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Viernes 20 de septiembre
2018-2
3 0,272 0,273 0,355 0,387 0,286 El tiempo de incubación es importante durante una
4 0,369 0,369 0,411 0,471 0,37 reacción catalizada por una enzima, debido a que, con
5 0,524 0,452 0,51 0,514 0,474 un tiempo mayor o menor al adecuado para la enzima,
se puede presentar un comportamiento menor al
Tabla N°12. Resultados de la curva de calibración
esperado o incluso puede que no se pueda realizar una
En donde la ecuación de la grafica permite identificar la
correcta toma de datos, por la baja producción que se
concentración de fosforo en las muestras implicada
puede presentar una vez se ha pasado el tiempo
posteriormente.
óptimo. En esta sección se decidió realizar un promedio
𝑦 = 1,05𝑥 − 0,0264
Ecuación N°1. Ecuación de la grafica
a los datos obtenidos debido a que se encontró que los
Además, el valor de R cuadrado permite descartar los del Grupo 3 no son muy adecuados para graficar puesto
demás datos propuestos con anterioridad ya que no que se pasan del límite de 2 en los valores de
poseen exactitud con respecto al patrón de fósforo. absorbancia.
𝑅 2 = 0,9851 Grupo Grupo
Tubo Tiempo Promedio Velocidad
Ecuación N°2. Valor de R cuadrado 3 4
1 1,996 0,943 2 1,4695 0,14695
Patrón de Fósforo Vs Absorbancia 2 2,006 0,753 5 1,3795 0,13795
0,6
3 1,987 0,771 10 1,379 0,1379
0,5 y = 1,05x - 0,0264 4 1,873 0,924 15 1,3985 0,13985
Absrobancia
0,4 R² = 0,9851
5 2,022 1,265 20 1,6435 0,16435
0,3 6 2,065 0,811 30 1,438 0,1438
0,2 Tabla N°14. Promedio de los resultados del tiempo de incubación con el
cálculo de la velocidad.
0,1 Así mismo, la velocidad de la reacción se define como
0 la variación o generación de producto sobre la variación
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 del tiempo, o en el caso del sustrato, como la variación
Patron de fósforo (mg/ml)
Grafica N° 1. Curva de calibración o el consumo de sustrato sobre la variación del tiempo.
Tiempo de incubación óptimo: La actividad [2]
enzimática se puede determinar mediante el uso de En la gráfica se puede estimar que el valor de tiempo
intervalos de tiempo los cuales permitan el consumo donde se presentó una mayor velocidad fue a los 20
cuantitativo de substrato con un exceso de este en el minutos, después de este tiempo, la velocidad tiende a
medio, siguiendo la metodología los siguientes valores presentar un comportamiento que decrece.
por los siguientes grupos.
4 0,939 1,684 0,948
Efecto del Tiempo 5 1,363 1,7 0,947
0,17 6 0,077 2,234 0,862
0,165 Tabla N°14. Resultados del pH
0,16 Cabe resaltar que un pH muy ácido o muy básico puede
Velocidad
0,155
afectar no solo las interacciones del sustrato con el sitio
activo, sino que también la estructura terciaria de la
0,15
misma puede tener daños en su estructura hasta su
0,145
desnaturalización, generando su desactivación y
0,14 evitando su correcto funcionamiento.
0,135
Efecto del pH
0 10 20 30 40 1,6
Tiempo
Velocidad de reaccion
1,4
Grafica N°2. Estimación del tiempo óptimo
Con el fin de verificar el tiempo estimado, se encontró 1,2
en la literatura que el valor recomendado es de 15
1
minutos, [5] sin embargo, se encontró también que en
condiciones estándares de ensayo, el tiempo de 0,8
incubación puede subir hasta 20 minutos, y a partir de
0,6
este tiempo, la velocidad tiende a disminuir
2 3 4 pH 5 6 7
considerablemente, [6] confirmando así el
Grafica N°3. Estimación del pH óptimo
comportamiento experimental obtenido para el tiempo. En la anterior gráfica se puede observar que el punto
Efecto del pH: La actividad enzimática de cualquier máximo de velocidad se alcanza en un pH cercano a 4,
enzima se ve afectada por el valor del pH en el medio, lo que indicaría que manteniendo un buffer de 4 se
ya que la carga neta de la proteína varia dada a su obtendría la velocidad de reacción más alta, claro esta
naturaleza polieléctrica, No obstante, a cierto valor de que esta sería manteniendo también el resto de los
pH los aminoácidos participes en el sitio activo estarán factores constantes, así mismo, al consultar en la
en condiciones óptimas para la actividad catalítica literatura, se reporta que, para la fosfatasa ácida, el
sobre el sustrato correspondiente. La estabilidad que rango de pH óptimo es varia de 3.8 a 6.8, [3] indicando
presenta determinada enzima dentro de un rango de pH que el pH óptimo estimado experimentalmente,
se debe a el número de grupos cargados presentes en concuerda con el comportamiento esperado, sin
la enzima, el cambio en la acidez o basicidad afecta las embargo, en otra fuente se encontró que el pH
cargas de estos grupos, alterando la estructura nativa adecuado para la reacción catalizada por la fosfatasa
de la proteína, generando que esta se precipite o ácida es de 5.2, [4] es decir que, a pesar de haber
desnaturalice, [1] lo que establece entonces un punto obtenido un valor dentro del rango teórico, este no
de pH donde la velocidad va a ser la máxima posible, y corresponde con el valor recomendado para el
al variar el pH a partir de este punto hacia valores funcionamiento de la enzima.
menores o mayores de pH, la velocidad debería tender Temperatura óptima:
a disminuir. La actividad catalítica aumenta con el incremento de la
Los resultados obtenidos durante la práctica se pueden temperatura dentro de un determinado rango, al igual
identificar en la siguiente tabla mostrada a continuación. que el pH cada enzima posee un comportamiento único
tubo Grupo N° 5 Grupo N°6 Grupo N°7 frente a estos valores, el punto en el cual alcanza la
BS 0,797 1,27 0,374 máximo valor se conoce como temperatura óptima. Sin
BE 0,872 1,247 0,491 embargo, todas las enzimas al ser sometidas a
1 1,087 1,433 0,883 temperaturas muy altas pueden perder la actividad en
2 0,948 1,481 1,471 su sitio activo y por lo tanto ser desnaturalizadas.
3 1,022 1,636 1,027
En la siguiente tabla se representan los valores Efecto de la concentracion de la enzima
obtenidos por cada grupo
0,16
Velocidad de reacción
Tubo Grupo 5 Grupo 4 Grupo 6 Grupo 7 0,14
0,12
BS 1,864 1,827 0,437 0,396
(mg/min)
0,1
BE 1,757 1,496 0,536 0,432 0,08
1 1,956 1,857 0,804 0,792 0,06
2 1,88 1,842 1,058 0,913 0,04
0,02
3 1,084 1,878 1,145 0,943
0
4 1,904 1,896 1,098 0,891 0 1 2 3 4 5 6
[S] (mM)
5 1,894 1,902 1,309 0,91
Grafica N° 5 Efecto de la enzima
Tabla N°16. Resultados del cambio de la Temperatura Efecto de la concentración del sustrato:
En este caso se seleccionaron los datos Al mantener la cantidad de la enzima constante y
proporcionados por el grupo N°7 debido a que estos comenzar a variar la concentración se sustrato
datos presentaron el comportamiento más apropiado, gradualmente, la velocidad de la reacción tiende a
puesto que, al graficar, este era el set de datos que más incrementar hasta que alcanza un punto máximo, es
se acercaba a la gráfica de una campana. decir, que, a partir de este punto, la velocidad no va a
Temperatura Vs Velocidad de reaccion aumentar más independientemente de que se siga
0,15 adicionando sustrato, esto se debe a que alcanza un
punto de saturación donde la enzima no va a catalizar
Velocidad de Reacción
50
20
y = 63,222x + 12,487 40
15 y = 164,51x + 18,051
1/V
R² = 0,9308 30 R² = 0,8911
10
5 20
y = 70,002x + 11,495
0 10 R² = 0,9243
0 0,025 0,05 0,075 0,1 0,125 0,15 0,175 0,2
1/[s] (mM) 0
Grafica N°7. Linealización del efecto del sustrato 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
1/[S]
Los presentes valores relacionados de Km y Máx, son:
𝑚𝑔
𝑉𝑚á𝑥 = 0,087 ( ) Conclusiones.
𝑚𝑙
Una vez realizada la practica y el correspondiente
𝐾𝑚 = 5,499 (𝑚𝑀)
análisis, se llegó a la conclusión de que la actividad
Efecto de la presencia de un inhibidor:
enzimática es especifica de cada enzima, debido a que
Ciertas sustancias reducen la velocidad de las
el comportamiento es dependiente de las condiciones a
reacciones enzimáticas, estas se conocen como
la que se encuentre la reacción enzimática.
inhibidores. Para evaluar el comportamiento de una
Adicionalmente se concluye que la estimación de la
enzima frente a un inhibidor, se grafica generalmente,
velocidad máxima al variar un factor es una tarea
un set de datos donde se evalué la actividad de la
sencilla siempre y cuando se realice manteniendo los
enzima sin inhibidor y se compara con la gráfica donde
otros factores constantes y en el rango óptimo para la
la enzima si este actuando frente a un inhibidor. [7]
enzima. Por último, se concluye que:
La respectiva tabla está presente en la sección de
• Se identifico como la variación en diversos
anexos (Ver anexo 2).
factores o condiciones en el medio de reacción
En las siguientes representaciones se puede identificar
y alrededores afectan la cinética enzimática de
el comportamiento del inhibidor de coloración azul y la
la fosfatasa ácida.
del sustrato de color naranja, de igual manera sus
• Se determinó experimentalmente la velocidad
distribuciones son iguales en la curva de linealización
máxima de la reacción al variar condiciones de
Efecto del inhibidor reacción, como la temperatura, el pH y la
0,1 concentración de las especies.
• Se estimaron los parámetros cinéticos Km y
Velocidad (mg/ml)
0,08
Vmáx para las gráficas linealizadas por
0,06
Lineweaver-Burk, donde se estaba evaluando
0,04 el comportamiento de la enzima frente a la
0,02 concentración de sustrato y frente a la
presencia de un inhibidor.
0
0 20 40 60 80 100 120 Referencias
[S] (mM)
[1] Flórez Wilches, A. (2018). Evaluación de la
Grafica N° 8. Efecto del Inhibidor
estabilidad de un extracto enzimático, obtenido
Para identificar los valores asociados de Km y Máx. se
de Penicillium sp. HC1, con actividad
utilizó el método de linealización para su respectivo
endoxilanasa bajo condiciones de
calculo, no obstante, su respectiva gráfica, se ilustrará
almacenamiento. [Tesis de Grado].
a continuación.
Microbiología Industrial, Facultad de Ciencias.
Los presentes valores relacionados de Km y Máx, son:
Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá D.C,
𝑚𝑔
𝑉𝑚á𝑥 = 0,0554 ( ) Colombia. Recuperado de
𝑚𝑙
https://repository.javeriana.edu.co:8443/bitstrea
𝐾𝑚 = 9,114 (𝑚𝑀)
Grafica N° 10. Linealización del efecto del inhibidor
m/handle/10554/35026/Florez.Angie_TG2018.p
df?sequence=1&isAllowed=y Firmas:
[2] Universidad Semmelweis. (2014). Experimental Gabriel Romero
determination of enzyme kinetics parameters. ___________________________________________
Instituto de Bioquímica Medica. Universidad
Semmelweis. Budapest, Hungría. Recuperado Juan Villalobos
___________________________________________
de
http://semmelweis.hu/biokemia/files/2014/08/E
N_lab_enzyme-kinetics_ver20120831.pdf
[3] Guija, E., Soberón, M. & Haak-Mares, H. (2007).
Anexos.
Mecanismo de acción de las fosfatasas ácidas
de bajo peso molecular. Anales de la Facultad
1.
de Medicina, 68 (4). Universidad Nacional Tubo Absorbancia mM 1/[S] Concentración v 1/v
Mayor de San Marcos. Lima, Perú. pp. 356. 1 0,404 5 0,2 0,409904762 0,04099048 24,3959108
ISSN 1025-5583. Recuperado de 2 0,475 10 0,1 0,47752381 0,04775238 20,9413642
http://www.scielo.org.pe/pdf/afm/v68n4/a11v68 3 0,698 20 0,05 0,689904762 0,06899048 14,4947543
n4.pdf 4 0,748 40 0,025 0,73752381 0,07375238 13,5588843
[4] Wiener Laboratorios S.A.I.C. (s. f.). Fosfatasa 5 0,734 60 0,01666667 0,724190476 0,07241905 13,8085218
ácida Total y Protática cinética. Método cinético 6 0,936 80 0,0125 0,916571429 0,09165714 10,9102244
para la determinación de fosfatasa ácida total y
7 0,899 100 0,01 0,881333333 0,08813333 11,3464448
prostática. Wiener Lab. Rosario, Argentina.
8 1,161 100 0,01 1,130857143 0,11308571 8,84284992
Recuperado de http://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademec
um%20espanol/fosfatasa_acida_total_y_prosta 2.
tica_cinetica_sp.pdf
Tubo Absorbancia [S] Concentración V (mg/ml) 1/[S] 1/V
[5] Tsuboi, K., Wiener, G. & Hudson, P. (1956).
1 0,166 5 0,183238095 0,01832381 0,2 54,5738046
Acid phosphatase VII. Yeast
2 0,345 10 0,353714286 0,03537143 0,1 28,2714055
Phosphomonoesterase; Isolation procedure and
stability characteristics. The Journal of 3 0,456 20 0,459428571 0,04594286 0,05 21,7661692
Biological Chemistry 224. pp. 621-635. 4 0,388 40 0,394666667 0,03946667 0,025 25,3378378
[6] Joyce, B. & Grisolia, S. (1960). Purification and 7 0,426 100 0,430857143 0,04308571 0,01 23,2095491
Propierties of a Nonspecific Acid Phosphatase 8 0,684 100 0,676571429 0,06765714 0,01 14,7804054