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Introdução

Enzimas:

A pesquisa sobre enzimas é parte significativa na história da bioquímica. Contudo, no início do


século XIX a catálise biológica foi reconhecida através da conversão do amido em açúcares simples pela
saliva e por vários extratos vegetais e digestão da carne por secreções do estômago. No entanto, Louis
Pasteur conclui que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura é catalisada por fermentos, ou seja,
enzimas eram inseparáveis da estrutura das células vivas dos levedos. Eduard Buchner em 1987 descobriu
que extratos de levedos podiam fermentar o açúcar até o álcool, provando que as enzimas envolvidas na
fermentação continuavam funcionando mesmo quando removidas da estrutura das células vivas. Desde
então numerosos estudo vêm sendo realizados na tentativa do isolamento das numerosas enzimas e o estudo
de suas propriedades catalíticas. [1-3]
As enzimas são moléculas orgânicas presentes nas células de organismos vivos, com a função
específica de catalisar reações químicas. A enzima dá início ao aumento da velocidade de uma reação
química por atuar como catalisador. Possuem atividade catalítica específica e elevada especificidade em
relação aos reagentes cujas transformações químicas catalisam. Por ser economicamente viável, o emprego
de enzimas em diversos setores industriais vem crescendo há vários anos. [2]
Reações lentas em condições biológicas relevantes, não são catalisadas. Portanto, a maioria das
moléculas biológicas são muito estáveis no ambiente aquoso de pH neutro e temperatura moderada
encontrado no interior das células. Reações bioquímicas envolvem eventos químicos improváveis em
condições do ambiente celular, como a formação transiente de intermediários eletricamente carregados e
instáveis ou a colisão de duas ou mais moléculas com a orientação precisa e necessária para que ocorra a
reação.[4]
A característica distintiva de uma reação catalisada enzimaticamente é que ela ocorre no interior
dos limites de uma cavidade, ou fenda, na estrutura molecular da enzima chamada sítio ativo. O substrato
é a molécula que se liga ao sítio ativo e que sofre a ação da enzima. O complexo enzima-substrato é
extremamente importante na reação enzimática, ou seja, ele é o ponto de partida para os tratamentos
matemáticos que definem o comportamento cinético das reações catalisadas enzimaticamente e para as
descrições teóricas dos mecanismos enzimáticos.[4]

Atividade Enzimática

A atividade enzimática é influenciada principalmente pela temperatura, pH e tempo. Vamos ver


cada um deles separadamente.
Temperatura: Seguindo o comportamento das reações químicas, a velocidade da atividade
enzimática aumenta quando se aumenta a temperatura. Entretanto, a velocidade da reação aumenta até um
máximo, após determinada temperatura a velocidade declina rapidamente, mesmo aumentando a
temperatura. Isso ocorre por que a estrutura tridimensional das enzimas se rompe, impossibilitando-a de
formar o complexo enzima-substrato. Pode-se dizer que a velocidade de reação aumenta ou diminui por um
fator de 2 a cada variação de 10 graus centígrados na faixa de 10° a 70°. No caso do pão, esse fator é
importante pois, assim que o pão entra no forno, a temperatura no seu interior é menor que na parte de fora.
Assim as enzimas agem no açúcar com grande rapidez na primeira metade do tempo de assadura. Após isso
são destruídas.[4]
pH: Assim como no caso da temperatura, existe um valor para atividade ótima o qual, após ele
ocorre um rápido decréscimo.
Tempo: A atividade enzimática é influenciada diretamente pela ação do tempo. Quanto mais
tempo a enzima estiver em contato com o substrato, mais produtos serão produzidos, enquanto houver
substrato.

Desnaturação

A desnaturação gera modificações fundamentais nas proteínas, destruindo, em particular, a sua


atividade fisiológica. Na atividade das enzimas um agente crítico é a temperatura. A atividade aumenta com
o aumento da temperatura, acelerando o processo de desnaturação devido ao calor. O pH exerce grande
influência na manutenção da atividade enzimática, devido a alterações no estado de ionização dos
componentes do sistema, em consequência da variação da concentração de H+.[4-5]
Em grande parte da desnaturação de uma proteína ocorre a perda de sua atividade biológica
característica. Quando uma solução aquosa de enzima, por exemplo, é aquecida até seu ponto de ebulição
por uns minutos e depois resfriada, a enzima torna-se insolúvel e não apresenta mais atividade catalítica,
ou seja, desnatura.
Em condições fisiológicas, moléculas de uma mesma proteína apresentam a mesma conformação
denominada nativa. E quando submetida ao isolamento e purificação de uma proteína, onde ocorrem
alterações físico-químicas no seu meio ambiente, sua estrutura espacial é afetada ocasionando a perda da
função biológica. Assim, a proteína é dita desnaturada.[4]

Procedimento Experimental

Inicialmente foram marcados dois conjuntos de 4 tubos de ensaio: T0, T1, T2, T3 ; P0,
P1, P2, P3. Em cada um dos tubos pipetou 1 mL da solução de caseína e 1 mL de solução das
enzimas Tripsina (T) e Protease (P), respectivamente aos tubos T e P. Misturou-se bem e
adicionou-se imediatamente aos tubos T0 e P0, 2 mL de TCA 0,4 M. Incubou os tubos T1, T2 e
T3 ; P1, P2 e P3 em banho-maria a 40ºC e começar a marcar o tempo.. Decorridos os tempos de
5, 10 e 15 minutos, interrompeu respectivamente a reação enzimática nos tubos T1, T2 e T3 ; P1,
P2 e P3 pela adição de 2 mL de TCA 0,4 M aos tubos correspondentes aos respectivos tempos.
Filtrou-se o conteúdo de todos os 8 tubos utilizando funil de vidro e papel de filtro, recolhendo os
filtrados em tubos de ensaio devidamente identificados. A seguir, identificou-se 10 tubos de
ensaio e procedeu seguindo a orientação da tabela abaixo:
Tabela 1 - Procedimento para trabalhar com o reativo folin-Cioucalteu
Tubo Branco T0/P0 T1/P1 T2/P2 T3/P3 Padrão
Tempo - 0 min 5 min 10 min 15 min -
Filtrado - 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL -
Padrão - - - - - 1 mL
tirosina
Água 1 mL - - - - -
Destilada
Na2CO3 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
Folin- 1 mL 1mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Ciocalteu

Misturou, esperou 15 minutos e leu no fotocolorímetro em 660nm.

Resultados e Discussão
As proteases estão entre as enzimas hidrolíticas mais importantes, e podem ser chamadas de C-N
hidrolases, pois catalisam o rompimento dessas reações (figura 1). Fonte:

Figura 1 – Representação de um polipeptídeo sob ação de uma protease, mostrando assim o


rompimento do polipeptideo pelas ligações C-N. Fonte:http://worthington-
biochem.com/DISP/images/reaction.jpg

Neste experimento utilizou-se a caseína é utilizada como substrato para determinação da atividade
proteolítica. Assim, após incubar as proteínas Tripisina (T) e Protease (P) com a caseína, nos tubos
conforme descrito no procedimento experimental. Assim, conseguimos filtrar notando que, no tempo de 20
minutos notou-se uma maior precipitação no tubo que continha protease.
Após filtrar, tratou-se o filtrado como descrito na tabela 01, usando o reagente de Folin-Ciocalteu.
A tabela 02 dispõe os resultados quanto a coloração e a absorbância obtida para cada tubo.

Tubos Branco T0 P0 T1 P1 T2 P2 T3 P3 Padrão


Cor Verde Azul Azul Azul Azul Azul Azul Azul Azul azul
claro Clarp claro Azul claro Escuro Claro escuro
Absorbância - 0,194 0,050 0,040 0,507 0,047 0,839 0,030 1,235 0,319

A leitura foi feita em 660 nm, pois a cor das soluções foi azul, assim como mostrado na figura 02.

Figura 2 – tubos contendo os filtrados e padrão reagindo com Folin Ciocalteau

1,4
Tripsina
1,2 Protease
1,0

0,8
Absorbância

0,6

0,4

0,2

0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (minutos)

Figura 3: Representação gráfica da atividade enzimática da Tripsina e Protease.

Calculou-se a quantidade de Tirosina na amostra, pela seguinte equação, cujos resultados se


encontram na tabela 03.
(𝐷𝐷. 𝑂𝑂. 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎)
× 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶. 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝ã𝑜𝑜
(𝐷𝐷. 𝑂𝑂. 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝ã𝑜𝑜)
Tabela 03: Quantidade de enzima em relação ao tempo.
Tubo T0 P0 T1 P1 T2 P2 T3 P3
Quantidade 1,2 x 10 - 3,1x10 -8 2,5x10 -8 3,17x10 - 2,9x10 -8 5,2x10 -7 1,8x10 - 7,7x10 -
de tirosina 7 7 8 7

Conclusão

Assim, pode-se concluir que a protease foi muito mais ativa do que a tripsina na quebra das
ligações C-N da caseína do leite. Sendo as concentrações de tirosina obtidas com a protease maiores do que
a com a tripsina. Mostrando que é um teste simples e de fácil execução, sendo quali e quantitativo, por
comparação de cor e quantificação da concentração por densidade ótica.

Referencias

CÉSAR, A.C.W.; SILVA, R.; LUCARINI, A.C. Recuperação das enzimas proteolíticas presentes nas
casca e talo do abacaxi, p. 47-54, São Carlos, 1999.

FORGATY, W.M. & KELLY, C.T. Topics in enzyme and fermentation. Biotechnology. v. 3, Chichester,
G, Howood-J. Wiley & Sons, 1979.

WISEMAN, A. Handbook of enzyme biotechnology. 2.ed, Edited by Ellis Horwood, New York, EUA,
p. 460, 1987.

LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L. & COX, M.M. Princípios de Bioquímica. 2.ed., São Paulo-SP,
Sarvier Editora de Livros Médicos LTDA, 1995.

MORRISON, R.T.; BOYD, R.N. Química Orgânica, 5.ed, 1976.