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Profa.

Andréa Mendonça Gusmão Cunha


Disciplina: Cultura de Células e Tecidos/ICS/UFBA

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA


INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO
CURSO: BIOTECNOLOGIA

PROFA. ANDRÉA MENDONÇA GUSMÃO CUNHA

PROTOCOLOS - AULAS PRÁTICAS

DISCIPLINA ICS A35

CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS

2018

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Profa. Andréa Mendonça Gusmão Cunha
Disciplina: Cultura de Células e Tecidos/ICS/UFBA

TÍTULO DA PRÁTICA:

SEPARAÇÃO DE PBMC PARA OBTENÇÃO DE UMA CULTURA PRIMÁRIA DE


LINFÓCITOS DO SANGUE PERIFÉRICO.

INTRODUÇÃO:

O procedimento deve ser realizado em cabine de segurança classe II, seguindo todas as
normas de biossegurança. Para obtenção das células mononucleares do sangue periférico será
utilizado o Ficoll-Hypaque, que são compostos por polímeros de sacarose de alto peso molecular,
uma mistura de polissacarídeos neutros, ricos em grupos hidroxila, hidrofílicos, de alta densidade e
solúveis em solução aquosa. O nome "Ficoll" é uma marca comercial registrada e comercializada,
muito utilizada para separação de células do sangue periférico viáveis, com elevado rendimento e
pureza, em laboratórios clínicos e de cultivo celular. Através de gradiente de concentração promove
a separação de componentes celulares do sangue periférico humano, denominado PBMC (Peripheral
Blood Mononuclear Cell = Células Mononucleares do Sangue Periférico). Também são utilizados
para separação de células da medula óssea, células de cordão umbilical. Para obtenção de PBMC de
camundongos, ratos, murinos em geral, em vez de utilizar o sangue periférico pode-se utilizar uma
suspensão de células de baço, órgão que contém grande quantidade de leucócitos.

Para separação de neutrófilos basta a adição de Dextran (Sigma), muito utilizado em


laboratórios para separação dos polimorfonucleares, nesse caso, pode-se utilizar a base do tubo do
protocolo 2 (ver metodologia).

Na sequência dos procedimentos, será realizada a técnica de contagem celular em hemocitômetro,


cálculo do inóculo inicial para cultivo celular e teste de viabilidade celular usando o azul de tripan.

OBS: Seguem dois protocolos, observe que são bem parecidos, mas são comuns pequenas
variações que não interferem no objetivo da metodologia. Vamos utilizar o Protocolo 2.

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PROTOCOLO 1 (Separação de PBMC): (Só exemplo (LASP) – Vamos usar o 2)

1- Trabalhar assepticamente, cuidadosamente, com plena atenção e seguindo todas as normas


de biossegurança.
2- Coletar 5 mL de sangue venoso utilizando sistema á vácuo, em tubo com anticoagulante
heparina, previamente identificado.
3- Centrifugar o tubo de sangue por 7 minutos a 1.200 rpm a temperatura ambiente.
4- Desprezar o plasma em descarte apropriado.
- Abrir os tubos delicadamente utilizando gaze estéril.
5- Transferir o sangue (parte sólida) para um tubo Falcon de 15 mL.
6- Adicional o dobro de volume de PBS 7,5% ou 0,9% de SFB estéril (previamente preparado
e autoclave).
7- Homogeneizar usando uma pipeta descartável e um pipetador automático (3 mL de Sangue
+ 3 mL de PBS 7,5%), diluição 1:2.
8- Adicionar em um Tubo Falcon de 15 mL Ficoll Hipaque, o volume de ficoll deve ser o
mesmo volume de sangue obtido após diluição (6 mL).
9- Transferir delicadamente o sangue diluído em PBS (6 mL) sobre igual volume de Ficoll
Hipaque (6 mL).
10- Centrifugar a 1.800 rpm por 28 minutos a temperatura ambiente (Não esquecer de desativar
o freio da centrífuga).
11- Observa a separação das fases (Figura 1 e 2 abaixo).
12- Colher o máximo do anel leucocitário formado entre as fases.
13- Transferir o anel para um tubo de 15 mL previamente identificado.
14- Lavar 3X com PBS 7,5% ou SFB 0,9% estéril, para isso, adicional 10mL e depois centrifugar
a 1.200 rpm por 7 minutos, a temperatura ambiente.
15- Desprezar o sobrenadante e ressuspender o Pellet de PBMC (Figura 3) em 1mL de meio de
cultura RPMI 1640 + 10% SFB.
16- Efetuar contagem celular em câmera de Neubauer, segundo protocolo a seguir.
17- Calcular o inóculo inicial para cultura primária de PBMC (ideal 2 X 106 Cel./mL) ou
criopreservar as células obtidas em Nitrogênio Líquido para posterior cultivo.

PROTOCOLO 2 (Separação de PBMC): (Usar na aula prática)

1- Trabalhar assepticamente, cuidadosamente, com plena atenção e seguindo todas as normas


de biossegurança.
2- Desinfecção da cabine de segurança biológica e organizar os materiais.
3- Coletar 4 mL de sangue venoso utilizando sistema á vácuo, em tubo com anticoagulante
heparina, previamente identificado.
4- Transferir o sangue para um tubo Falcon de 15 mL.
OBS: Abrir os tubos delicadamente utilizando gaze estéril, evitar aerossol.
5- Adicional o dobro de volume de PBS 7,5% (previamente preparado e autoclave).
6- Homogeneizar usando uma pipeta descartável e um pipetador automático (4mL de Sangue
+ 4mL de PBS 7,5%), diluição 1:2.
7- Adicionar em um Tubo Falcon (4 mL) de Ficoll Hipaque,
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OBS: o volume de Ficoll deve ser a metade do volume de sangue obtido após diluição que
nesse exemplo foi de86 mL, por isso, 4mL de Ficoll.
8- Transferir delicadamente o sangue diluído em PBS (8 mL) sobre o volume de Ficoll Hipaque
(~4mL).
9- Centrifugar a 2.000 rpm por 20 minutos a temperatura ambiente (Não esquecer de desativar
o freio da centrífuga).
10- Observa a separação das fases (Figura 1 e 2 abaixo).
11- Colher o máximo do anel leucocitário formado entre as fases.
12- Transferir o anel para um tubo de 15 mL previamente identificado.
13- Lavar 3X com PBS 7,5%, para isso, adicional 10 mL de PBS sobre o pellet e depois
centrifugar a 1.000 rpm por 10 minutos, a temperatura ambiente.
- Etapa importante, pois o Ficoll é tóxico para as células e por isso, deve ser diluído e
eliminado para não lisar as células.
14- Desprezar o sobrenadante e ressuspender o Pellet de PBMC (Figura 3) em 1 mL meio de
cultura RPMI 1640 + 10% SFB ou em solução salina (PBS 7,5%).
15- Proceder a diluição adequada, conforme instruções do professor para em seguida efetuar a
contagem.
- Anotar todos os dados para realização dos cálculos e interpretação dos resultados.
16- Efetuar contagem celular em câmera de Neubauer, segundo protocolo a seguir.
17- Calcular o inóculo inicial para cultura primária de PBMC (ideal 2 X 10 6 Cel./mL) ou
criopreservar as células obtidas em Nitrogênio Líquido para posterior cultivo.

Plas
PBM
ma
CFico
Eritrócitos
ll
e
Granulócit
os

Figura 1: Fases da separação celular, obtenção do PBMC. Após a centrifugação, duas fases ficam visíveis e
a separação acontece como descrito a seguir: na parte superior fica o plasma e seus constituintes solúveis, na
interface as células mononucleares (PBMC), logo baixo do PBMC, o Ficoll, e após os eritrócitos e
granulócitos, localizados no fundo do tubo sob a forma de um sedimento celular.

OBS: As células mononucleares e plaquetas se localizam acima da camada de Ficoll-Hypaque,


porque eles têm uma densidade mais baixa, em contraste, as células vermelhas do sangue (RBC)

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e granulócitos, têm uma densidade superior à de Ficoll-Hypaque e se acumulem na parte inferior da


camada de Ficoll-Hypaque (Figura 2). As plaquetas são separadas das células mononucleares por
lavagem subseqüente ou por centrifugação e através da adição de SFB, que propicia a separação
celular, mas não de plaquetas.

Soro
plaquetas

Ficoll-
hypaq
ue

Figura 2: Ilustração referente a separação do PBMC, antes (esquerda) e após (direita) centrifugação e uso
do Ficoll.

Pellet de
Leucócit
os
(PBMC)

Figura 3: Obtenção do pellet de PBMC.

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PROTOCOLO 3: CONTAGEM E TESTE DE VIABILIDADE CELULAR

INTRODUÇÃO:

A contagem celular será realizada na câmara de Neubauer (Figura 4), a qual é coberta por
uma lamínula específica e pode receber duas amostras para contagem. Cada quadrante possui um
volume total de 0,1mm3. Sabendo-se que 1 cm3 é igual a 1,0 mL, pode-se determinar a quantidade
de células⁄mL, ou seja o número total de células em 1 mL da amostra. A profundidade central da
câmara é de 1 mm. No desenho (Figura 4) existem quatro grandes áreas de 1 mm2 . As 4 áreas
grandes angulares (W) são subdivididas em 16 áreas com 0,25 mm de cada lado. Elas são utilizadas
para a contagem de leucócitos, células brancas do sangue periférico. A grande área central é
subdividida em 25 grupos quadrados de 0,2 mm de cada lado. Cada grupo consiste de 16 pequenas
áreas com 0,05 mm de lado, tendo cada área 0,0025 mm2, marcados (R), e que são usados para
contagem de eritrócitos, células vermelhas do sangue periférico (Não são do nosso interesse). Deve-
se observar que todas as áreas possuem uma borda tripla em cada lado, sendo importante destacar
que a linha central é o limite para inclusão de uma célula na contagem global por quadrantes. Além
disso, apenas as laterais externas devem ser contadas, as laterais externas não devem ser incluídas
na contagem.

Esse mesmo protocolo usado para a contagem de células brancas do sangue periférico e teste
de viabilidade celular, importante para iniciar um cultivo de células do sangue periférico pode ser
usado para contagem de diferentes células em cultivo. Para fazer um repique, ou subcultivo celular
é importante contar, calcular o inóculo, avaliar a viabilidade celular. Também em ensaios para
avaliar toxicidade celular, em experimentos “in vitro”, testando extratos, biomateriais, dentre outros
experimentos.

Nessa prática, o teste de viabilidade será realizado com o método do Azul de Tripan (Tripan
Blue), um corante que penetra apenas em células que não apresentam a membrana plasmática
íntegra. Logo, as células viáveis não se coram em azul e as células inviáveis se coram em azul.

Figura 4: Câmara de Neubauer ou Hemocitômetro

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Figura 5: Áreas para contagem de células brancas (W) e células vermelhas (R) na câmara de
Neubauer.

PROCEDIMENTO:

1. Homogeneizar a amostra obtida:


- No Protocolo 2: suspensão celular (PBMC para obtenção de cultura primária)
- Em outras situações: células obtidas de um cultivo celular em andamento, utilizar um
protocolo adicional baseado no tipo celular (Células aderentes ou em suspensão)
2. Transferir uma alíquota da suspensão celular obtida para um eppendorf de 1,5 mL, será
utilizado apenas 10 uL para preencher a câmara de Neubauer. Portanto, pode-se obter uma
alíquota de 15 uL por amostra.
3. Utilizar uma pipeta automática, de preferência, P-20 ou P-100, usar a ponteira
correspondente, aliquotar exatamente 10 uL.
4. Proceder a diluição apropriada, usando o azul de tripan para realização do teste de
viabilidade celular.
5. Usar um parafilme ou uma placa de diluição e adicionar 10ul da suspensão celular e 10ul do
azul de tripan (Diluição 1:2). Se houver elevada densidade celular diluir 1:4, e assim
sucessivamente.
6. Preencher a câmara de Neubauer com o volume indicado (10uL) e anotar o fator de diluição
utilizado em seu procedimento.
7. Realizar a contagem usando o microscópio óptico, objetiva de 40X, oculares de 10X.
a. Ajustar o foco, avaliar a luminosidade, o condensador e diafragma.
8. Contar os 4 quadrantes externos, comumente utilizados para contagem de células brancas,
conforme indicado na Figura 5. Utilizar um contador de células manual.
- Conte as células viáveis e inviáveis localizadas nos quatro quadrantes externos (Conforme
indicado na Figura 5).
- Das células que estiverem nas bordas, conte apenas as que se localizam nas bordas externas
dos quatro quadrantes.
9. Anotar os 4 valores e dividir por 4, obtendo-se uma média desse valor.
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10. Aplicar e interpretar a fórmula padrão conforme: a média obtida nos quatro quadrantes, o
fator de diluição aplicado e o fator de diluição fixo da câmara de Neubauer.
11. Cálculo do número de células/mL= média do número de linfócitos por quadrante X inverso
da diluição X 104.
12. Número total de células na suspensão= células/mL X volume original da suspensão celular
(Imagine que tenha um volume de 500mL de cultivo celular para fazer o cálculo).
13. Cálculo da Viabilidade Celular: usando o azul de tripan, as células viáveis serão
visualizadas como brilhantes, translúcidas, já as células inviáveis, absorvem o corante e se
coram de azul.

Fator de Correção da Câmara de Neubauer:


Esse fator foi calculado com base na área de contagem da câmera, levando-se em conta o
volume, ver figura 6 abaixo.

Figura 6: Cálculo do fator de correção da Câmara de Neubauer.

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Cálculo do número de células viáveis por mL:

Determinação da porcentagem de Células viáveis (PCV):

Total de Células Viáveis___ X 100

Total de Células (Viáveis + Mortas)

MATERIAIS, EQUIPAMENTOS E REAGENTES:

1. Cabine de segurança biológica (Classe 2)


2. Câmara de Neubauer ou Hemocitômetro
3. Centrífuga
4. Microscópio óptico
5. Tubos Falcon
6. Eppendorfs
7. Galerias
8. Pipetas descartáveis
9. Pipetador automático ou manual
10. Pipetas automáticas
11. Ponteiras
12. Parafilme ou placa para homogeneização
13. Frascos ou placas de cultivo
14. Descarte
15. PBS 7,5% (Phosphate-bufferid saline - Solução tampão com pH= 7,2 a 7,5)
16. Meio RPMI 1640 (Meio de cultivo indicado para PBMC)
17. SFB (Soro Fetal Bovino)
18. Ficoll-Hypaque (Polissacarídeo hidrofílico estéril, solúvel).
19. Azul de tripan (0.4 g tripan em 100 ml salina)
20. Antibióticos
21. Antifúngicos
22. Etanol 70%
23. Hipoclorito

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24. Gaze estéril


25. Jaleco
26. Luvas
27. Óculos ou máscara de proteção

Preparo da Solução de PBS - (Phosphate-bufferid saline)

Função: Solução Tampão - PBS – pH 7.2 – 7.5


Concentração [10x]
NaCl...........................82 gr
Na2HPO4.................10,5 gr 1L de H2O
NaH2PO4 + H2O......3,55 gr
OBS: Solução concentrada, portanto diluir 100 mL de PBS para cada 900 mL de H2O (Milli-
Q). PBS 1X
REAGENTES:
NaCl – Cloreto de Sódio
NaHPO4 – Sodium Phosphate – Fosfato Sódio
NaH2PO4 + H2O – Fosfato Sódio Monobásico

TABELA CONVERSORA DE G PARA RPM:

Aceleração em RPM (nº de rotações/minuto)

Aceleração em G ou RFC (Força Centrífuga Relativa)

Fórmula: G = (RPM)²/[(raio, cm) x 360]

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COMPOSIÇÃO E PREPARO DO MEIO RPMI 1640

Desenvolvido pelo Instituto Roswell Park Memorial (RPMI). É uma mistura de sais enriquecidos
com aminoácidos, vitaminas e outros componentes essenciais para o crescimento celular. Funciona
como uma solução nutritiva em cultivo celular.

INDIÇAÇÃO: Destina-se à cultura de células humanas e de outros animais, muito utilizado para o
cultivo de leucócitos humanos normais ou transformado. Este meio é fornecido na forma
desidratada, em pó ou líquido. Na forma de pó ele tem a vantagem de se manter estável por mais 24
meses se conservado bem fechado e em geladeira. Outra grande vantagem do meio em pó é a
constância de resultados quando se programam culturas celulares a longo prazo, utilizando nesse
caso um mesmo lote. O MEIO RPMI 1640, por não ter timidina na sua composição, é muito
utilizado para obter a sincronização da divisão celular.

CARACTERÍSTICA FISIO-QUÍMICAS (Empresa Cultilab):


· Aspecto: Pó róseo e homogêneo
· Tamanho das Partículas: aproximadamente 20 microns
· Solubilidade: solução límpida na concentração de uso (1x)
· pH a 25oC (Sem NaHCO3) : 8,0 + 0,5
· pH a 25oC (ComNaHCO3) : 8,1 + 0,5
· Osmolaridade (sem NaHCO3) : 246 + 5%
· Osmolaridade (com NaHCO3) : 290 + 5%

CONSERVAÇÃO: Estocar o meio em pó ou preparado líquido entre 2 à 6 oC. Se essas condições


não forem mantidas, poderão ser observadas alterações do tipo:
1. Mudança de Cor
2. Granulações
3. Insolubilidade
4. Alteração de pH
5. Incapacidade de manter a integridade celular sob condições normais.

PREPARAÇÃO: O MEIO RPMI 1640 em pó é extremamente higroscópico, devendo ser


protegido do meio ambiente. Não são recomendadas preparações de concentrações maiores que
aquelas especificadas, devido a grande possibilidade de formação de precipitados.
1.) Medir aproximadamente 90% do volume a ser preparado de água tridestilada (15 – 20 oC).
2.) Adicionar lentamente o pó sob agitação constante. NÃO AQUEÇA A ÁGUA.
3.) Depois que o pó estiver totalmente dissolvido, acrescentar por litro 2,0g de bicarbonato de
sódio 5,6%.
4.) Acrescentar antibióticos ou outras substâncias que julgar necessário.
5.) Poder-se-á acertar o pH conforme o desejado, utilizando-se HCl 1N ou NaOH 0,1N, ou ainda,
gaseificando-se com CO2.
6.) Completar o volume com água tridestilada e esterilizar por filtração á vácuo, utilizando pressão
positiva.

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Composição do Meio RPMI 1640 da Empresa Cultilab (http://www.cultilab.com.br/paginas/cultivocelular1.3.html)

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