La selección bidireccional de analgesia alta o baja inducida por estrés afecta la

actividad de la proteína G

La activación del sistema opioide endógeno es un mecanismo de defensa desarrollado

evolutivamente en respuesta a un desafío estresante comúnmente conocido como
analgesia inducida por estrés (SIA). Las diferentes vías de supresión intrínseca del dolor
que implican distintos neurotransmisores se activan según la duración y la intensidad del
factor estresante. Los factores estresantes de baja intensidad, como los baños cortos
forzados, desencadenan un SIA mediado por opioides, mientras que los mecanismos de
inhibición del dolor no opioides dominan a medida que aumenta la intensidad del factor
estresante (Parikh et al., 2011). El SIA dependiente de opioides se asocia principalmente
con la liberación de β - endorfinas de los núcleos hipotalámicos evidenciados por la
naloxona que no elimina completamente el SIA en ratones knockout (Millan et al., 1981;
Rubinstein et al., 1996). Por otro lado, el SIA no opioide involucra a otros sistemas
neurotransmisores y receptores, como NMDA, GABA, noradrenalina o endocannabinoides
(Marek y otros, 1991; Skerritt y otros, 1981; Suplita y otros, 2006; Takahashi y otros. , 1984).

En la búsqueda de explicar esta sorprendente diferencia en la sensibilidad a los opioides, se

presentaron varias hipótesis. Se propuso por primera vez que este rasgo está fuertemente
influenciado por múltiples loci polimórficos. Como la hipótesis genética era insuficiente para
explicar completamente la base de las diferencias fenotípicas entre los ratones HA y LA,
surgieron otras teorías. Como no se observaron diferencias notables en la expresión del
receptor opioide o la unión entre los ratones HA o LA (Kest et al., 1999), postulamos que las
diferencias en los sistemas de señalización intracelular son responsables, al menos en
parte, de la actividad del sistema opioide divergente entre las líneas. Especulamos que se
producen alteraciones en la actividad de la proteína G en las regiones del SNC: i) que
modulan las vías del dolor ascendente y descendente; ii) que regulan la función
neuroendocrina del cerebro durante una respuesta al estrés; iii) son importantes para la
formación de la memoria y los aspectos emocionales y motivacionales del dolor.

2. Materiales y métodos

2.2. Animales y cría

Se utilizaron en el estudio ratones de ocho a diez semanas de edad (35–40 g)
seleccionados durante 92 generaciones para analgesia inducida por estrés (SSIA) alta (HA)
y baja (LA).
2.3. Prueba de placa caliente
Los ratones se colocaron en un cilindro transparente (15 cm de diámetro) colocado en una
placa cuadrada de latón calentada hasta 56 ° C. La latencia de retirada de la pata se
registró con un cronómetro. Sólo se consideraron respuestas nocivas las patas vigorosas,
las patadas o los saltos. Los ratones se sometieron a tres mediciones independientes
separadas por un período de descanso de 10 s. Los datos se recolectaron antes del
tratamiento con morfina (3–249 μmol / kg, i.p) y 30 minutos después. El tiempo de corte se
ajustó a 60 s.

2.4. Prueba de cola

Los ratones se sujetaron con un paño de algodón con la cola (a 2/3 de su longitud) colocada
sobre una fuente de calor radiante. La latencia de extracción de cola fue registrada por un
temporizador incorporado. El tiempo de corte se ajustó a 10 s para evitar quemaduras. Las
mediciones se tomaron a intervalos de 10 s al inicio y 30 minutos después del tratamiento
con morfina.

2.5. Inducción de la analgesia inducida por el estrés de la natación

Los ratones se colocaron en una caja blanca opaca, rectangular (23 × 40 × 15 cm) llena con
20 cm de agua corriente a 20 ° C y se sometieron a un baño de 3 min. Una vez completado
el desafío, los animales se colocaron bajo una lámpara de calentamiento en un recipiente
acolchado con una capa gruesa de toallas de papel y se dejaron secar durante 2 min.
Luego, los ratones fueron sacrificados, se les extrajeron los cerebros y se pusieron
inmediatamente en hielo.

2.6. Preparación de la muestra para ELISA

Se homogeneizaron cerebros completos (sin cerebelo) de ratones sometidos a grupo
control y SSIA. La concentración de proteína se determinó mediante el método BCA con un
kit listo para usar. La concentración de β-endorfinas se determinó en 50 x muestras diluidas
con el kit ELISA de β-endorfina de ratón (Elabscience Biotechnology Co., Ltd, Wuhan,
China).
2.7. Estudios de radioligandos funcionales.

2.7.1. Preparación de homogeneización Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical

y las regiones cerebrales se diseccionaron en hielo. El tejido aislado se homogeneizó . La
concentración de proteína se estimó con el método de Bradford antes de cada ensayo.
2.7.2. Ensayo de unión de [35 S] GTPγS. Se incubaron homogenados de ratones HA y LA
(35 μg / ml) durante 90 min a 30 ° C por triplicado con 0,8 nM [35 S] GTPγS y DAMGO o
morfina (10 −10 - 10 −5 M) en el agente de unión (Tris-HCl 50 mM, pH = 7,4, EGTA 1 mM,
MgCl2 3 mM, NaCl 100 mM, PIB 30 μM).

2.8. Estadística y análisis de datos.

Los datos sin procesar de los experimentos in vivo se transformaron en los valores de
efectos máximos posibles (% MPE ± SEM) de acuerdo con la siguiente fórmula: (viene en el
artículo)

donde: L p - latencia de línea de base; L k - latencia post-droga.

3. Resultados

3.1. El efecto de la morfina en ratones HA y LA

La morfina produjo una elevación dependiente de la dosis en los umbrales de dolor térmico
en ratones HA y LA (Fig. 1). En la prueba de placa caliente, que mide una respuesta
nociceptiva mediada supraespinal, la morfina fue 6.6 veces más potente en HA que en
ratones LA (Tabla 1, Fig. 1A). En la prueba de colapso de la cola, que refleja la activación
de los sitios de la columna vertebral, la morfina mostró una potencia 3.2 veces mayor en los
ratones HA (Tabla 1, Fig. 1A). Además, la morfina fue 6.3 veces y 13.1 veces más potente
en la cola que en la prueba de placa caliente en HA y ratones LA, respectivamente.

3.2. Niveles de β-endorfina en el cerebro en ratones HA y LA

Como se muestra en la Fig. 2, los ratones HA y LA diferían entre sí en la concentración de
β-endorfina cerebral en condiciones basales y de estrés (Fig. 2). Los ratones HA exhibieron
niveles de β - endorfinas β en la línea de base significativamente más altos e inducidos por
el estrés que sus contrapartes de LA.

3.3. Activación de proteína G en estructuras del SNC de ratones HA y LA

Ambos agonistas de los receptores opioides, DAMGO y morfina produjeron una

estimulación dependiente de la dosis de la unión de [35 S] GTPγS en homogeneizados de
las siete estructuras cerebrales y la médula espinal (Tablas 2 y 3). En ratones HA, se
registraron los estímulos más altos de estimulación para DAMGO (50% por encima del valor
basal) para los homogenados de la materia talámica, hipotalámica y gris periacueductal
(PAG). Se obtuvieron eficacias moderadas de estimulación (hasta 50% por encima de la
línea de base) en el cuerpo estriado, cortezas frontal y prefrontal, hipocampo y amígdala..
En la HA, se obtuvieron valores más altos de E max en homogeneizados del tálamo,
hipotálamo , hipocampo y PAG . Sorprendentemente, la eficacia de DAMGO en
homogenados de la amígdala de LA fue significativamente mayor que en ratones HA. No se
observaron cambios en la potencia DAMGO (pEC 50) para las regiones mencionadas
anteriormente. Sin embargo, los valores de pEC 50 fueron considerablemente más altos
para DAMGO en la corteza prefrontal de HA que en ratones LA sin cambio en la eficacia.

Cuando se probó la morfina para determinar su eficacia en la activación de la proteína G en

ratones HA, los valores más altos se obtuvieron para los homogeneizados talámicos,
mientras que solo se observó una estimulación moderada en las otras regiones del SNC
(Tabla 3). De manera similar a como se observó para DAMGO, se observó una mayor
eficacia de morfina en ratones LA en homogeneizados de amígdala. Además, la morfina fue
más potente en la corteza prefrontal de HA que en ratones LA.

4. Discusión

El estudio presentado aquí fue otro intento de identificar el posible factor que contribuye a la
divergencia en la sensibilidad de los opioides entre los ratones seleccionados para
analgesia alta y baja. Como se predijo, la morfina produjo un mayor efecto antinociceptivo
en la HA que en la línea LA, lo que confirma la escasa participación del sistema opioide en
la generación de antinocicepción en ratones LA. Hemos demostrado que la reproducción
selectiva para la analgesia inducida por el estrés ha afectado más prominentemente la
señalización de la proteína G en el tálamo, el hipotálamo, la PAG y el hipocampo. En estas
regiones del cerebro, la activación de la proteína G fue significativamente mayor en HA que
en los ratones LA.
Múltiples estudios en cepas consanguíneas proporcionaron pruebas de que la sensibilidad
de los opioides estaba correlacionada con alteraciones en la expresión, densidad o
densidad de los receptores opioides o estaba relacionada con la existencia de marcadores
específicos de locus de rasgos cuantitativos (QTL) (Kest et al., 1998; Krumins et al., 1990)
(Belknap et al., 1995; Kozak et al., 1994).

En nuestro presente estudio, donde se midió la actividad de la proteína G estimulada por

agonistas, encontramos que la eficacia de DAMGO y morfina fue mayor en HA en las
regiones del SNC involucradas en la modulación y la percepción de la información
nociceptiva. Particularmente, la eficacia de DAMGO y morfina fue notablemente mayor en
los homogeneizados talámicos de HA que en los ratones LA. El tálamo desempeña un
papel fundamental en el procesamiento y la transmisión de la entrada nociceptiva a la
corteza y la médula espinal dorsal lo que permite los componentes sensorial-discriminativos
y afectivos-motivacionales del dolor.

El hipotálamo fue otra estructura donde se observaron diferencias en la eficacia de DAMGO

entre los ratones HA y LA. El hipotálamo desempeña un papel importante para facilitar la
respuesta autonómica ante un evento estresante. Además, al formar conexiones con la
PAG y la médula ventromedial rostral (RVM) también forma parte de la ruta de inhibición del
dolor descendente (Dafny et al., 1996). Muchos estudios han demostrado que la
estimulación eléctrica o la microinyección de opioides en los núcleos hipotalámicos laterales
provoca antinocicepción, mientras que las lesiones de la parte medial inducen hiperalgesia
(López et al., 1991; Manning y Franklin, 1998; Vidal y Jacob, 1980).

También se encontró una mayor actividad de proteína G relacionada con opioides μ en el

hipocampo de ratones HA, que desempeña un papel activo en la inhibición del dolor durante
el estrés. Los mecanismos de la antinocicepción del hipocampo mediados por opioides son
poco conocidos, pero la reducción en el volumen del hipocampo se ha asociado con dolor
crónico (Grilli, 2017).

Es posible que los ratones de la línea LA sean más sensibles a la estimulación dolorosa
debido a la función del receptor opioide µ en la PAG. También hay evidencia de que la
estimulación de la PAG provoca miedo y ansiedad, lo que corresponde bien con las
observaciones de que los ratones LA responden menos a los estímulos acústicos aversivos
(Blaszczyk et al., 2010; Nashold et al., 1969).

En conclusión, el estudio presentado ha allanado el camino hacia una comprensión más

completa del estado funcional de los receptores opioides μ en las principales regiones del
cerebro responsables de los rasgos que diferencian a los ratones HA y LA como resultado
de la reproducción selectiva. En este punto, sin embargo, es difícil determinar si la
funcionalidad alterada de los receptores opioides μ es el principal factor que contribuye a la
divergencia observada. Es altamente posible que la señalización de la proteína G alterada
sea solo parcialmente responsable de la manifestación de rasgos relacionados con la
nocicepción, la ansiedad o la impulsividad emocional en ratones criados selectivamente
para SSIA alta y baja.