Procedimiento Análisis de Agua Digesa

“AÑO DE LOS DERECHOS DE LA PERSONA CON
DISCAPACIDAD Y DEL CENTENARIO DEL NACIMIENTO DE

JORGE BASADRE GROHMANN”
MINISTERIO DE SALUD
Dirección General de Salud Ambiental
“DIGESA”
Las Amapolas N° 350 Lince Telf : 442-8353 - 442-8356
Fax: Anexo 225 e-mail: postmast@digesa.sld.pe
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS
METODO: TUBOS MULTIPLES DE FERMENTACIÓN.

COLIFORME TOTALES , TERMOTOLERANTES Y E. coli
EQUIPOS:
1. Autoclave
2. Balanza
3. Baño maría 44,5 ± 0,5 ºC
4. Destilador
5. Horno de Esterilización
6. Incubadora de 35 ± 0,5 ºC
7. Jeringa Automática
8. Lámpara de luz ultravioleta
9. Mechero bunsen
10. Medidor de Ph
11. Refrigeradora
Materiales :
1. Asa de siembra
2. Balón de fondo plano de 1000 ml.
3. Espátula
4. Frasco de vidrio resistente al calor de 250 ml
6. Pipetas serológica de 10 ml.
7. Pipetas serologica de 1 ml
8. Plumón marcador
9. Probeta de 1000 ml
10. Tubos de prueba de 18 x 150 mm
12. Tubos durham de 10 x 75 mm
BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 1

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE AGUAS
MINISTERIO DE SALUD
“DIGESA”
Medios de Cultivo y Reactivos:

1. Agua Destilada.
2. Caldo Lauryl Triptosa
3. Caldo Verde Brillante Bilis
4. Caldo EC con Mug
5. Cloruro de Magnesio (MgCl2.6H2O)
6. DPD Nº 1
7. Fosfato Di-hidrogeno de Potasio (KH2PO4)
8. Tío Sulfato de Sodio
9. Tegol
ANALISIS
1. Cuando la muestra llega al laboratorio se debe revisar si el volumen es el adecuado, si cumple con
los requisitos para el transporte de muestra y si esta en el tiempo permitido; el volumen mínimo de
muestra es de 200 ml.
2. Se registra la muestra en el cuaderno de control del laboratorio
3. Cuando la muestra es de agua de consumo humano se procede a medir el cloro residual de la
muestra.
4. Para medir el cloro residual se debe utilizar el reactivo DPD Nº 1 con la ayuda de un comparador
de cloro.
5. Se preparan las gradillas con los tubos que contienen el medio de cultivo Caldo Lauryl Triptosa
(CLT), de acuerdo a las diluciones con que se va trabajar la muestra según su origen de la fuente y
punto de muestreo.
6. Luego se procede a codificar los tubos con su respectivo número de identificación.
7. Este análisis se divide en dos etapas la Prueba presuntiva y Prueba confirmativa.
8. Prueba presuntiva
 Preparar una batería con series de cinco tubos conteniendo 10 ml de CLT de concentración
doble y series de cinco tubos con 10 ml CLT de concentración simple, codificar los tubos
con el número asignado a la muestra, volumen a inocular.
 Cuando la muestra no contiene cloro residual o es turbia se procede a realizar las diluciones
respectivas.

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“DIGESA”
 La muestra se debe agitar vigorosamente mas o menos unas 25 veces antes de ser
analizada.
 Se inocula 10 ml de la muestra a un frasco conteniendo 90 ml de agua de dilución para
-1
realizar la dilución 10 , luego se toma 10 ml de la primera dilución y se coloca en un
-2
segundo frasco con 90 ml de agua de dilución obteniéndose 10 , se sigue realizando la
n
misma operación hasta obtener la dilución que se necesita para trabajar 10 .
 Cuando se trabaja con diluciones se procede a sembrar de la dilución mayor a la menor.
 Sembrar 10 ml de la muestra original en cinco tubos de concentración doble y 1 ml de la
muestra en cinco tubos de concentración simple de CL, en los tubos siguientes se siembra
1 ml de la dilución correspondiente.
 Incubar los tubos por 24 ± 2 horas a 35 ºC ± 0,5 ºC, se realiza la primera lectura a las 24 h,
los tubos positivos pasan a la prueba confirmativa.
 Los tubos positivos son aquellos que presentan formación de gas, turbiedad y fermentación,
los tubos negativos se llevan a incubar por 24 horas más.
 Realizar la segunda lectura, separar y anotar los tubos positivos y pasarlos a la prueba
confirmativa, los tubos negativos se descartan.
9. Prueba confirmativa
 Los tubos positivos se siembran en caldo lactosado verde brillante bilis 2%(CLVBB) y caldo
EC con Mug, a los cuales se les codifica con el número correspondiente del tubo positivo
de CLT de la prueba presuntiva.
 Los tubos de CLT positivo se agitan antes de tomar el inoculo, con la asa de siembra
previamente esterilizado y enfriado, extraer una asada del material e inocular en el tubo de
CLVBB y EC.
 Los tubos de CLVBB se incuban por 24 a 48 horas a 35 ºC ± 0,5 ºC y los caldos EC con
mug a 44,5 ºC ± 0,5 ºC por 24 horas en baño maría.
 Proceder a la lectura luego del tiempo de incubación para cada medio de cultivo, se
considera prueba positiva para coliformes totales a los tubos que presentan formación de
gas, turbiedad y fermentación en los tubos que contienen el medio CLVBB.
 Los tubos de caldo EC con Mug, que presentan turbiedad, fermentación y formación de gas
son considerados positivos confirmando la presencia de coliformes termotolerantes
(fecales).

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“DIGESA”
 Los tubos positivos de EC con Mug, se observan con la ayuda de una lámpara de UV en un
ambiente oscuro, para observar la reacción de fluorescencia, los tubos que presentan esta
reacción indica la presencia de E. Coli, se anota los tubos positivos.
10. Anotar los resultados y calcular el NMP a partir de los datos obtenidos en la prueba confirmativa,
con la ayuda de la tabla..

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FERMENTACION EN TUBOS MULTIPLES

COLIFORMES TOTALES Y FECALES (TERMOTOLERANTES)
MUESTRA
VOLUMENES DECIMALES
ADECUADOS
Múltiplos y Submúltiplos de 10 ml
CALDO LAURIL TRIPTOSA

35ºC 24 Horas
PRESENCIA (1) DE AUSENCIA DE GAS (2)

GAS Reincubar 35º C 24 h.
Caldo Lactosado Verde

Caldo EC - Mug Brillante Bilis 2% Presencia de gas Ausencia de gas
44.5ºC, 24 horas 35ºC 48 horas Siga como (1) Coliformes Ausentes
Presencia de Gas Ausencias de Gas Presencia de Gas Ausencias de Gas

C. Fecal C. Fecal Ausente C. Total C. Total Ausente
Lampar UV
Fluorescencia (+)
Presencia de
E. coli

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METODO: FILTRO DE MEMBRANA
COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES TERMOTOLERANTES
Equipos:
1. Autoclave
2. Balanza
3. Bomba de vacío
4. Comparador de Cloro
5. Destilador
6. Equipo de Filtración
9. Incubadora de 44,5 ± 0,5 ºC
10. Mechero bunsen
11. Medidor de pH
12. Refrigeradora
Materiales
1. Almohadillas absorbentes
2. Balón de 250 ml
3. Espátula
6. Membrana de nitrocelulosa de 0,45 u de porosidad y de 47 mm de diámetro
7. Pinzas de bordes planos
8. Pipeta serológica de 10 ml
10. Placas petri de 10 x 65 mm

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Medio de Cultivo y Reactivos;

1. Agar Endo les
2. Caldo Lauryl Sulfato para Filtro de Membrana
3. Cloruro de magnesio (MgCl2.6H2O)
4. Fosfato monopotasico (KH2PO4)
5. Pastillas DPD Nº1
6. Tegol
7. Tío sulfato de sodio
Análisis:
1. Cuando la muestra llega al laboratorio se debe revisar si el volumen es el adecuado y si cumplió con
los requisitos para el transporte de muestra. El volumen mínimo de muestra es de 300 ml.
3. Se mide el cloro residual de la muestra con la ayuda del reactivo DPD Nº 1 con el comparador de
cloro.
4. El equipo de filtración puede esterilizarse por radiación UV por un tiempo de 5 min. o en
autoclave por un tiempo de 15 min.
5. Para colocar la membrana en el porta filtro se debe utilizar una pinza estéril.
6. El embudo o vaso de filtración se debe colocar con cuidado, para no dañar la membrana.
7. Luego se humedece la membrana con agua destilada estéril para su mejor adherencia.
8. La muestra debe homogenizarse vigorosamente por lo menos unas 25 veces.
9. Proceder a realizar las diluciones respectivas de acuerdo al tipo de muestra.
10. Se inocula 10 ml de la muestra a un frasco conteniendo 90 ml de agua de dilución para realizar la
-1
dilución 10 , luego se toma 10 ml de la primera dilución y se coloca en un segundo frasco con 90
-2
ml de agua de dilución obteniéndose 10 , se sigue realizando la misma operación hasta obtener la
n
dilución que se necesita para trabajar 10 .
11. Cuando se trabaja con diluciones, la siembra se realiza de la mayor dilución a la menor.
12. Filtrar volúmenes de la muestra o diluciones adecuados para obtener un recuento de
aproximadamente de 20 a 80 colonias de coliformes.
13. Se filtra la muestra con ayuda de una bomba de vacío.

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14. Luego la membrana se retira con ayuda de una pinza estéril. Para colocarla en la placa que
contiene el medio de cultivo respectivo.
 Caldo m-Endo o Agar para coliformes totales
 Caldo lauryl sulfato para filtro de membrana para coliformes termotolerantes.
15. Se debe filtrar la muestra para cada uno de los medios de cultivo que se va utilizar en el análisis.
16. Las placas de Caldo m-Endo o agar se llevan a incubar a 35 ºC por 24 horas, se debe contar las
colonias de color rojo oscuro, con brillo metálico en la superficie.
17. Las placas de caldo lauryl sulfato se incuban a 44,5 º C por 24 horas en ambiente húmedo, se debe
contar las colonias de color amarillo.
18. Para el cálculo de la densidad de coliformes se expresa como el total de coliformes en unidades
formadoras de colonias (UFC) por 100 ml.
19. El recuento se calcula utilizando filtros de membrana que contengan entre 20 a 80 colonias de
coliformes y no más de 200 colonias en la placa.
20. Se aplica la siguiente formula:
 Colonias de coliformes
totales o termotolerantes /100ml = Colonias de coliformes contadas X 100
ml de muestra filtrada
21. para el caso de muestras que se trabajan con dilución la formula es la siguiente:
 Colonias de coliformes
totales o termotolerantes /100ml = Colonias de coliformes contadas X 100
ml de muestra filtrada x dilución

MINISTERIO DE SALUD
“DIGESA”
COLIFORMES TOTALES
TECNICA FILTRACION EN MEMBRANA
Muestra de
Aguas
Filtrar Volúmenes
Crecimiento de 20 – 80
Colonias
Agar m Endo LES

18 -24 horas a 37ºC
Colonias Rojas con brillo metálico Demás Colonias

Coliformes Totales Coliformes Totales
PRESENTE AUSENTES

MINISTERIO DE SALUD
“DIGESA”
COLIFORMES FECALES
TECNICA FILTRACION EN MEMBRANA
Muestra de
Aguas
Filtrar Volúmenes
Crecimiento de 20 – 80
Colonias
Caldo Lauryl Sulfato

(Para Filtro de Membrana)
18 – 24 h. / 44.5 ºC
Colonias Amarillas Demás Colonias

Coliformes Fecales Coliformes Fecales
PRESENTE AUSENTES

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“DIGESA”

METODO: PLACA FLUIDA
RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFICAS
Equipos:
1. Autoclave
2. Balanza
3. Comparador de Cloro
4. Contador de Colonia
5. Destilador
8. Mechero bunsen
9. Medidor de pH
10. Refrigeradora
Materiales:
1. Balón de fondo plano de 250 ml
2. Espátula
3. Frasco resistente al calor de 250 ml
4. Frasco resistente al calor de 100 ml
5. Placa Petri de 15 x 100 mm
8. Plumón marcador
Medio de cultivo y reactivos:

1. Agar Plate count
2. Cloruro de magnesio (MgCl2.6H2O)
3. Fosfato monopotasico (KH2PO4)
4. Pastillas DPD Nº1

MINISTERIO DE SALUD
“DIGESA”
5. Tío sulfato de sodio

6. Tegol.
Análisis:
1. Cuando la muestra llega al laboratorio se debe revisar si el volumen es el adecuado y si cumplió con
los requisitos para el transporte de muestra.
3. Se mide el cloro residual de la muestra con la ayuda del reactivo DPD Nº 1 con el comparador de
cloro.
4. El volumen mínimo de muestra es de 100 ml.
5. Rotular las placas con las diluciones que se van a trabajar y su código correspondiente a la
muestra.
6. El medio de cultivo debe estar a una temperatura de 45ºC para trabajar, conservarlo en un baño
María a 45ºC.
7. En el caso que se va realizar diluciones, se preparan antes de realizar la siembra.
8. Se inocula 10 ml de la muestra a un frasco conteniendo 90 ml de agua de dilución para realizar la
-1
dilución 10 , luego se toma 10 ml de la primera dilución y se coloca en un segundo frasco con 90
-2
ml de agua de dilución obteniéndose 10 , se sigue realizando la misma operación hasta obtener la
dilución que se necesita para trabajar.
9. Cuando se trabaja con diluciones, la siembra se realiza de la mayor dilución a la menor.
10. Se procede a colocar 1 ml de la muestra o de la dilución correspondiente a la placa petri.
11. Se agrega aproximadamente unos 20 ml de agar Plate Count, se homogeneiza haciendo girar la
placa en forma de ocho varias veces, se deje solidificar.
12. Se lleva a incubar las placas en forma invertida por 48 horas a 35 ºC
13. La Lectura se realiza con ayuda del contador de colonia
14. Se reporta como Unidades formadoras de colonia (UFC)/ 1ml.

MINISTERIO DE SALUD
“DIGESA”
METODO: PLACA FLUIDA

RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFICAS
Muestra
Sembrar 1ml de muestra o de

la dilución en placa
Agar Plate Count a 45 ºC

24 – 48 horas
35 ± 0,5 ºC
U.F.C / 1 ml
Bacterias Heterotróficas

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“DIGESA”

METODO: Presencia / Ausencia
Salmonella sp.
Equipos:
1. Autoclave
2. Balanza
3. Bomba de vacío
4. Destilador
5. Equipo de filtración
7. Incubadora
8. Potenciometro
Materiales:
1. Asa de siembra
4. Espátula de acero
5. Filtro de Membrana de nitrocelulosa de 0,45ų de porosidad
6. Frasco de 1000 ml
7. Pinza de bordes planos
8. Plumón marcador
9. Placa petri
10. Tubos de prueba de 13 x 100 mm con tapa rosca

1. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
2. Agar S.S
3. Agar Tripticasa soya
4. Agar tres azucares

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“DIGESA”
5. Agar sim
6. Agar lisina descarboxilasa
7. Agua destilada
8. Caldo selenito cistina
9. Caldo triptona
10. Suero Polivalente de Salmonella
MUESTREO
1. Los puntos de muestreos son ubicados en los posibles vías de entrada de Salmonella.
2. Seleccionar los lugares próximos a hospitales, red pública, fuentes de aguas superficiales, que
reciben aguas residuales domésticas.
3. Las muestras deben ser debidamente identificadas (número de muestra, fecha y hora de
muestreo, lugar de muestreo, origen de la fuente)
4. Las muestras se podrán obtener en forma directa, colectando una porción o volumen de agua, o
colocando una mecha (método de Moore) modificada en el lugar designado y recogerla después
de 24 ó 48 horas.
5. Para aguas residuales se podrá colectar volúmenes de 100 ó 500 ml.
6. Para la concentración de la muestra se utiliza un equipo de filtración con ayuda de una
membrana filtrante de 0,45 µ de porosidad.
7. Al colectar la mecha después del tiempo indicado, colocarla en un frasco de boca ancha, que
contenga 300 ml del caldo selenito cistina a doble concentración, transportarla al laboratorio
para incubar.
8. El periodo recomendado desde la toma de muestra e inicio del análisis, es de dos a seis horas
en refrigeración, siendo el tiempo máximo de almacenamiento en refrigeración de 24 horas para
el caso de agua tratadas.
Análisis:
1. Se debe tener estéril el equipo de filtración, la esterilización puede realizarse en autoclave por
un tiempo de 15 minutos o mediante radiación ultra violeta por 5 minutos.
2. Se coloca la membrana filtrante y se procede a filtrar el volumen de la muestra recolectada, en
el caso de aguas superficiales el volumen es de 4 lt.

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“DIGESA”
3. En el caso que la membrana se sature, se procede a cambiarla por una nueva, y la membrana
retirada se coloca en el medio de cultivo.
4. Las membranas utilizadas para filtrar la muestra son colocadas en un frasco conteniendo 300
ml de caldo selenito cistina, llevándose a incubar a 41.5 ºC. Por 24 a 48 h.
5. En el caso de las aguas residuales se pueden realizar la siembra en forma directa al caldo
selenito de doble concentración en volúmenes iguales.
6. Cumplido el tiempo de incubación en el medio de pre-enriquecimiento, se siembra en los
medios de selección.
7. Con ayuda de una asa de siembra se estría en las placas de agar XLD, SS, se incuba a 37ºC
por 24 a 48 h.
8. Se selecciona 3 colonias típicas por medio de cultivo y se procede a sembrar en un agar
nutritivo(TSA) por 24 horas a 37ºC.
9. Del tubo de TSA, se siembra a los medios de bioquímica TSI, LIA, y SIM, se incuba a 37ºC por
24 h.
10. Serotipificar con antisuero Salmonella. Antisuero “O” polivalente, A-1 y Vi para la identificación
de genero.
11. Reacciones bioquímicas de Salmonella sp:
Salmonella sp Salmonella typhi

TSI K/A K/A
LIA K/K K/K
INDOL (-) (-)
RM (+) (+)
VP (-) (-)
UREA (-) (+)
Excepciones:
INDOL (+) = S.typhimurium
H2S (-) = S. paratyphi ; S. cholerae suis
GAS (-) = S. typhi
14. Se reporta como presencia o ausencia de Salmonella en 100 ml

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“DIGESA”
Salmonella sp.
Técnica Presencia / Ausencia
Muestra
Filtrar Volumen 1- 4 lt
Membrana filtrante 0,45 µ
Caldo Selenito Cistina

18 -24 h / 36± 0,5ºC
Agar SS Agar XLD

18 -24 h / 36± 0,5ºC 18 -24 h / 36± 0,5ºC
3 colonias 3 colonias
TSA LIA TSI INDOL SIM

18 -24 h 18 -24 h 18 -24 h 18 -24 h 18 -24 h
/36± 0,5ºC /36± 0,5ºC /36± 0,5ºC /36± 0,5ºC /36± 0,5ºC
SEROLOGÍA Salmonella

MINISTERIO DE SALUD
“DIGESA”

METODO: Presencia / Ausencia
Vibrio Cholerae
Equipos:
1. Autoclave
2. Balanza
3. Bomba de vacío
4. Destilador
5. Equipo de filtración
7. Incubadora
8. Potenciometro
Materiales:
1. Asa de siembra
2. Almohadilla absorbente
5. Espátula de acero
6. Filtro de Membrana de nitrocelulosa de 0,45ų de porosidad
7. Frasco de 1000 ml para toma de muestra
8. Plumón marcador
9. Placa petri
10. Pipetas serológicas
11. Tierra de diatomeas
12. Tubos de prueba de 13 x 10 con tapa rosca
13. Vasos de precipitación

1. Agar TCBS
2. Agar Tripticasa soya
3. Agar lisina descarboxilasa
4. Agar hierro tres azucares

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“DIGESA”
5. Antisuero poly – Vibrio cholerae O1

6. Antisuero Ogawa
7. Antisuero Inaba
8. Cloruro de sodio
9. Desoxicolato de sodio
10. n-n dimetil-p – phenylenediamine oxalato
11. Peptona
12. Triptona o tripticasa
13. Reactivo de indol según kovacs
14. Agua destilada
MUESTREO
1. Los puntos de muestreos son ubicados en los posibles vías de entrada del Vibrio cholerae.
2. Debe escogerse lugares próximos a hospitales, red pública, fuentes de aguas superficiales, que
reciben aguas residuales domésticas.
3. Las muestras deben ser debidamente identificadas (número de muestra, fecha y hora de
muestreo, lugar de muestreo, origen de la fuente)
4. Las muestras se podrán obtener en forma directa, colectando una porción o volumen de agua, o
colocando una mecha (método de Moore) modificada en el lugar designado y recogerla después
de 24 ó 48 horas.
5. Para aguas residuales se podrá colectar volúmenes de 100 ó 500 ml.
6. Para la concentración de la muestra se utiliza un equipo de filtración y una capa de 1.5 cm de
tierra de diatomea como capa filtrante, sobre una almohadilla absorbente.
7. Al colectar la mecha después del tiempo indicado, colocarla en el lugar, en un frasco de boca
ancha, que contenga 300 ml de agua peptonada a doble concentración. La muestra deberá ser
enviada inmediatamente al laboratorio para el análisis respectivo.
8. El periodo recomendado desde la toma de muestra e inicio del análisis, es de dos a seis horas
en refrigeración, siendo el tiempo máximo de almacenamiento en refrigeración, de 24 horas.
9. En caso la muestra no pueda ser analizada en un periodo de 6 horas, se podrá agregar telurito
de potasio en concentraciones 1:200,000 al agua peptonada alcalina. La finalidad del telurito es
inhibir el desarrollo de otras bacterias que puedan interferir el vibrio.

MINISTERIO DE SALUD
“DIGESA”
ANÁLISIS
1. Para aguas residuales se colectan 100 ó 500 ml de muestra y se colocan en medio de cultivo de
agua peptonada alcalina de igual volumen que la muestra y a doble concentración
2. Para aguas superficiales y agua potable el volumen colectado debe ser de 1 ó 4 litros, se
emplea la mecha Moore y el método de concentración con tierra de diatomeas.
3. La mecha es colocada en agua peptonada alcalina y se incuba durente 6 –8 horas a
temperaturas de 35 – 37 ºC.
4. El concentrado de los organismos adheridos en la tierra de diatomeas y la almohadilla o pad
son colocados asépticamente en un frasco estéril o erlenmeyer conteniendo 250 a 300 ml de
agua peptonada alcalina a doble concentración. Incubar durante 6 a 8 horas a 35 – 37 ºC,
después de la incubación, retirar cuidadosamente el frasco de la incubadora, evitar agitarlo.
5. El material de la superficie se colecta del agua peptonada con una asa de inoculación y se
siembra en placas duplicadas con medios de selección TCBS. Las placas con la muestra son
incubadas en posición invertida a 35 – 37 ºC durante 16 – 24 horas.
6. Después de la incubación, se efectúa el reconocimiento de las colonias típicas desarrolladas en
las placas. Las colonias típicas son de 1 a 2 mm de diámetro, amarillas con halo y ligeramente
convexas.
7. De cada placa de selección se aíslan tres colonias típicas de Vibrio y se transfieren a las
pruebas bioquímicas. Para las pruebas bioquímicas se emplean tubos de 13 x 100 mm y los
medios de cultivo empleados son : triple azúcar hierro agar (TSI), Lisina hierro agar (LIA), agar
nutritivo(NA) o Agar soya triptona (TSA), caldo triptona (indol), la inoculación en TSI y LIA ocurre
por picada en la profundidad y estriamiento en la superficie. Incubar a 35 – 37 ºC durante 24
horas.
8. La lectura de las reacciones bioquímicas de estos medios darán cepas con características de
vibrio cholerae, las que pasarán a las pruebas de oxidasa, string-test y luego la prueba de
serología. La reacción en los tubos de fermentación con los medios de TSI y LIA es la siguiente:
-
TSI K/A Alcalino/ácido; ó ácido/ácido
-
A/A gas e hidrógeno sulfurado
negativo)
-
LIA K/K Alcalino/alcalino, no hay cambio
de color, gas e hidrógeno
sulfurado negativo
INDOL Positivo Tira de papel filtro color
grosella.

MINISTERIO DE SALUD
“DIGESA”
Vibrio cholerae O1
Técnica Presencia / Ausencia
Muestra
Filtrar Volumen 1- 4 lt
Membrana filtrante 0,45 µ
Agua Peptona Alcalina

6 - 18 h / 36± 0,5ºC
Agar TCBS
18 -24 h / 36± 0,5ºC
3 colonias
TSA LIA TSI INDOL SIM

18 -24 h 18 -24 h 18 -24 h 18 -24 h 18 -24 h
/36± 0,5ºC /36± 0,5ºC /36± 0,5ºC /36± 0,5ºC /36± 0,5ºC
SEROLOGÍA STRING TES OXIDASA
Vibrio cholerae

MINISTERIO DE SALUD
“DIGESA”

METODO: TUBO MULTIPLE
ENTEROCOCOS
EQUIPOS:
1. Autoclave
2. Balanza
3. Destilador
6. Mechero bunsen
7. Medidor de pH
8. Refrigeradora
Materiales :
1. Asa de siembra
2. Balón de fondo plano de 1000 ml.
5. Pipetas serológica de 10 ml.
6. Pipetas serologica de 1 ml
7. Placa petri de 100 x 15 mm
8. Plumón marcador

1. Caldo Azida Dextrosa
2. Agar Kanamicina Esculina Azida
3. Cloruro de Magnesio (MgCl2.6H2O)
4. Fosfato dihidrogeno de potasio (KH2PO4)

MINISTERIO DE SALUD
“DIGESA”
5. Tío Sulfato de Sodio

6. DPD Nº 1
7. Agua destilada.
ANALISIS
1. Cuando la muestra llega al laboratorio se debe revisar si el volumen es el adecuado y si cumple con los
requisitos para el transporte de muestra. El volumen mínimo de muestra es de 100 ml.
3. Se mide el cloro residual de la muestra, cuando se trata de agua clorada.
4. Para medir el cloro residual se debe utilizar el reactivo DPD Nº 1 con la ayuda de un comparador de
cloro.
5. Se preparan las gradillas con los tubos que contienen el medio de cultivo Caldo azida dextrosa (AD), de
acuerdo a las diluciones con que se va trabajar la muestra según su origen de la fuente y punto de
muestreo.
6. Luego se procede a codificar los tubos con su respectivo número de identificación.
7. Este análisis se divide en dos etapas la Prueba presuntiva y Prueba confirmativa.
8. Prueba presuntiva:
a. Preparar una batería con series de cinco tubos conteniendo 10 ml de AD de concentración
doble y series de cinco tubos con 10 ml AD de concentración simple, codificar los tubos con
el número asignado a la muestra, volumen a inocular y fecha.
b. Si la muestra no contiene cloro residual y es turbia se procede a realizar las diluciones
respectivas.
c. Agitar vigorosamente mas o menos unas 25 veces antes de ser analizada.
d. En el caso que se trabaja con diluciones se procede a sembrar de la dilución mayor a la
menor
e. Inocular 10 ml de la muestra original en cinco tubos de concentración doble y 1 ml de la
muestra en cinco tubos de concentración simple de AD, en los tubos siguientes se siembra
1 ml de la dilución correspondiente.
f. Incubar los tubos por 24 ± 2 horas a 35 ºC ± 0,5 ºC, se examinan y se separan los tubos
positivos, aquellos que presentan turbiedad y formación de precipitado en forma de botón.
g. Todos los tubos positivos pasan a la prueba confirmativa, los tubos negativos se reincuban
por 24 horas más.

MINISTERIO DE SALUD
“DIGESA”
h. Realizar la segunda lectura, separar y anotar los resultados de los tubos positivos y
pasarlos a la prueba confirmativa.
9. Prueba confirmativa:
a. Utilizar Agar Kanamicina Esculina Azida (KN).
b. Agitar cada tubo de AD positivo y con una asa de siembra previamente esterilizado y
enfriado, extraer una asada del material y estriar en las placas conteniendo el agar selectivo
(KN), se siembra cada tubo positivo a una placa.
c. Incubar las placas por 24 a 48 horas a 35 ºC ± 0,5 ºC .
d. Proceder a la lectura luego del tiempo de incubación, se considera prueba positiva cuando
en las placas se encuentran colonias con halo oscuro.
10. Anotar los resultados y calcular el NMP a partir de los datos obtenidos en la prueba confirmativa, con la
ayuda de la tabla..

MINISTERIO DE SALUD
“DIGESA”
TUBOS MULTIPLES
ENTEROCOCOS
MUESTRA
VOLUMENES DECIMALES
ADECUADOS
Múltiplos y Submúltiplos de 1
ml
CALDO AZIDA
DEXTROSA
35ºC 24 – 48 h.
PRESENCIA DE (1) AUSENCIA DE (2)

TURBIEDAD TURBIEDAD
Reincubar 35º C 24 h.
AGAR KANAMICINA PRESENCIA DE AUSENCIA DE

ESCULINA AZIDA TURBIEDAD TURBIEDAD
35 ºC 48 HORAS Siga como (1) NEGATIVO
COLONIAS CON
HALO OSCURO
ENTEROCOCO


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“AÑO DE LOS DERECHOS DE LA PERSONA CON

DISCAPACIDAD Y DEL CENTENARIO DEL NACIMIENTO DE

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS

METODO: TUBOS MULTIPLES DE FERMENTACIÓN.

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 1

Medios de Cultivo y Reactivos:

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 2

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 3

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 4

FERMENTACION EN TUBOS MULTIPLES

CALDO LAURIL TRIPTOSA

PRESENCIA (1) DE AUSENCIA DE GAS (2)

Caldo Lactosado Verde

Presencia de Gas Ausencias de Gas Presencia de Gas Ausencias de Gas

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 5

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 6

Medio de Cultivo y Reactivos;

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 7

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 8

Agar m Endo LES

Colonias Rojas con brillo metálico Demás Colonias

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 9

Caldo Lauryl Sulfato

Colonias Amarillas Demás Colonias

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 10

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS

Medio de cultivo y reactivos:

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 11

5. Tío sulfato de sodio

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 12

METODO: PLACA FLUIDA

Sembrar 1ml de muestra o de

Agar Plate Count a 45 ºC

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 13

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS

Medios de Cultivo y Reactivos:

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 14

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 15

Salmonella sp Salmonella typhi

14. Se reporta como presencia o ausencia de Salmonella en 100 ml

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 16

Técnica Presencia / Ausencia

Caldo Selenito Cistina

Agar SS Agar XLD

TSA LIA TSI INDOL SIM

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 17

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS

Medios de Cultivo y Reactivos:

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 18

5. Antisuero poly – Vibrio cholerae O1

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 19

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 20

Técnica Presencia / Ausencia

Agua Peptona Alcalina

TSA LIA TSI INDOL SIM

SEROLOGÍA STRING TES OXIDASA

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 21

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS

Medios de Cultivo y Reactivos:

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 22

5. Tío Sulfato de Sodio

BLGA. JULIA IVONNE LOAYZA RAMOS 23