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Original Article

Corrección de la mutación patógena FBN1 del síndrome de Marfan

mediante la edición de bases en células humanas y embriones
heterocigotos
Yanting Zeng,1,5 Jianan Li,2,5 Guanglei Li,1,5 Shisheng Huang,2 Wenxia Yu,2 Yu Zhang,2 Dunjin Chen,1,3
Jia Chen,2 Jianqiao Liu,1 and Xingxu Huang2,4

1 Departamento de Medicina Reproductiva, Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou,

Guangzhou 510150, P. R. China. 2Escuela de Ciencias y Tecnología de la Vida, ShanghaiTech University,
100 Haike Road, Pudong New Area, Shanghai 201210, China; 3 Laboratorio clave para la reproducción y
genética de los institutos de educación superior de Guangdong, laboratorio clave para enfermedades
obstétricas mayores de la provincia de Guangdong, tercer hospital afiliado de la Universidad de Medicina de
Guangzhou, Guangzhou 510150, P.R. China; 4CAS Centro de Excelencia en Ciencia Celular Molecular,
Instituto de Bioquímica y Biología Celular de Shanghai, Academia de Ciencias de China, Universidad de la
Academia de Ciencias de China, 320 Yueyang Road, Shanghai 200031, China
Hay demandas urgentes para un tratamiento eficiente de las enfermedades genéticas hereditarias. La
tecnología de edición de bases ha demostrado su eficacia y precisión en la sustitución de bases en
embriones humanos, lo que proporciona un tratamiento potencial en una etapa temprana para las
enfermedades genéticas. Aprovechando esta tecnología, corregimos una mutación patógena del
síndrome de Marfan, FBN1T7498C. Primero probamos la viabilidad en células mutantes, luego
conseguimos con éxito la corrección genética en embriones humanos heterocigotos. Los resultados
mostraron que la corrección perfecta mediada por BE3 con una eficiencia de aproximadamente el 89%.
Es importante destacar que no se detectaron indeseables ni indeles en ningún sitio analizado en
muestras mediante secuenciación profunda de alto rendimiento combinada con análisis de
secuenciación de genoma completo. Por lo tanto, nuestro estudio sugiere la eficiencia y la seguridad
genética de corregir una mutación patógena del síndrome de Marfan (MFS) en embriones mediante la
edición de bases.
INTRODUCCIÓN
Se han identificado cerca de 10,000 enfermedades genéticas, que afectan a millones de familias en todo el
mundo. Sin embargo, menos del 6% de las enfermedades genéticas han aprobado tratamientos.1 Para
reducir la carga de enfermedades genéticas en las familias e individuos afectados, se necesitan
urgentemente avances en el diagnóstico y métodos terapéuticos. Si bien el diagnóstico genético
preimplantacional (PGD) es útil para prevenir la transmisión generacional del alelo mutante a los embriones,
el riesgo potencial de errores de diagnóstico aún existe. Por otro lado, la terapia génica proporciona
potencialmente un enfoque activo para corregir las enfermedades genéticas2.
Molecular Therapy Vol. 26 No 11 November 2018 1
 Molecular Therapy

Las tecnologías de edición del genoma, especialmente las basadas en CRISRP / Cas9, se han aplicado con
éxito en la manipulación del genoma 3, lo que ha inspirado una perspectiva brillante de que la mutación
patógena puede repararse con precisión para lograr efectos terapéuticos. Además, éxitos recientes en
genomas precisos. Los ensayos de edición en embriones humanos tempranos han sugerido una cura
potencialmente verdadera para las enfermedades genéticas.6,7 Sin embargo, la edición genómica de
embriones humanos causó grandes preocupaciones debido a problemas éticos e incertidumbres técnicas
con respecto a la eficiencia y efectos fuera del objetivo.8,9 Es bien sabido que la edición del genoma a través
de CRISPR / Cas9 genera roturas de doble cadena (DSB) que evocan la vía de reparación del ADN después
de la unión al extremo (NHEJ) propenso a errores, lo que provoca el apagado -magagénesis dirigida.10 El
sistema de editor de base (BE) desarrollado recientemente se construyó mediante la fusión de la desaminasa
con la proteína dCas9.11 BE edita de manera eficiente la mutación sin el donante, que se requiere para la
edición precisa del genoma a través de la recombinación homóloga a baja eficiencia. BE edita sitios
específicos por conversión de C a T o G a A sin formación de DSB, proporcionando una herramienta de
edición de genoma más segura con bajos efectos fuera del objetivo.12,13 BE se ha aplicado en plantas y
animales, y ha mostrado una enorme ventajas en la edición precisa del genoma a nivel de base en
comparación con CRISPR / Cas9.14 Sobre la base de los desarrollos de los sistemas BE, se han realizado
varios estudios que han demostrado la eficacia y seguridad de BE en embriones humanos.15–17

Estos estudios previos, por otros y los nuestros, han sugerido la viabilidad técnica de corregir enfermedades
genéticas en la etapa de embrión.11 Con este éxito, nos propusimos intentar corregir una mutación genética
patógena en embriones humanos. Con este fin, nos enfocamos en la mutación FBN1 que es causante del
síndrome de Marfan (MFS), un trastorno autosómico dominante con una frecuencia de 0.2 y en el mundo.18
MFS se describió inicialmente hace más de 100 años y se puede diagnosticar con la característica anomalías
en conectivo

Figure 1

2 Molecular Therapy Vol. 26 No 11 November 2018

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. Figura 1. Generación de clones unicelulares que albergan la mutación FBN1T7498C por Recombinación
homóloga asistida por Cas9 / sgRNA
(A) Ilustración esquemática del procedimiento experimental para la generación y corrección de mutaciones
patógenas. El diagrama de flujo de la izquierda muestra que la mutación FBN1T7498C patógena se crea por
primera vez mediante recombinación homóloga asistida por Cas9 / sgRNA (HR) usando un ssODN como
plantilla en células HEK293T; entonces la mutación es corregida por el editor de base. (B) Represe ntación
gráfica de la HR asistida por Cas9 / sgRNA. La sustitución de la base de T a C en el exón 61 del gen FBN1
ubicado en el cromosoma 15 se logra mediante la ayuda de Cas9 / sgRNA asistida usando un ssODN como
plantilla. La "A" resaltada en verde en el sitio dirigido a sgRNA fue reemplazada por una "a" en minúsculas
en la plantilla ssODN. Las secuencias del motivo protoespaciador adyacente (PAM) están subrayadas; Las
secuencias de orientación se resaltan en rojo. (C) Detección de la edición del genoma p or T7EN1. El RNP
se transfectó en las células HEK293T. Dos días después, se recogieron las células y se extrajo el ADN y se
usó para el análisis. (D) Análisis del genotipo de los clones unicelulares con edición del genoma. La célula
individual se seleccionó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) después de la
edición del genoma. Se recogieron los clones celulares de la célula individual. El ADN genómico fue extraído
y amplificado por PCR. Los clones de TA de los productos de PCR se analizaron mediante secuenciación de
ADN. Las secuencias PAM están subrayadas; Las bases modificadas son altas.
iluminado en rojo; supresiones (-), inserciones (+); la izquierda N / N representa los genotipos de dos alelos
del clon único, y la derecha representa el número de clon que alberga el
Genotipo entre el total de 22 clones únicos secuenciados. La izquierda #N indica el número de serie del
genotipo. (E) El cromatograma de secuenciación de Sanger representativo del ADN genómico del clon único
que alberga la mutación homocigótica. La estrella roja indica la base sustituida.

tejidos.19 En este estudio, aprovechando el sistema de edición de base BE3, logramos la corrección específica de
una mutación de FBN1 patógena MFS primero en una línea celular humana y luego en embriones cigóticos
humanos. Por lo tanto, nuestro estudio proporciona una prueba de principio para la viabilidad técnica de la terapia
génica para MFS.

RESULTADOS

La mutación T7498C del FBN1 se creó utilizando CRISPR / Cas9 combinado con ssODN en células HEK293T
Un paciente adulto de sexo masculino diagnosticado de MFS basado en características clínicas.
Se encontró que ciertas características, incluido el embudo torácico y el pie plano, portaban una mutación T7498C
heterocigótica causante informada en el gen FBN1.18 Además, confirmamos la mutación de FBN1T7498C utilizando
la sangre donada y el esperma del paciente mediante secuenciación (Figura S1). Mientras tanto, analizamos a fondo
la secuencia alrededor del sitio de la mutación y encontramos que era adecuada para la corrección utilizando el
sistema BE que introduce una conversión de C a T guiada por un ARN guía único (sgRNA).

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Para demostrar la viabilidad, creamos un modelo celular que alberga una mutación FBN1T7498C utilizando la
proteína SpCas9, sgRNA (en adelante, sgRNA mutacional), y el donante ssODN que contiene la secuencia del
alelo mutante deseado (Figuras 1A y 1B). La duración del ssODN fue de 110 nt para garantizar una recombinación
homóloga (HR) eficiente .20 Tres días después de la transfección del complejo de ribonucleoproteína (RNP) que
contiene la proteína SpCas9 / sgRNA y ssODN, las células HEK293T fueron recogidos. Las células individuales se
clasificaron en los pocillos de una placa de 96 pocillos para obtener colonias individuales. Una porción de las
células sin clasificar se usó para la extracción de ADN y el genotipado mediante el ensayo T7EN1. Los resultados
mostraron bandas de escisión claras (Figura 1C), lo que demuestra que Cas9 / sgRNA medió la edición eficiente
del genoma. Con esto, genoteamos adicionalmente los clones unicelulares para con fi rmar las mutaciones
mediadas por Cas9 / HR asistida por sgRNA. Se analizaron un total de 22 colonias mediante secuenciación de
Sanger (Figura 1D). Entre estas colonias, 9 fueron genotipadas con solo los alelos de tipo salvaje, y las 13
restantes (alrededor del 60%) tuvieron 12 tipos de mutaciones detectadas, incluyendo 11 tipos de indeles o
mutaciones puntuales deseables (Figura 1D). Dos colonias de células albergaron la mutación deseada en forma
homocigótica, como lo muestra el cromatograma de secuenciación de Sanger (Figura 1E). Una de las colonias de
células FBN1T7498C homocigotas se seleccionó para un estudio adicional.

A continuación, se examinó el objetivo no deseado del sgRNA mutacional para garantizar la especificidad. Se
predijo un total de siete sitios fuera del objetivo utilizando el software publicado. Usando el ADN genómico de la
colonia de células FBN1T7498C homocigótica, las secuencias alrededor de los siete sitios fuera del objetivo se
amplificaron y se sometieron al ensayo T7EN1. No se observaron bandas de escisión para ninguno de estos sitios
(Figura S2A), lo que sugiere que los efectos fuera del objetivo probablemente sean mínimos. Mientras tanto, los
productos de PCR se sometieron a secuenciación de Sanger. Como se esperaba, no se observaron picos
mutacionales (Figura S2B), lo que confirma aún más la especificidad.

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Figura 2. Corrección del FBN1T7498C patógeno.

Mutación por edición de base en células humanas

(A) Ilustración esquemática de la corrección de la mutación patógena FBN1T7498C. La "g" en minúscula resaltada
en verde en el sitio objetivo fue sustituida por una "g" en minúscula en verde. Las secuencias PAM están
subrayadas; la secuencia de destino se resalta en rojo. (B) El cromatograma representativo de la secuenciación
de productos de PCR. Las células que albergan la mutación FBN1T7498C se transfectaron con sgRNA y plásmidos
que expresan BE3. Las células se recogieron y el ADN genómico se extrajo y amplificó por PCR. Los productos
de la PCR se analizaron mediante secuenciación de ADN. La estrella roja indica la base sustituida. (C) Análisis de
secuenciación de la edición base. Los clones de TA de los productos de PCR de (B) se analizaron mediante
secuenciación de ADN. Las secuencias PAM están subrayadas; las bases seleccionadas en minúsculas están
resaltadas en verde; las bases modificadas en rojo; La N / N representa colonias positivas del total secuenciado.
(D) El cromatograma representativo de la secuenciación de clones TA. Se secuenciaron clones TA de (C). La
estrella roja indica la base sustituida.

Corrección de la mutación T7498C por BE3 en células mutantes HEK293T con alta especificidad La alta
fidelidad de la edición de base nos animó a probar la posibilidad de corregir la mutación T7498C en las células
FBN1T7498C utilizando BE3. Por lo tanto, diseñamos el sgRNA (en adelante, sgRNA correccional)
(Figura 2A). Las células FBN1T7498C descritas anteriormente se transfectaron con sgRNA correccional y
plásmidos que expresan BE3. Tres días después, se recolectaron las células y se extrajo el ADN genómico
y se usó como plantilla para amplificar la secuencia diana. Los productos de la PCR fueron sometidos a
secuenciación de Sanger. Los resultados mostraron que, a diferencia de los picos individuales detectados en
las células de tipo salvaje o FBN1T7498C, se observaron picos dobles en las células seleccionadas (Figura
2B), indicativo de la ocurrencia de eventos de corrección. Los productos de la PCR fueron clonados con TA
y secuenciados para con fi rmar la corrección de la mutación. Los resultados mostraron que se editaron 10
de 20 clones (50%). Entre estos clones editados, ocho tenían una corrección de C a T deseable en 7498
(Figura 2D), mientras que los dos restantes tenían una conversión de C a G no deseada en 7498 o una
conversión de C a T en otras posiciones (Figura 2C ). Por lo tanto, la eficiencia general de la corrección del
alelo FBN1T7498C por el sistema de edición de base fue alta.

Corrección de la mutación T7498C por BE3 en embriones heterocigotos mutantes con alta especificidad
La corrección eficiente y específica del patógeno MFS.
La mutación FBN1T7498C nos animó a probar este proceso en embriones humanos. Los ovocitos inmaduros
se recolectaron para investigación con el consentimiento informado de donantes individuales. Los ovocitos
recolectados se sometieron primero a maduración in vitro. Luego los ovocitos madurados.

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 Molecular Therapy
se utilizaron para la fertilización in vitro (FIV) por ICSI (inyección intracitoplásmica de esperma) de esperma único
donado por el paciente con MFS con la heterocigota FBN1T7498C mutación (Figura 3A). De 16 a 18 horas más
tarde, se recolectaron todos los cigotos y algunos de ellos se microinyectaron con el ARNm de BE3 y el ARNgg
correccional en concentraciones de 100 y 50 ng / ml, respectivamente. Como control, los otros cigotos se
inyectaron de forma similar con el ARNm de BE3 y el ARNgg codificado. Los embriones se cultivaron
adicionalmente durante 2 días y luego se recogieron para su análisis. Se obtuvieron un total de siete pruebas y
siete embriones de control que mostraron un desarrollo aparentemente normal (Figura 3B). Todas las muestras se
utilizaron para la amplificación del genoma completo y luego se genotiparon mediante secuenciación de Sanger.
Como se muestra en la secuencia de los cromatogramas, todos los embriones de prueba mostraron A en el sitio
7498 (sitio G4), mientras que tres de los siete embriones de control tenían G (aproximadamente el 50%, como se
esperaba), lo que indica que la corrección del alelo en la prueba de embriones ocurrió a una tasa cercana al 100%
(Figuras 3C y 3D; Embrión-1 ~ 7 en las Figuras S3A y S3B). Sin embargo, se detectó una conversión de C a T no
deseada además de la corrección deseable en el Embryo-7 (Figura 3C). Para caracterizar aún más la edición de
la base mediada por BE3, se usaron otros 11 embriones para repetir la prueba por microinyección de BE3 y el
sgRNA correccional como anteriormente. La secuenciación de los productos de PCR del sitio objetivo mostró que
10 de los embriones editados produjeron una conversión completa en el sitio 7498, además del Embryo-9, que
albergaba alrededor del 60% de G-a-A en el sitio 7498. Estos resultados mostraron una corrección eficiente
mediada por BE3 de la mutación patógena
en embriones.

Para caracterizar a fondo los efectos de edición, analizamos exhaustivamente mediante la secuenciación profunda
de las siete muestras de prueba (Embryo- 1 ~ 7 en la Figura S3A) y las tres muestras de control de embriones

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Figura 3. Corrección de la mutación patógena FBN1T7498C mediante edición de la base en embriones

humanos heterocigotos
(A) Ilustración esquemática del procedimiento experimental para la corrección de la mutación patógena por
editor de base en embriones humanos. (B) La etapa de desarrollo de los embriones corregidos y los
embriones de control antes y después del tratamiento. (C) El cromatograma representativo de la
secuenciación de productos de PCR de los embriones humanos corregidos. Se recolectaron los embriones
humanos tratados con el editor de bases, y el ADN genómico se extrajo y amplificó por PCR. Los pro ductos
de la PCR se analizaron mediante secuenciación de ADN. Las estrellas rojas indican la base del objetivo; la
flecha indica otra sustitución de base en la región objetivo. (D) El cromatograma representativo de la
secuenciación de los productos de PCR de los embriones humanos de control. Los embriones humanos de
control se recogieron y el ADN genómico se extrajo y amplificó por PCR. Los productos de la PCR se
analizaron mediante secuenciación de ADN. Las estrellas rojas indican la base del objetivo; los picos mixtos
en el sitio objetivo en Control-1 indican los diferentes tipos de nucleótidos.
(E) El análisis de genotipado por secuenciación profunda. Se recogieron todas las muestras, incluidos tres
controles y siete embriones humanos corregidos, y se extrajo el ADN genómico y se amplificó mediante PCR.
Los productos de PCR se analizaron mediante secuenciación profunda. Se calculó el porcentaje de genotipos
diferentes de todas las muestras.

Con el genotipo heterocigoto. Los resultados mostraron que los tres embriones de control albergaban casi la
mitad de los alelos de tipo salvaje y la mitad de los alelos mutantes (Figura 3E). Para los embriones de
prueba, seis embriones mostraron un 100% de alelos de tipo salvaje sin otra conversión de base o datos, lo

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que indica una corrección eficiente y alogénica del alelo isogénico. Como se esperaba, aproximadamente el
20% del material genético de Embryo-7 mostró dos conversiones de C a T (C1 y C4). En conjunto, estos
resultados demostraron la alta eficacia y precisión de BE en la corrección de la mutación patógena
FBN1T7498C de MFS en embriones humanos.

La detección de conversión no deseada nos recuerda que debemos probar la ventana de edición estrecha
YE1-BE3 y YEE-BE3.21 La prueba en las células FBN1T7498C mediante secuenciación de Sanger
combinada con secuenciación profunda de productos de PCR mostró, como se esperaba, YE1 -BE3 e YEE-
BE3. no media la edición de base no deseada en el sitio G1 como BE3, pero introdujo la conversión de G a
A en el sitio G4 a una eficiencia menor que BE3 (40% y 30% para YE1-BE3 y YEE-BE3, respectivamente,
versus 50% para BE3) (Figuras S4A y S4B). Realizamos análisis adicionales en embriones (10 para YE1 -
BE3 y 11 para YEE-BE3). Secuenciación de la PCR

los productos mostraron que no se detectó conversión de base no deseada en las 21 muestras (Figura S5). Otros
análisis mostraron, además de los genotipos de tipo salvaje, que indican una corrección completa, tres muestras
de YE1-BE3 (Embryo-19, -23 y -26) albergaban un genotipo patógeno y seis muestras de YEE-BE3 (Embryo-29,
-32, -33, -36, -38 y -39) contenían tanto el genotipo salvaje como el genotipo patógeno. Tomados en conjunto, BE3
presenta una mayor eficiencia, mientras que YE1-BE3 y YEE-BE3 realizan una edición de bases in vivo más
precisa.

Detección fuera del objetivo mediante secuenciación profunda y secuenciación de todo el genoma
Dado que la mutagénesis fuera del objetivo es la principal preocupación del genoma
de edición, 32 sitios fuera de destino potenciales con hasta 4 nt de desajuste para el sgRNA correccional fueron
amplificados con PCR de siete muestras corregidas (Embryo-1 ~ 7) y tres muestras de control (Control-1, Control-
2 y Control 7) De embriones heterocigotos. Los productos de PCR para cada sitio se mezclaron por igual y se
sometieron a secuenciación profunda. El análisis de los datos de la secuenciación profunda mostró que no se
detectaron fuera del objetivo ni indeles (Figura 4; Figura S6).

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Figura 4. Análisis fuera del objetivo de embriones humanos heterocigotos corregidos y de control Se recogió ADN
genómico de siete embriones humanos corregidos y tres de control, y el ADN genómico se extrajo y amplificó
mediante PCR. Los productos de PCR se analizaron mediante secuenciación profunda. Se calculó el porcentaje
de C a T dentro de una ventana de 10 nt cerca del extremo distante PAM del protoespaciador en 32 sitios
potenciales fuera del objetivo. Las secuencias PAM están subrayadas; los sitios que no coinciden se resaltan en
rojo.

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Nosotros realizamos además una secuenciación de todo el genoma para identificar la mutación fuera del
objetivo para Embryo-7, Control-1 y Control-2. Se analizaron todos los posibles sitios fuera del objetivo (419)
con hasta cinco desajustes que difieren de los ARNgn correccionales. Después de excluir los sitios de falsos
positivos según la base de datos de polimorfismos de un solo nucleótido (dbSNPs) y los embriones de control,
no se detectó ningún objetivo fuera de destino (Tabla 1). Estos resultados demostraron la seguridad de
corregir la mutación patógena mediante la edición de bases en embriones tempranos humanos.

DISCUSIÓN
Con el desarrollo de la secuenciación del ADN, se han caracterizado enfermedades acumuladas resultantes
de mutaciones genéticas. La emergencia de la tecnología de edición del genoma CIRSPR / Cas9 ha
revolucionado las investigaciones genómicas. También ha reavivado el entusiasmo por la terapia génica, que
apunta a corregir la mutación patógena en los pacientes afectados.3 Pero la eficiencia y seguridad de la
edición del genoma en embriones humanos causó grandes preocupaciones.2

El sistema de edición de base recientemente desarrollado que ofrece una capacidad de sustitución de base
precisa y específica se considera más adecuado para
enfermedades genéticas que se atribuyen a la mutación de base descrita en la base de datos ClinVar. 11
Aprovechando BE, aquí logramos la corrección de la mutación FBN1 patógena de MFS mediante la edición de
bases en células humanas y embriones heterocigotos. Estos resultados han infundido cierta esperanza de que
una enfermedad genética que no tiene tratamiento actual es potencialmente corregible con una herramienta de
edición de genoma de vanguardia.

Además de la e fi ciencia, una terapia génica exitosa necesita precisión y especificidad específicas. CRISPR /
Cas9 convencional desencadena una vía de reparación de NHEJ ADN propensa a errores después de introducir
un DSB, lo que causa indels incontrolables.22 La edición básica edita sitios específicos por conversión de base
sin la introducción de DSB, lo que proporciona una herramienta de edición de genoma más segura y baja. efectos
fuera del objetivo.23–25 Consistentes con esta noción, por varios tipos de ensayos, nuestros resultados mostraron
una sustitución precisa de la base sin detección de fuera del objetivo ni de los indeles por BE tanto en la línea
celular como en los embriones, que puede ser causada por la especificidad Sin embargo, se detectaron algunos
eventos de conversión de base no deseados, lo que demuestra que para reducir aún más la ventana de edición
sería un foco de mejora técnica futura.

Table 1. Genome-Wide Sequencing Analysis for the Off-Target

SNPs after Possible Off-
Excluding Target Sites

Total SNPs dbSNPs C/T SNPs C/A SNPs C/G SNPs G/A SNPs G/T SNPs G/C SNPs (419 Sites)

Control-5 2,217,143 589,148 89,395 27,787 41,748 90,286 27,415 41,279 –

Control-6 2,235,681 614,848 101,895 27,701 41,909 102,163 27,578 41,325 –

Embryo-7 2,048,936 592,219 98,086 25,945 39,552 97,888 25,877 39,209 0

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UniquelyMolecular
assigned Therapy Vol. 26 No 11 November 2018
349,900 132,946 39,612 4,469 5,482 39,440 4,574 5,375 0
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a embrión-7

en resumen, logramos la corrección de la mutación patógena MFS en el gen FBN1 en embriones humanos. La
corrección por conversión de base mediada por BE fue altamente eficiente y específica, demostrando la viabilidad
de la edición de base en la corrección genética y proporcionando un posible tratamiento de MFS.

MATERIALES Y MÉTODOS
Declaración ética
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou.
Antes de la recolección de ovocitos inmaduros, todos los pacientes han firmado el consentimiento informado donde
acordaron el uso de sus ovocitos descartados para la investigación científica. El paciente con MFS también firmó
el consentimiento informado para donar sus muestras de sangre y semen para la investigación. Todos los
procedimientos clínicos y experimentales relacionados se realizaron en el Centro de Medicina Reproductiva, el
Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina de Guangzhou.

Construcción de plásmidos y transcripción in vitro

Los oligos para mutación y sgRNA correccional se sintetizaron, se clonaron en el vector de expresión pGL3-U6-
sgRNA-PGK-puromycin (51133; Addgene) y pUC57-sgRNA (51132; Addgene), y se transcribieron in vitro como
protocolo mutuo. sgRNA, 50-CGCCAATGGTGTTAACACATAGG-30; sgRNA correccional, 50-
CCGCCAATGGTGTTAACACgTAG-30. Junto al
el sgRNA correccional también se clonó en el plásmido pGL3-U6-sgRNA-PGK-GFP para la comparación de BE3,
YE1-BE3 y YEE-BE3. Se utilizaron los plásmidos de Cas9 (44758; Addgene), BE3 (73021; Addgene), YE1-BE3
(85174; Addgene), y YEE-BE3 (85177; Addgene), y estos plásmidos se transcribieron in vitro como protocolo
informado. 17 Todo el ARN transcrito se almacenó a -80 ° C. El ssODN se sintetizó en Sangon Biotech (http:
//www.sangon. Com /) como la siguiente secuencia: 50-GACGTATGGTGTTGGG
TAAATCCGGGAGGACATTGTGTGGGGGGGGGGGGTGGTAGACGGTAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGGGGGGGGGGGTGGGGGTGTGTGTGTGT
AGCGGTAGG

Cultivo de células y transfección

Las células HEK293T se cultivaron en DMEM (Hyclone), complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) (v /
v) (Gemini). El complejo RNP se transfectó utilizando la transfección nuclear con el protocolo Lonza
(https://www.lonza.com/) para crear las células mutantes. En resumen, el el tampón de transfección se preparó de
acuerdo con el protocolo (V4XC-2024; Lonza). Las células 1 M se recogieron y se lavaron con PBS una vez;
entonces el PBS se eliminó a fondo. La cantidad de proteína Cas9, sgRNA y ssODN fue de 3, 1.5 y 3 mg,
respectivamente. El RNP-ssODN se mezcló con el tampón preparado para descarga eléctrica con el programa

Molecular Therapy Vol. 26 No 11 November 2018 11

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DS150 en el instrumento 4D. Los plásmidos se transfectaron utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Life
Technologies) de acuerdo con los protocolos del fabricante, para corregir las células mutantes.

Citometría de flujo e identificación de colonias celulares positivas

Tres días después de la transfección del complejo RNP, una parte de las células se recogió y se sometió a la
citometría de flujo para la clasificación de una sola célula. La célula única se cultivó en una placa de 96 pocillos
durante aproximadamente 10 días; luego las colonias celulares se dividieron en dos partes. Una parte se utilizó
para identificar el genotipo y otra parte se cultivó en una placa de 24 pocillos. Las células utilizadas para la
genotipificación se lisaron en el tampón de lisis (KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, Tris 10 mM [pH 8,0], Nonidet al 0,5%).
P-40, Tween 20 al 0,5%, 100 mg / ml de proteasa K) a 65 ° C durante 30 min, luego a 98 ° C durante 3 min. Se
usó 1 ml de lisado como plantilla para amplificar las secuencias diana utilizando los cebadores relacionados (Tabla
S1).

FIV y microinyección
Los ovocitos inmaduros se cultivaron en medio de maduración (Cooper Surgical / SAGE, Trumbull, CT, EE. UU.)
Suplementado con 75 mIU / mL de hormona estimulante del folículo (FSH) y hormona luteinizante (LH). Los
ovocitos maduros fertilizados con el esperma del paciente MFS utilizando ICSI. 16-18 horas más tarde, la
fertilización se confirmó por la formación de dos pronúcleos. Las concentraciones de mRNA de BE3 y sgRNA se
ajustaron a 100 y 50 ng / ml como se informó anteriormente.17 La microinyección se realizó utilizando un
microscopio invertido equipado con un microinyector y micromanipuladores. Los embriones corregidos se
cultivarán durante 2 días utilizando procedimientos estándar. Luego, estos embriones fueron digeridos utilizando
una solución ácida de Tyrode (Solarbio, Beijing, China). Los embriones recolectados se amplificaron utilizando el
kit de célula única Discover-sc (N601-01; Vazyme) para obtener suficiente ADN para la identificación de genotipo.

Análisis fuera del objetivo y secuenciación profunda

Usamos dos softwares para analizar el objetivo no deseado para el sgRNA de mutación y el sgRNA correccional
(http://crispr.mit.edu/ y https: // crispr. Cos.uni-heidelberg.de/), y 7 sitios fuera del objetivo para la mutación de
sgRNA y se obtuvieron 32 sitios fuera del objetivo para sgRNA correccional. Los productos de PCR que
contienen el objetivo activo y el objetivo externo se amplificaron utilizando los cebadores relacionados (Tabla S1).
Los productos de PCR purificados se enviaron a secuencia utilizando la plataforma Illumina Nextseq 500 (2 × 150)
en el Instituto Asociado CAS-MPG para Biología Computacional Núcleo Omics (Shanghai, China), y se generaron
datos limpios 1 M para cada sitio . BWA y Samtools se utilizaron para procesar los datos.

Secuenciación de todo el genoma

La secuenciación del genoma completo del ADN genómico de los embriones se realizó a una profundidad de
secuenciación de 30 × a 40 × utilizando un Illuminina HiSeq X Ten (2 × 150 PE) en el Instituto HuaGen Biotech
(Shanghai, China). Los datos de secuenciación se mapearon utilizando BWA v0.7.16 con un genoma de referencia
humano (GRCh38 / hg38). Las lecturas de secuencia se marcaron para duplicados utilizando Sambamba v0.6.7 y
se encendieron de verdad usando el Genome Analysis Toolkit (GATK v3.7) IndelRealigner. Las variantes fueron
identi fi cadas por GATK HaplotypeCaller, y luego la calidad se evaluó utilizando GATK VariantFiltration. Para

12 Molecular Therapy Vol. 26 No 11 November 2018

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determinar los posibles sitios fuera del objetivo, se seleccionaron C-to-T y G-to-A. También excluimos los SNP
comunes entre los embriones corregidos y de control.

INFORMACIÓN SUPLEMENTARIA
La información complementaria incluye seis fi guras y una tabla, y se puede encontrar en este artículo en línea en
https://doi.org/10.1016/j.ymthe. 2018.08.007.

CONTRIBUCIONES DE AUTOR
X.H., J. Liu y G.L. concibieron y diseñaron el proyecto. G.L., J. Li, Y. Zeng, S.H., W.Y., Y. Zhang y D.C. realizaron
los experimentos. X.H., J. Liu, D.C. y J.C. supervisaron el proyecto. X.H. y G.L. analizaron los datos y escribieron
el documento.

CONFLICTOS DE INTERÉS
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a los miembros de los laboratorios Huang y Liu por las discusiones útiles. Estamos agradecidos con
el Dr. Jianghuai Liu de la Universidad de Nanjing por la excelente edición del idioma. Este trabajo es apoyado por
la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención 31471400), la Comisión de Innovación de
Ciencia y Tecnología de Guangzhou, China (subvención 201604020075) y la Fundación de Ciencias
Postdoctorales de China (subvención 2017M622659).

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