tidak jauh
dari reaksi kedua gugus fungsi tersebut. Asam amino merupakan unit
pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap
ujungnya. Protein tersusun dari atom C, H, O, dan N, serta kadang-kadang P
dan S. Dari keseluruhan asam amino yang terdapat di alam hanya 20 asam
amino yang yang biasa dijumpai pada protein. Dari struktur umumnya, asam
amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan
gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus
amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat
spesifiknya.
Analisis protein kali ini menggunakan test xantoprotein, yang pada
dasarnya test ini memiliki tujuan yang sama yaitu untuk menganalisis protein
yang ada pada sampel yang di amati, sampel yang digunakan yaitu wortel.
Untuk analisis protein yang pertama kami menggunakan metode
xanthoprotein.
Pada uji kualitatif dilakukan penambahan asam asetat 1 N, lalu diaduk
homogen dan didiamkan selama 10 menit. Pengadukan ini bertujuan agar
asam asetat dapat terdistribusi secara merata dalam sampel, dan pendiaman
bertujuan agar pengedapan dapat berlangsung secara maksimal. Penambahan
asam mengakibatkan penambahan ion H + yang kemudian akan mengadakan
reaksi dengan muatan negatif protein yang berasal dari gugus hiroksil
bebasnya, Semakin banyak konsentrasi H+ yang ditambahkan maka semakin
banyak pula penurunan pH dari susu sehingga titik isoelektriknya semakin
dekat, sehingga akan menetralkan protein dan menuju tercapainya pH
isoelektrik. Titik isoelektris adalah saat dimana pada pH tersebut asam amino
berada pada bentuk zwitter ion dan pada saat titik isoelektris ini kelarutan
protein menurun dan mencapai angka terendah dan akan menyebabkan
protein mengendap dan menggumpal. Pada saat titik isoelektris ini jumlah
kation dan anion yang terbentuk sama banyaknya. Pada titik isoelektris ini
kasein bersifat hidrofobik, kasein akan berikatan antar muatannya sendiri
membentuk lipatan ke dalam sehingga terjadi pengendapan yang relatif cepat.
Titik isoelektris kasein pH 4,6 – 5,0 dan pada titik ini kasein mudah sekali
mengendap. Dalam kondisi asam atau pH yang rendah, kasein akan
mengendap karena memiliki kelarutan yang rendah pada kondisi asam.
Penambahan asam dapat menghilangkan muatan listrik dari partikel kasein
karena asam akan mengikat kalsium dan kalsium kaseinat, sehingga kasein
menjadi terlepas dan terbentuk endapan.
Pertama kita melakukan penghancuran pada sample. Sample dimasukkan
sebanyak 1ml kedalam tabung reaksi. Sampel ditambahkan 3 tetes HNO3
pekat. Lalu di kocok dan hasilnya yaitu adanya endapan berwarna kuning di
dinding tabung reaksi namun tidak terlalu kuning karena kandungan protein
dalam wortel rendah. Hal ini karena protein mengalami denaturasi dengan
dengan cara nitritasi pada gugus aromatiknya. Selain itu juga asam juga
merubah struktur protein dengan cara memberikan H+ pada gugus –NH-
sehingga membentuk –N+H2-. Reaksi ini positif untuk protein yang
mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan. Warna yang terbentuk dalam
uji ini disebabkan oleh nitrasi inti benzene oleh asam nitrat pekat. Pada uji
xhanthroprotein umumnya apabila mengandung protein tinggi berubah warna
menjadi kuning pekat dan pada uji asam basa terdapat endapan. Berdasarkan
hasil pengamatan perubahan warna yang terjadi pada larutan sampel
semuanya berwarna pudar dan terjadinya endapan lama dikarenakan kadar
protein di dalamnya sangat rendah.

Reaksi antara tirosin dengan asam nitrat pekat

Tujuan dari penambahan HNO3 adalah untuk mereaksikan sampel agar
terjadi perubahan warna. Hasil yang terbentuk berupa kompleks warna
kuning dengan sedikit endapan warna kuning pula, setelah dipanaskan sampel
tersebut menjadi larutan kuning. Setelah mengalami pemanasan, larutan yang
mulanya memiliki warna kuning dengan sedikit gumpalan/endapan, warnanya
menjadi semakin kuning dan sedikit endapan yang ada kemudian larut
menjadi larutan. Warna larutan menjadi semakin kuning setelah dipanaskan
disebabkan karena proses pemanasan, yang menjadikan reaksi nitritasi
semakin cepat dan sempurna, sehingga nitritasi pada gugus aromatiknya
semakin banyak.
Protein yang mengandung residu asam amino dengan radikal fenil dalam
struktur kimianya (protein yang mengandung asam amino fenilalanin atau
tirosin) jika ditambahkan dengan asam nitrat pekat akan terbentuk gumpalan
warna putih. Pada pemanasan, warna gumpalan putih tersebut akan berubah
menjadi kuning yang akhirnya berubah menjadi jingga jika ditambah dengan
larutan basa. Sebenarnya, proses ini adalah proses nitrasi inti benzene pada
asam amino penyusun protein tersebut. Proses ini dapat terjadi jika kulit
terkena asam nitrat pekat, yang segera menjadi kuning karena terjadinya
proses nitrasi inti benzene pada asam amino penyusun kulit. (Sumardjo,
1987).
Protein bersifat tidak stabil dan mempunyai sifat dapat berubah
(denaturasi) dengan berubahnya kondisi lingkungan. Apabila larutan protein
tersebut diasamkan hingga mencapai pH 4,5-5 maka akan terjadi
pengendapan atau salting out. Sebaliknya apabila dipanaskan seperti dalam
pemasakan atau penggorengan, protein menggumpal atau terkoagulasi.
Protein juga dapat mengalami denaturasi apabila dilakukan pengurangan
kandungan air, baik selama pengeringan maupun pembekuan. Denaturasi
dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan Hidrogen, interaksi
hidrofobik, ikatan garam, dan terbukanya lipatan atau win molekul.
Ada dua macam denaturasi, yaitu pengembangan rantai peptida dan
pemecahan protein menjadi unit yang lebih kecil tanpa disertai
pengembangan molekul ikatan. Ikatan yang dipengaruhi oleh proses
denaturasi adalah :
a. Ikatan Hidrogen
b. Ikatan hidrofobik
c. Ikatan ionik
d. Ikatan intramolekuler.
Denaturasi protein adalah modifikasi konformasi struktur, tersier dan
kuartener. Denaturasi struktur merupakan fenomena dimana terbentuk
konformasi batu dari struktur yang telah ada. Denaturasi protein
mengakibatkan turunnya kelarutan, hilangnya aktivias biologi, peningkatan
viskositas dan protein mudah diserang oleh enzim proteolitik.
Kita dapat memperoleh protein dari bahan makanan yang banyak
mengandung protein, misalnya pada hewan terkandung protein hewani,
sedangkan pada tumbuhan terkandung protein nabati, beberapa protein yang
terkandung dalam makanan, yaitu:

Fenilalanin
Fenilalanin banyak terdapat pada ragi, lobak, telur, keju, alpukat
 Tirosin
Tirosin banyak terdapat ayam, ikan tuna

Triptofan
Triptofan banyak terdapat susu, pisang, daging seperti kambing, ayam
dan kalkun; yoghurt, ikan, telur, beras merah
8.2. Analisis Kuantitatif
Uji kuantitatif yang dilakukan bertujuan untuk mengukur konsentrasi
protein total yang terdapat pada sampel. Pengujian dilakukan dengan
menggunakan instrument microplate reader, dimana instrument ini mengikuti
hukum Lamber Beer seperti yang juga terdapat pada instrument
spektrofotometer UV.
Berdasarkan hukum Lamber Beer, nilai absorbansi suatu zat akan
berbanding lurus dengan ketebalan sel, konsentrasi, dan juga panjang
lintasan. Pada percobaan kali ini, variable yang akan diukur adalah nilai
konsentrasi yang akan dibandingkan dengan absorbansi yang didapat.
Pengukuran konsentrasi protein yang terdapat pada sampel sebagai
tujuan akhir dari reaksi ini diperoleh dengan menggunakan persamaan yang
didapat dari uji baku dan kemudian mengekstrapolasikan nilai absorbansi
sampel terhadap grafik baku ataupun persamaan baku yang dimiliki.
 Pada uji yang dilakukan, digunakan baku kasein sedangkan protein
sampel didapat dari supernatant hasil sentrifugasi wortel. Perbandingan nilai
absorbansi yang dimiliki sampel wortel terhadap baku kasein akan
menghasilkan kurva yang berbeda, hal ini disebabkan adanya factor protein
protein variation. Factor ini menerangkan bahwa setiap protein atau asam
amino memiliki ikatan kimia yang berbeda dengan sebuah reagen dimana
pada akhirnya akan menghasilkan nilai absorbansi yang berbeda. Oleh sebab
itu diperlukan pemilihan standar yang secara garis besar memiliki sifat yang
sama dengan sampel. Pada umumnya hal ini dilakukan dengan memlih baku
standar, dalam hal ini protein, yang melimpah pada banyak sampel dan
memiliki jenis ikatan yang sama antara reagen-sampel baku dan reagen-
sampel yang diuji..
Pada uji kuantitatif dengan metode biuret, ikatan yang terjadi adalah
kompleks khelasi antara ion Cu2+ dengan ikatan peptide yang dimiliki protein.
Hal ini menunjukkan bahwa uji dengan metode biuret mencerminkan uji yang
bersifat umum untuk semua jenis protein sebab semua protein memiliki
ikatan peptide antar asam aminonya. Oleh karena itu pemilihan standar
kasein sebagai baku diharapakan tidak memengaruhi hasil dari ekstrapolasi
untuk penentuan kosentrasi protein pada sampel wortel nantinya.
Prinsip dasar uji biuret adalah pembentukan kompleks antara reagen
biuret dengan ion Cu2+. Oleh karena protein memiliki ikatan peptide yang
mirip dengan ikatan pada reaksi biuret maka protein juga dapat membentuk
kompleks dengan ion Cu2+. Namun begitu, terdapat pula zat lain yang
memiliki struktur menyerupai biuret dan protein, yaitu urea. Urea dapat
berperan sebagai pengotor yang mengganggu reaksi. Selain itu, apabila
terdpaat sejumlah gugus pereduksi, sebgaai contoh gugus gula pereduksi pada
monomer glukosa, maka ion Cu2+ dapat tereduksi yang menyebabkan
kompleks khelasi protein-Cu2+ tidak terjadi. Hal lain yang perlu menjadi
perhatian adalah asam amino tunggal tidak dapat digunakan dengan reaksi ini,
minimal diperlukan dua buah ikatan peptide agar pewarnaan violet dapat
terjadi.
 Pembuatan kurva standar kasein pada percobaan kali ini menggunakan
prinsip pengenceran bertingkat dimana pembuatan baku kasein untuk tiap
konsentrasi di tiap langkah diperoleh dengan mengencerkan kasein yang
sebelumnya telah diencerkan pada langkah sebelumnya.
Selanjutnya setelah didapat variasi konsentrasi yang diinginkan maka
dilakukan penambahan reagen biuret. Penambahan reagen ini harus dilakukan
dengan cepat agar reaksi yang terjadi pada sampel dalam waktu inkubasi yang
telah ditentukan menjadi sama atau dengan kata lain kesempatan dalam
pembentukan kompleks untuk tiap konsentrasi sampel berlangsung dalm
waktu yang sama.
Proses inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 30 menit. Louis
Rosenfeld pada tahun 1982 mengatakan bahwa uji biuret dengan suhu
inkubasi yang dinaikkan sekitar 200 hingga 400 hanya akan berpengaruh
terhadap absorbansi sebesar 1%. Di lain hal, penggunaan variasi temperature
juga memungkinkan untuk meningkatkan resiko kesalahan.
Pengujian kadar protein protein sampel dengan reagen biuret
menggunakan instrumen microplate reaaer dimana panjang gelombang diatur
pada 530nm. Pemilihan panjang gelombang ini didsaarkan pada suatu prinsip
warna komplementer dimana jika suatu cahawa monokromatis diteruskan
pada suatu bahan berwarna maka sejumlah panjang gelombang dari cahaya
itu akan diserap oleh bahan dan sisanya akan ditransmisikan ataupun
direfleksikan ke mata pengamat. Dalam halnya reagen biuret, warna yang
dapat dilihat secara kasat mata adalah violet hasil pebentukan kompleks
khelasi antara reagen biuret dengan ikatan peptide, dimana panjang
gelombang yang dimiliki warna biru adalah 400-430nm. Selanjutnya dengan
penembankan cahaya monokromatis maka panjang gelombang maksimal
yang dapat diabsorbsi berada pada rentan lebih kurang 560nm yang
menghasilkan warna komplementer kuning.
Selanjutnya dilakukan pembacaan nilai absorbansi dengan instruen
microplate reader. Hasil untuk absorbansi blanko dengan reagen biuret yaitu
bernilai 0.08 dan 0.076. Hal ini menunjukkan bahwa raegen biuret dengan air
(blanko) juga dapat mengabsorb cahaya yang diberikan. Oleh karena itu
untuk perhitungan nilai absrobansi kasein tanpa dipengaruhi absorbsi cahaya
yang dilakukan reagen biuret maka nilai absorbansi yang ditunjukkan untuk
kasein dikurangi dengan nilai absorbansi yang ada pada blanko.
Kurva nilai rata-rata absorbansi baku kasein yang diplot terhadap
konsentrasi kasein menunjukan bahwa semakin besar konsentrasi maka
semakin pula nilai absorbansi yang dihasilkan. Hal ini sesuai dengan prinsip
Lambert Beer yang juga mendasari percobaan kali ini, yaitu niai absorbansi
berbanding lurus dengan nilai konsentrasi.
Namun nilai koefisien korelasi dan koefisien dterminasi yang dihasilkan
oleh kurva baku standar kasein menunjukkan nilai 0.9873 sedangkan nilai R 2
adalah 0.9748. Berdasarkan literature maka nilai ini sesungguhhnya kurang
valid jika digunakan sebagai standar dalam penentuan kadar suatu sampel.
Nilai koefisien determinasi (R2) minimum yang diharuskan adalah >0.998.
Nilai koefisien determinasi 0.998 menunjukkan bahwa 99.8% data yang ada
pada aksis y, dlam hal ini adalah absorbansi akan sesuai dengan aksis x, yaitu
konsentrasi sehingga dapat digunakan sebagai acuan dalam penentuan kadar
sampel yang tidak diketahui. Di lain hal, 0.2% sisanya merupakan data yang
bias.
Hal lain yang menjadi perhatian adalah nilai absorbansi yang amat kecil
yang terlihat dari nilai intersep yang didapat dari persamaan garis lurus
kurva. Nilai intersep yang didapat adalah 0.00206. pada umumnya nilai
 intersep yang diperlukan berkisar 0.2 sedangkan range absorbansi sampel
pada umumnya berada pada rentang 0.2 hingga 0.8. Hal ini menunjukkan
bahwa sampel kasein terlalu encer sehingga perlu dipekatkan kembali.
Berdasarkan ekstrapolasi yang dilakukan antara nilai absorbansi sampel
wortel dengan grafik kurva baku kasein maka dapat ditentukan nilai
konsentrasi protein total yang terdpaat pada sampel. Sampel wortel
menunjukkan nilai rata-rata protein total sebesar 286.0377 µg/ml. Namun
kadar protein yang didapat adalah nilai protein total yang tercermin dari
banyaknya kompleks yang terbentuk dari ikatan peptidan dan ion Cu 2+.
Apabila ingin ditentukan nilai masing-masing asam amino maka dapat
menggunakan baku standar yang berbeda seperti BSA ataupun BCA yang
bereaksi berdasarkan sasaran ikatan yang berbeda.

IX. KESIMPULAN
1. Protein dapat diidentifikasi dengan menggunakan pereaksi xantoprotein.
Sampel berupa wortel positif mengandung protein.
2. Kadar protein dapat ditentukan dengan menggunakan metode biuret. Kadar
protein dalam sampel berupa wortel adalah sebesar 3050,952381 µg/ml .
 DAFTAR PUSTAKA
Almatsier. 2003. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta : Gramedia.
Anwar, C. 1994. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Depdikbud Dirjen
Pendidikan Tinggi: Yogyakarta.
Basset dkk., 1991. Buku Ajar Vogel : Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik.
Jakarta : Kedokteran EGC.
Chatterjea. 2004. Textbook of Biochemistry for Dental/ Nursing/ Pharmacy
Student. India : Jaypee Brothers.
Gandjar dan Abdul. 2012. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar.
Keppy and Michael. 2009. Struktur dan Fungsi Kalogen. Jurnal F. Develomental
Biologi (2) 5, 19-29.
Lehninger. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta : Erlangga.
Martoharsono, S. 1975. Biokimia. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press.
Pertiwi, A.F. dan Arif L.G. 2007. 20 Resep Olahan Wortel Favorit Anak. Jakarta :
PT Gramedia Pustaka Utama.
Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : Universitas Indonesia
Press.
Rosenfeld, L. 1982. Origins of Clinical Chemistry: The Evolution of Protein
Analysis. United States of America : Academic Press Inc.
Samadi. 2012. Konsep Ideal Protein (Asam amino) Fokus Pada Ternak Ayam
Pedaging. Jurnal 12(2):42-48.
Sukardjo. 1985. Kimia Organik. Yogyakarta : Bima Aksara.
Sumardjo, D. 2009. Pengantar Kimia : Buku Panduan Kuliah Mahasiswa
Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Jakarta : Penerbit
Buku Kedokteran EGC.