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Capítulo 21 (seção 21.1) do livro M. , COX, Michael, DOUDNA, Jennifer A.

,
O'DONNELL, Michael. Biologia Molecular: Princípios e Técnicas. ArtMed, 2012-
01-01, com modificações.

A Regulação Transcricional da Expressão Gênica em Eucariotos

As células eucarióticas, assim como as bactérias, expressam apenas um


subconjunto dos seus genes a qualquer momento dado. Aprendemos no Capítulo 20
que, por meio da regulação gênica, as bactérias são capazes de se adaptar a
mudanças ambientais e responder a moléculas sinalizadoras e ataques virais. Os
eucariotos também devem responder ao seu ambiente e a estímulos externos. Além
disso, os eucariotos multicelulares devem gerenciar vias complexas de divisão celular
e diferenciação que dão origem a uma grande variedade de tipos celulares
necessários ao desenvolvimento do organismo. Programas de desenvolvimento são
extremamente precisos – é crítico que cada proteína que influencia a diferenciação
celular esteja ativa no momento e no lugar certos –, e qualquer desvio desse programa
pode ter consequências drásticas. Muitos dos genes necessários para o
desenvolvimento são tão críticos que, se uma mutação os converte em não funcionais,
o embrião morre antes que o organismo esteja todo formado. Ainda assim, apesar de
as necessidades de um eucarioto serem mais complexas do que as de uma bactéria,
os princípios básicos de regulação gênica continuam sendo a chave para todos esses
processos.

Lembre-se de que muitos genes bacterianos e óperons são regulados no nível


de início de transcrição. Isso também é verdadeiro no caso de eucariotos, e, como
veremos, muitos mecanismos de regulação eucarióticos estão construídos sobre
aqueles utilizados em bactérias. Entretanto, existe uma diferença fundamental entre a
regulação da transcrição eucariótica e a bacteriana. O estado transcrição basal, de
atividade inerente de promotores e maquinaria de transcrição in vivo na ausência de
mecanismos reguladores, não é o mesmo em bactérias e eucariotos. Em bactérias, o
estado de transcrição basal não é limitado. Em outras palavras, a RNA-polimerase
costuma ter acesso a qualquer promotor e pode se ligar e iniciar a transcrição com
algum nível de eficiência na ausência de ativadores ou repressores. Ao contrário,
genes eucarióticos contêm promotores fortes que são geralmente inativos na ausência
de proteínas reguladoras; ou seja, a transcrição basal em eucariotos é limitada.

Diferenças cruciais no empacotamento do DNA e na estrutura celular dão


origem a pelo menos quatro características distintivas importantes da regulação da
expressão gênica em eucariotos. Primeiro, o acesso aos promotores eucarióticos é
restringido pela estrutura da cromatina, e a ativação transcricional está associada a
várias mudanças na estrutura da cromatina na região transcrita. Segundo, ainda que
as células eucarióticas possuam mecanismos de regulação tanto positivos quanto
negativos, os mecanismos positivos predominam em todos os sistemas investigados
até o momento; dado que a transcrição basal é limitada, praticamente qualquer gene
eucariótico exige ativação. Terceiro, as células eucarióticas possuem redes de
regulação multiproteicas mais complexas e maiores do que as bactérias. Quarto, a
transcrição no núcleo é separada da tradução no citoplasma, tanto no espaço quanto
no tempo. Como resultado, o controle pós-transcricional desempenha um papel mais
importante no controle da expressão gênica em eucariotos.

A complexidade dos circuitos reguladores em células eucarióticas é


extraordinária, e não tentaremos cobrir de forma abrangente todos os aspectos. Este
capítulo e o próximo tratam de alguns dos princípios que guiam a regulação gênica
eucariótica, estabelecendo paralelos com os mecanismos discutidos sobre bactérias
no Capítulo 20 sempre que aplicável. A necessidade de controlar uma grande
variedade de genes em um eucarioto superior exige uma série de proteínas
reguladoras. Explicaremos a lógica básica da ativação gênica como utilizada em
essencialmente todos os eucariotos. Também consideraremos de maneira resumida
os experimentos que pela primeira vez revelaram a arquitetura modular dos ativadores
gênicos e destacaremos algumas das redes reguladoras que governam a expressão
gênica, desde um sistema simples em levedura até os controles de desenvolvimento
complexos típicos de um eucarioto multicelular. O capítulo conclui com uma discussão
dos processos de controle transcricional exclusivos da expressão gênica eucariótica,
alguns dos quais ainda estão muito longe de serem compreendidos.

21.1 Mecanismos básicos de ativação transcricional eucariótica

Como em bactérias, o nível basal de transcrição eucariótica é determinado pelo


efeito de sequências reguladoras na função da RNA-polimerase e dos seus fatores de
transcrição associados. Como aprendemos no Capítulo 19, a natureza do genoma
eucariótico se presta a estratégias de regulação diferentes daquelas empregadas
pelas bactérias. O genoma eucariótico se encontra empacotado em uma cromatina,
que se apresenta como um bloco físico para as RNA-polimerases, e portanto a maioria
dos genes eucarióticos está reprimida no seu estado-padrão (basal) e requer proteínas
ativadoras para estimular a expressão. Devido ao grande tamanho dos genomas
eucarióticos e à necessidade de se proteger de interações proteína-DNA inespecíficas,
a ligação de reguladores proteicos múltiplos é necessária para ativar cada gene. Como
resultado, promotores eucarióticos são mais complexos do que suas contrapartidas
bacterianas e contêm muito mais sítios de ligação a proteínas reguladoras. Na
realidade, entretanto, a complexidade adicional nos eucariotos é gerenciada de formas
estratégicas que não são tão complicadas como poderíamos esperar, dada a diferença
brutal existente entre uma bactéria e um animal.

A transcrição eucariótica é regulada pela estrutura da cromatina

O DNA genômico dos eucariotos se enrola sobre pequenas proteínas básicas


denominadas histonas para formar os nucleossomos, os blocos de construção da
cromatina (Figura 10-4). A maquinaria de transcrição deve necessariamente lidar com
a estrutura da cromatina a fim de acessar genes particulares. Como resultado, os
genes eucarióticos em geral são expressos em níveis baixos – ou não o são – na
ausência de proteínas reguladoras.

A estrutura da cromatina é controlada e alterada por pelo menos três


mecanismos inter-relacionados: mudanças dependentes de ATP no posicionamento do
nucleossomo no DNA, modificações químicas pós-traducionais de histonas e
substituição de variantes especializadas de histonas na cromatina. Complexos de
remodelamento de nucleossomos utilizam ATP para mudar a posição dos
nucleossomos ao longo do DNA. Promotores ativos contêm regiões abertas, com
nucleossomos posicionados fora da região promotora, possibilitando o acesso dos
fatores de transcrição. Algumas modificações pós-traducionais das histonas, inclusive
a acetilação pelas histonas acetiltransferases (HATs), resultam em um
“descondensamento” da cromatina e possibilitam o acesso dos fatores de ligação ao
DNA; proteínas contendo um bromodomínio se ligam às histonas acetiladas e facilitam
a abertura da estrutura da cromatina. De forma alternativa, modificações das histonas
fazem com que a cromatina se torne indisponível para a transcrição. Por exemplo,
histonas metiladas são ligadas por proteínas contendo cromodomínios, e tais
proteínas auxiliam na condensação da cromatina. A estrutura da cromatina é também
modulada por uma série de variantes de histonas. Essas proteínas são homólogas às
histonas comuns e podem substituí-las nos nucleossomos, mas também apresentam
extensões de aminoácidos que resultam em uma variedade de consequências
funcionais.

No ciclo celular eucariótico, cromossomos interfásicos parecem dispersos e


amorfos. Contudo, os cromossomos não são estruturas uniformes, e várias formas
diferentes de cromatina podem ser encontradas ao longo de cada cromossomo. Cerca
de 10% da cromatina de uma célula eucariótica típica está em uma forma muito mais
condensada do que o restante da cromatina. Essa forma, a heterocromatina, é inativa
do ponto de vista transcricional. A heterocromatina está frequentemente associada a
estruturas cromossômicas particulares, incluindo centrômeros e telômeros. A
cromatina restante, menos condensada, é denominada eucromatina (Figura 21-1).

A transcrição de um gene eucariótico é fortemente reprimida quando o seu


DNA está condensado na forma de heterocromatina, mas, na eucromatina, parte do
DNA se encontra ativa do ponto de vista transcricional. Regiões de DNA
transcricionalmente ativas podem ser detectadas com base na sua sensibilidade
aumentada à degradação mediada por nuclease. Nucleases como a Dnase I tendem a
clivar o DNA de cromatina cuidadosamente isolada em fragmentos que correspondem
a múltiplos de cerca de 200 pb, refletindo a estrutura repetitiva regular do nucleossomo
(ver Figura 10-1). Todavia, em regiões ativamente transcritas, os fragmentos
produzidos pela atividade nucleásica são ainda menores e mais heterogêneos em
tamanho. Regiões ativamente transcritas contêm sítios hipersensitivos, sequências
sensíveis sobretudo à Dnase I, que são, às vezes, encontrados em regiões não
codificadoras dentro de 1.000 pb das extremidades 5' dos genes transcritos. Em
alguns genes, sítios hipersensitivos estão mais distantes da extremidade 5', ou
próximos da extremidade 3', ou até mesmo dentro do próprio gene. A presença de
sítios hipersensitivos sugere que o DNA desta região não se encontra empacotado em
uma estrutura nucleossômica repetitiva regular.
Muitos sítios hipersensitivos correspondem a sítios de ligação a proteínas
reguladoras conhecidas, e a ausência relativa de nucleossomos nessas regiões pode
permitir a ligação de tais proteínas. Os nucleossomos estão inteiramente ausentes em
algumas regiões que são muito ativas em transcrição, como os genes de rRNA. A
cromatina transcricionalmente ativa também tende a ser deficiente em histona H1, que
se liga ao DNA conector entre partículas nucleossômicas.

As histonas contidas em cromatina e heterocromatina transcricionalmente


ativas também diferem nos seus padrões de modificações covalentes. As caudas C-
terminais das histonas centrais são modificadas pela acetilação e metilação de
resíduos de Lys e Arg, fosforilação de resíduos de Ser ou Thr, e ubiquitinação ou
sumoilação. Em particular, a acetilação-desacetilação de histonas predomina nos
processos que ativam a cromatina para transcrição. A acetilação mediada por HAT de
múltiplos resíduos de Lys nos domínios N-terminais das histonas H3 e H4 pode reduzir
a afinidade de todo o nucleossomo por DNA. A acetilação também pode impedir ou
promover interações com outras proteínas envolvidas na regulação da transcrição.
Quando a transcrição de um gene não é mais necessária, a acetilação dos
nucleossomos nesta vizinhança é reduzida pela atividade de histonas desacetilases
(HDACs), resultando na condensação da cromatina que reduz ou inativa a transcrição
gênica. HDACs com frequência funcionam por meio de interações proteína-proteína,
como ligação a correpressores ou como componentes de complexos de
remodelamento da cromatina.

Um modelo geral para a desacetilação e inativação de um gene é mostrado na


Figura 21-2. Além da remoção de certos grupamentos acetila, novas modificações das
histonas marcam a cromatina como transcricionalmente inativa. Por exemplo, o
resíduo de Lys na posição 9 na histona H3 costuma ser metilado na heterocromatina.

A regulação gênica por meio de modificações nas histonas é, em geral,


conseguida mediante ativação ou inibição da iniciação da transcrição. No entanto, uma
descoberta estimulante demonstrou que a estrutura da cromatina também está
envolvida no controle do mecanismo de corte e junção de mRNAs para alguns genes.
Isso pode parecer surpreendente, dado que as histonas não se ligam ao RNA. Ainda
assim, sabemos agora que Gcn5, um fator de transcrição bem estudado com atividade
HAT, também afeta o processamento de RNA: a perda da atividade Gcn5 HAT impede
que o mecanismo de corte e junção apropriado de pré-mRNAs ocorra em leveduras,
porque componentes da maquinaria de corte e junção do RNA deixam de ser capazes
de se ligar de forma apropriada aos sítios de corte e junção dos pré-mRNAs. Este
exemplo ilustra como diferentes níveis de regulação (neste caso, transcrição e pro-
cessamento de mRNA) podem estar inter-relacionados. Parece provável que
processos antes considerados eventos isolados e separáveis possam estar
interconectados em redes reguladoras complexas nas células vivas.
A regulação positiva de promotores eucarióticos envolve múltiplos ativadores
proteicos

Cada uma das três RNA-polimerases eucarióticas tem pouca ou nenhuma


afinidade intrínseca por seus promotores. Em vez disso, o início da transcrição exige
quase sempre proteínas ativadoras. Uma razão importante para a aparente
predominância da regulação positiva fica clara a partir da discussão anterior: a
estrutura da cromatina faz a maior parte dos promotores se encontrar efetivamente
inacessível, de tal forma que os genes estão em geral silenciados na ausência de
outra regulação. A estrutura da cromatina afeta mais o acesso a alguns promotores do
que a outros, mas a ligação de um repressor ao DNA para bloquear o acesso da RNA
polimerase (regulação negativa) iria muitas vezes ser redundante. Entretanto, outros
fatores também estão em jogo no uso da regulação positiva, e as especulações
costumam se centrar ao redor de dois: o grande tamanho dos genomas eucarióticos e
a maior eficiência da regulação positiva.

Como os eucariotos possuem genomas muito maiores do que as bactérias,


existe a probabilidade aumentada de que uma sequência específica de ligação para
uma proteína reguladora ocorra de modo aleatório em outras regiões do DNA.
Lembre-se de que uma sequência de n nucleotídeos ocorrerá aleatoriamente a cada
4n pb. Portanto, é provável que qualquer proteína reguladora em particular com um
pequeno sítio de ligação irá se ligar de forma não específica em múltiplos sítios em um
genoma eucariótico. A ativação transcricional específica de um gene por meio da
ligação de uma proteína reguladora a um pequeno sítio de ligação, como costuma
ocorrer em bactérias, resultaria em uma estratégia ineficaz em eucariotos. Em teoria, a
especificidade de ligação de um regulador seria aumentada se as sequências
reconhecidas pelas proteínas fossem maiores. Ainda assim, os eucariotos não
evoluíram dessa forma: reguladores eucarióticos não se ligam a sequências de DNA
mais longas do que suas contrapartidas bacterianas. Em vez disso, para obter
ativação transcricional específica de um gene, os eucariotos empregam múltiplas
proteínas reguladoras, ou fatores de transcrição, cada um dos quais se liga a uma
sequência curta; só ocorre ativação gênica bem-sucedida quando todos os fatores
estão ligados nos seus sítios individuais. Essa combinação de fatores para a ativação
de um gene é utilizada em controle combinatório.

Para acomodar a ligação de múltiplos fatores de transcrição, os promotores


eucarióticos são necessariamente mais complicados do que as suas contrapartidas
bacterianas (Figura 21-3). Tomemos, por exemplo, um promotor típico reconhecido
pela RNA-polimerase II (Pol II), a enzima responsável pela síntese de mRNA. Muitos
promotores de Pol II (mas nem todos) incluem as sequências de um TATA box e um Inr
(iniciador), com seus espaçamentos-padrão. Essas sequências compreendem o
promotor central.

Os genes eucarióticos também incluem sequências reguladoras denominadas


estimuladores em eucariotos superiores e sequências ativadoras a montante (UASs)
em levedura, nas quais ativadores transcricionais se ligam. Essas sequências não
podem estar todas posicionadas de forma adjacente ao promotor – simplesmente não
existe espaço para acomodar a ligação de tantas proteínas reguladoras. Os sítios de
ligação para múltiplos fatores de transcrição devem ser capazes de agir a distância.
De fato, talvez estejam surpreendentemente distantes do promotor. Um estimulador
típico pode estar a centenas ou até mesmo milhares de pares de bases a montante do
sítio de início de transcrição, ou a jusante do gene, ou mesmo dentro do próprio gene.
Quando ligado pelas proteínas reguladoras apropriadas, um estimulador aumenta a
transcrição de promotores próximos independentemente de sua orientação no DNA.
UASs de levedura funcionam de forma similar, ainda que em geral devam estar
posicionados a montante e dentro de poucas centenas de pares de bases do sítio de
início de transcrição. Um promotor de Pol II médio pode ser afetado por meia dúzia de
sequências reguladoras deste tipo, e mesmo promotores mais complexos são comuns.
Em contraste, as bactérias possuem poucos genes que utilizam ativadores
transcricionais ligados distantemente, e, quando o fazem, a distância em relação ao
promotor costuma ser bastante curta.

Quanto mais complexo for o organismo eucariótico, provavelmente mais


complexos serão seus promotores. Por exemplo, promotores de levedura costumam
ser muito mais simples do que aqueles de mamíferos (Figura 21-4).

A necessidade de ligação de vários ativadores de transcrição a várias


sequências de DNA específicas reduz muito a probabilidade de ocorrência aleatória de
uma justaposição funcional de todos os sítios de ligação necessários. Em princípio,
uma estratégia similar poderia ser utilizada para múltiplos elementos reguladores
negativos. Contudo, a regulação positiva é simplesmente mais eficiente. Do ponto de
vista energético, faz mais sentido para a célula sintetizar vários ativadores a fim de
promover a transcrição de um subconjunto de genes necessários em um dado
momento do que sintetizar constantemente um ou mais repressores para cada gene
do genoma a fim de mantê-los desligados até o momento em que serão necessários. A
regulação positiva da transcrição predomina em eucariotos, ainda que, como veremos,
existam alguns exemplos de regulação negativa.

Para aumentar a conservação de recursos, promotores eucarióticos regulados


diferentemente com frequência utilizam alguns dos mesmos reguladores proteicos, de
tal forma que promotores diversos podem conter alguns dos mesmos sítios de ligação.
Entretanto, apenas uma combinação específica de fatores reguladores pode destravar
um dado promotor e ativar a transcrição do respectivo gene. Com esse mecanismo, a
célula pode obter especificidade de regulação gênica com um menor número de
ativadores transcricionais do que se cada gene fosse regulado por um conjunto de
proteínas em particular. Algumas proteínas reguladoras facilitam a transcrição em
centenas de promotores, enquanto outras são específicas para somente poucos
promotores. Além disso, muitos ativadores transcricionais são sensíveis à ligação de
moléculas efetoras de sinalização, fornecendo a capacidade de ativar e desativar a
transcrição em resposta a um ambiente celular em mudança.