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6 mL de Cultivo de Bacillus.
Resuspender en 780 μL de Solución Salina Citrada (SSC).
Agregar 26 μL de Lisozima e incubar por 1 hora a 37°C. [Realizado en por el personal del
laboratorio sin intervención de los alumnos]
Agregar 187 μL de SDS e incubar por 5 minutos a 80°C.
Agregar 20 μL de Pronasa y 5 μL RNAsa e incubar por 40 minutos a 37°C
Colocar 1 mL de Cloroformo-Alcohol Isoamílico a un tubo de 2 mL y agregar 1 mL de
Lisado celular. Centrifugar a 14 000 rpm por 3 minutos.
Colocar 750 μL de Isopropanol a un tubo de 2 mL y agregar aproximadamente 1 mL de Fase
Acuosa y centrifugar a 14 000 rpm por 2 minutos.
Descartar Sobrenadante y agregar 1 mL de Etanol 70°. Centrifugar.
2. Observaciones.
Imagen 1.
Tras la separación de la fase acuosa producto del agregado de cloroformo y alcohol
isoamílico (varias veces) se agregó etanol absoluto frío de 2 a 4 veces el volumen,
apareciendo así el DNA en forma de hilos o masa mucosa (dependiendo de la cantidad
de DNA, que es precisamente aquella masa viscosa).
Se debió posteriormente cuantificar el DNA a través de espectrofotometría, donde cada
unidad de absorbancia equivaldría a 50 ng/mL como concentración de DNA nativo.
Esta lectura se haría a 260nm, mientras que para poder comprobar pureza del DNA se
realizaría una lectura a 280nm buscando la contaminación proteica.
3. Recomendaciones.
Evitar hablar mientras se realiza el protocolo, así como realizarlo en corrientes de aire,
puesto que el movimiento de la masa de aire puede traer consigo microorganismos del
ambiente y otros contaminantes.
4. Conclusiones.
Se puede aislar DNA microbiano si se puede lisar la pared y membrana, eliminar las
proteínas y ácidos ribonucleicos, esto con ayuda de agentes químicos, bioquímicos o
físicos, representados por las soluciones agregadas, el cloroformo-alcohol isoamílico,
las enzimas como la pronasa o la ribonucleasa pancreática y la centrifugación.
Para ahorrarse un paso, es importante el uso de Pronasa, puesto que esta y la RNAsa
pueden trabajar a la misma temperatura.