PRÁCTICA Nº 14

SEPARACIÓN DE COLORANTES POR CROMATOGRAFÍA

CLÁSICA EN COLUMNA

Fundamento

En esta práctica se pretende visualizar las dos características

fundamentales de todo proceso cromatográfico, como son la migración
diferencial y el ensanchamiento de banda. Para ello procederemos a la
separación mediante cromatografía líquida en columna de los componentes de
una mezcla sencilla compuesta de dos colorantes, azul de metileno y
anaranjado de metilo. Utilizaremos la modalidad de cromatografía de
adsorción, empleando alúmina como adsorbente.

Dependiendo de la composición de la fase móvil así será mayor o menor

la retención de los analitos. Recordemos que en cromatografía de adsorción
las fases móviles más fuertes (mayor poder de elución) son las más polares,
mientras que los disolventes apolares o poco polares son débiles (poco poder
de elución). Así pues empleando etanol como fase móvil el azul de metileno es
el único analito eluido mientras que el anaranjado de metilo es fuertemente
retenido por la fase estacionaria. La elución de este último se lleva a cabo
empleando una fase móvil fuerte como el agua.

El hecho de que los analitos sean coloreados nos va a permitir ver el

ensanchamiento de la banda cromatográfica conforme desciende a lo largo de
la columna.

Finalmente, iremos recogiendo fracciones correspondientes a la elución

del azul de metileno y mediremos su absorbancia para después representarla
frente al volumen de fase móvil. Obtendremos así el cromatograma con el pico
del analito.

Reactivos y disoluciones necesarias

- Alúmina activada para uso en cromatografía.

- Para la fase móvil:
  Etanol.
 Agua destilada.
- Disolución problema: Disolución de azul de metileno y anaranjado de metilo
en etanol conteniendo aproximadamente 0.05 g/l de colorante.

Material e instrumentación necesarios

- Columna cromatográfica con tubo de látex y pinza de regulación de goteo.

- Lana de vidrio (sólo en el caso en el que la columna no incluya una base de
vidrio fritado).
- Tubos de centrífuga.
- Gradilla.
- Cubetas de medida para visible.
- Espectrofotómetro Spectronic.

Procedimiento operatorio

1) Preparación de la columna

Preparar en un vaso de precipitado una suspensión de alúmina en

etanol (aproximadamente 20 g. de alúmina en 30 ml de etanol) y adicionarla a
la columna en cuya base se ha situado un poco de lana de vidrio. Recoger
varias veces parte del etanol adicionado sobre el vaso con la alúmina y
terminar de trasvasar la misma a la columna. Obtener un depósito homogéneo
de fase estacionaria de una altura comprendida entre 8 y 10 cm, manteniendo
abierta la columna por su extremo inferior y evitando que el nivel de etanol
descienda por debajo del de alúmina.

2) Separación de los componentes de la muestra

Abri
r la llave hasta que el nivel de etanol esté aproximadamente 1 mm por encima
de la capa de absorbente. Adicionar suavemente 2 ml de la muestra problema,
evitando remover la fase estacionaria. Abrir la llave y dejar gotear hasta que el
nivel de muestra llegue al adsorbente. A continuación se procede a eluir
(separar) la banda correspondiente al azul de metileno mediante la adición de
pequeñas fracciones (1-2 ml) de etanol. Para ello, se deja que gotee la fase
móvil por la parte inferior de la columna y, se va recogiendo en tubos de
centrífuga en fracciones de 2 ml. Después se diluyen todos los tubos hasta 4
mL con etanol y se agita.
 Una vez eluido totalmente el azul de metileno se procede a la elución
del anaranjado de metilo mediante la adición de pequeños volúmenes de agua
desionizada.

3) Medida de la absorbancia de las fracciones correspondientes al azul de

metileno.

Medir la absorbancia, a 665 nm, de las diferentes porciones obtenidas al

eluir el azul de metileno, empleando etanol como blanco.

Resultados

I. Dibujar la columna cromatográfica en uno de los momentos de la

elución del azul de metileno (emplear lápices de colores para indicar la
posiciones de las dos bandas cromatográficas).

II. Representar gráficamente en la página siguiente, para el azul de

metileno la absorbancia (A) medida en función del número de ml de
eluyente.

A( = 665 nm)

ml
Eluidos
Observaciones

Vº Bº