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ISSN: 0258-5936
revista@inca.edu.cu
Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas
Cuba
Key words: Azospirillum, sugarcane, vitroplants Palabras clave: Azospirillum, caña de azúcar, vitroplantas
(Walkley-Black), fósforo asimilable (Bray y Kurtz) 29709) y A. amazonense Y6 (ATCC 35121), todas proce-
(mgP2O5.100g-1), Ca2+ y Mg2+ (cmol.kg-1) (complexometria dentes del cepario del CNPAB/EMBRAPA de Brasil.
mediante valoración con EDTA) y K+ (cmol.kg-1) (fotometría) (9). Actividad de reducción del acetileno (ARA): La capaci-
Determinación de las poblaciones de Azospirillum. Se dad fijadora de nitrógeno de los aislados 8-I, 11-I, 79-I y
realizaron muestreos de la rizosfera en las variedades de 88-I, se determinó por cromatografía gaseosa (15), con
caña de azúcar Ja60-5 y C266-70, en plantas con eda- los siguientes parámetros de corrida: columna de vidrio
des entre cuatro y siete meses crecidas en los suelos 2.7 mm.4 mm, matriz Porapax N80-100 mallas, tempera-
estudiados. Se seleccionaron parcelas no fertilizadas de turas (inyector 100oC, columna 90oC, detector 150oC), flu-
experimentos de dosis de nitrógeno, conformándose jos (nitrógeno, portador, 30 mL.min-1, hidrógeno, combusti-
muestras únicas para cada variedad y tipo de suelo. Una ble, 32.5 mL.min-1, aire 320.5 mL.min-1), tiempo de corrida
vez en el laboratorio y en condiciones asépticas, las raí- seis minutos, tiempo de retención de etileno 3.25 minutos
ces se separaron del suelo con la ayuda de pinzas, lava- y tiempo de retención de acetileno 4.73 minutos.
das primeramente con agua corriente y después con abun- Las cepas se cultivaron durante 24 horas a 35oC en
dante agua destilada estéril; posteriormente se secaron viales de 13 mL de volumen efectivo, que contenían 5 mL
con papel de filtro y se pesó un gramo de cada muestra. de medio NFb semisólido. Los tubos se inocularon en
Las muestras se maceraron en mortero estéril con una atmósfera de 10 % de acetileno y se incubaron por
9 mL de agua destilada estéril y a partir de aquí se reali- espacio de una hora a 35oC. Se realizaron cinco réplicas
zaron diluciones seriadas (102-106), que se sembraron por por tratamiento y los resultados se procesaron por el pro-
triplicado a razón de 0.1 mL en frascos que contenían grama BIOCROM así como se evaluaron estadísticamente
medio NFb (10), los cuales se incubaron a 35oC de tres a mediante análisis de varianza de clasificación simple y
cinco días. Las cuantificaciones se realizaron por el mé- las medias significativas comparadas por la prueba de
todo de número más probable (NMP), mediante la obser- Duncan, mediante el modelo estadístico Tonystat.
vación del crecimiento típico del microorganismo en el Interacción in vitro Azospirillum-caña de azúcar. Se reali-
medio NFb semisólido. En cada dilución los tubos positi- zaron dos experimentos in vitro para evaluar el efecto de
vos se anotaron y los datos se analizaron empleando las cuatro cepas de Azospirillum sobre vitroplantas de caña de
tablas de McCrady. azúcar de las variedades comerciales Ja60-5 y C120-78 en
Aislamiento de cepas. De los frascos con crecimiento fase de enraizamiento, en comparación con el control no
positivo o dudoso, se transfirieron alícuotas al medio NFb inoculado. Se empleó el medio de enraizamiento
semisólido y a las 48 horas se observaron al microscopio Murashige-Skoog (16) con la concentración de nitrógeno
de contraste de fase, para la confirmación de las caracte- reducida a 1/8 (5). En estas condiciones se evaluaron
rísticas celulares. Para la obtención de cepas, se selec- tres cepas nativas y la cepa Sp7 en comparación con un
cionaron los tubos positivos de las mayores diluciones y control no inoculado. Se realizaron 15 réplicas por trata-
a partir de estos tubos, se sembraron por estrías placas miento y las variables evaluadas fueron: peso fresco de la
con medio Rojo Congo (11). Se seleccionaron las colo- raíz, peso fresco del tallo, peso seco de la raíz y peso
nias con características típicas del género, las cuales se seco del tallo. Los resultados se evaluaron
purificaron posteriormente en placas de BMS (10). La estadísticamente mediante análisis de varianza de clasi-
pureza de los aislados se confirmó además mediante ficación simple y las medias significativas comparadas
tinción de Gram, observándose la uniformidad celular al por la prueba de Tukey, mediante el modelo estadístico
microscopio óptico. Para su diferenciación, las cepas se SAS.
enumeraron y se añadió la letra I de INICA. Las colonias
individuales se mantuvieron en refrigeración a 4oC, en RESULTADOS Y DISCUSIÓN
cuñas de agar BMS hasta su uso.
Determinación de las características culturales y Algunas características de la fertilidad de los suelos es-
bioquímicas. Se determinaron la capacidad y las carac- tudiados. En la Tabla I se muestran los resultados del
terísticas de crecimiento de los aislamientos en los me- análisis químico-físico de los suelos.
dios Rojo Congo, NFb semisólido y BMS. Los estudios
morfológicos de las células se realizaron siguiendo las Tabla I. Características agroquímicas de los suelos
descripciones del Manual de clasificación de bacterias Ferralítico Rojo y Ferralítico Amarillento de
de Berguey (12, 13) para el género Azospirillum spp. Ade- las provincias de La Habana y Ciego de
más, para su identificación las cepas se sometieron a Avila
algunas pruebas fisiológico-bioquímicas (oxidasa,
Variables Ferralítico Rojo Ferralítico Amarillento
catalasa, fosfatasa, requerimientos de biotina, asimila- La Habana Ciego de Avila La Habana Ciego de Avila
ción de diferentes fuentes de carbono, hidrólisis del almi- PH (H2O) 6.34 6.52 6.75 7.2
dón y la gelatina, reducción de nitrato a nitrito, NO3-NO2., M.O (%) 3.14 3.16 3.23 2.87
y producción de Indol a partir de triptofano) (14). En los K+ (cmol.kg-1) 0.38 0.82 0.31 0.35
estudios se emplearon las cepas patrones de Azospirillum Ca2+ (cmol.kg-1) 10.29 9.05 17.75 15.27
Mg2+ (cmol.kg-1) 3.28 2.70 4.77 4.38
brasilense Sp7 (ATCC 29145), A. lipoferum Br17 (ATCC
P (mgP2O5.100g-1) 3.81 3.55 3.48 3.02
Estudio de la interacción planta-Azospirillum en el cultivo caña de azúcar (Saccharum sp.)
Según la categorización de los suelos Ferralíticos (17), Azospirillum, conociéndose que los exudados de las plan-
los Amarillentos analizados son neutrales en cuanto a su tas influyen decisivamente en la expresión de los genes
pH; sin embargo, los Rojos son ligeramente ácidos. To- involucrados en la interacción planta-bacteria (20).
dos los suelos tienen porcentaje medio de materia orgá- Los menores valores encontrados en La Habana pue-
nica en el entorno de 3. El contenido de cationes Mg2+ y den estar relacionados con la poca humedad existente
K+ es considerado medio para todos los suelos, con ex- en los suelos en el momento en que se realizaron los
cepción del K+ en el Ferralítico Rojo de Ciego de Ávila, muestreos, pues se debe tener en cuenta que en una
que se considera alto. El contenido de Ca2+ en los suelos región de clima y suelo como Cuba, los períodos de más
Ferralíticos Amarillentos es mayor que en los Ferralíticos altas temperaturas coinciden con las mayores precipita-
Rojos, aunque todos los valores se consideran medios, ciones y tienen lugar entre los meses de mayo-octubre,
siendo esta la base intercambiable predominante en el mientras que la seca se produce desde noviembre hasta
complejo de adsorción para ambos suelos. Los conteni- marzo (21), a lo que se suma el hecho de que los suelos
dos de fósforo en todos los suelos son aceptables. De Ferralíticos Rojos, por poseer características sobresalien-
manera general, se demuestra las favorables caracterís- tes como una marcada uniformidad física, gran profundi-
ticas nutricionales que ellos poseen. dad efectiva y un adecuado nivel de fertilidad en la zona
Poblaciones de Azospirillum spp. en la rizosfera de la de desarrollo del sistema radical, tienen gran valor para la
caña de azúcar. Como se muestra en la Figura 1, la con- producción agrícola; sin embargo, tienen como desventa-
centración de bacterias obtenida en las raíces de las di- ja las grandes pérdidas de agua que se producen por
ferentes muestras fue significativa. Los integrantes del evaporación en la época de sequía, a causa de su estruc-
género Azospirillum se encuentran en números significa- tura abierta (22), factor que puede haber influido en los
tivos en asociación con las gramíneas (18, 19). La resultados. Nuevamente, los mayores recuentos
rizosfera de este cultivo es un ambiente favorable para el microbianos se observaron en la variedad Ja60-5.
desarrollo de estas bacterias, debido a la presencia de Determinación de las características culturales y
fuentes de carbono y energía, las cuales se pueden origi- bioquímicas. Los resultados de la caracterización
nar por los exudados radicales y residuos vegetales que morfológica (Tablas II y III) y bioquímica (Tablas IV y V)
se depositan en el suelo. de los aislamientos, demostraron la similitud de respues-
ta de las cepas estudiadas con las cepas patrones
2.5 a Esx=0.72* A. brasilense Sp7 y A. lipoferum Sp Br17, y coinciden
a
2 con las descripciones del Manual de clasificación de bac-
cel / g. 10 4
b
1.5 terias de Berguey (12, 13) para el género Azospirillum.
Ja60-5
bc Las características resultantes de las nuevas cepas ais-
1 C266-70
d
ladas 79-I, 88-I y 11-I permitieron ubicarlas dentro de la
0.5 d d d especie A. lipoferum, mientras que la cepa 8I aunque
0 tiene resultados que difieren de los de la cepa de A.
F.A F.R F.A F.R brasilense empleada en el estudio, debe quedar ubicada
Ciego de Avila La Habana dentro de esta especie.
Tipo de suelo y localidad Los resultados confirmaron que la inclusión de la siem-
Letras distintas indican que las medias son diferentes (Tukey 0.05) bra en el medio RC facilita el aislamiento de cultivos pu-
ros y la diferenciación del Azospirillum del resto de las
Figura 1. Poblaciones de Azospirillum determina- bacterias dinitrofijadoras que pudieran crecer en el halo.
das en la rizosfera de las variedades de Las características de las cepas estudiadas en el medio
caña de azúcar Ja60-5 y C120-78 RC coinciden con las descritas para cepas de
Azospirillum aisladas en el maíz (23).
En el microscopio de contraste de fase, se observa-
Actividad de reducción del acetileno (ARA). Las cepas
ron células en forma de bacilos cortos y medianos, con
aisladas demostraron su capacidad fijadora de nitrógeno
extremos puntiagudos y movimiento espiral. Al realizar la
in vitro. En la Tabla VI, se muestran los valores de activi-
tinción de Gram, resultaron Gram negativas.
dad nitrogenasa de las cepas aisladas, donde los valores
Las mayores poblaciones de Azospirillum spp. fue-
de reducción de acetileno medidos en los aislamientos
ron cuantificadas en los suelos Ferralíticos Rojo y Amari-
resultan estadísticamente superiores a los encontrados
llento de Ciego de Avila, sobre todo en la variedad Ja60-5.
en las cepas patrones de A. brasilense Sp7 y A. lipoferum
Además, en estos suelos se observó un mayor número
SpBr17, con excepción del aislamiento 88-I. Los valores
de raíces, con una estructura muy ramificada. Probable-
de reducción del acetileno obtenidos están en el rango de los
mente, la calidad y naturaleza de las sustancias
encontrados en aislamientos de Azospirillum spp.,
excretadas por esta variedad producen una mayor atrac-
Gluconacetobacter diazotrophicus y Herbaspirillum spp.
ción quimiotáctica sobre las bacterias del género
procedentes de caña de azúcar (24).
Juana Pérez y M. Casas
Tabla II. Resultados de la microscopía de contraste de fase de las cepas 8-I, 79-I y 11-I de Azospirillum spp.,
en comparación con las cepas patrones A. brasilense Sp7 (ATCC 29145), A. lipoferum SpBr17 (ATCC
29709) y A. amazonense Y6 (ATCC 35121) en el medio NFb semisólido
Características Cepas
8-I 79-I 11-I 88-I Sp7 SpBr17 Y6
Forma Bacilos gruesos, Bacilos Bacilos Bacilos Bacilos gruesos Bacilos Bacilos
simples o dobles alargados alargados alargados simples o dobles alargados delgados y
simples o dobles simples o dobles simples o dobles simples o dobles simples
Tamaño 1.0-1.3 µ m 1.0-1.2 µm 1.2-1.3 µm 1.0-1.2 µm 1.0-1.2 µm 1.0-1.5 µm 0.8-1.0 µm
Gram negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo
Gránulos si si si si si si si
Motilidad muy mótiles lenta mótiles mótiles muy mótiles lenta mótiles
Tabla III. Características macroscópicas determinadas en las colonias de las cepas de Azospirillum spp. 8-I,
79-I y 11-I en comparación con las cepas patrones A. brasilense Sp7 (ATCC 29145), A. lipoferum
SpBr17 (ATCC 29709) y A. amazonense Y6 (ATCC 35121) en los medios BMS y Rojo Congo
Medios de Características Cepas
cultivo 8I 79I 11I 88I Sp7 SpBr17 Y6
BMS Forma circular circular circular circular circular circular circular
Elevación plana plana plana plana plana plana convexa
Tamaño 4.0 mm 5.0 mm 5.0 mm 6.0 mm 5.0 mm 12.0 mm
Color rosada* blanca rosada* blanca Rosada* Rosada* beige
Superficie rugosa lisa rugosa rugosa rugosa lisa lisa
Borde entero entero entero entero entero entero entero
Detalles ópticos opaca brillosa opaca opaca opaca brillosa opaca
RC Forma circular circular circular circular circular circular circular
Elevación plana plana plana plana plana plana
Tamaño 5.0 mm 5.0 mm 5.0 mm 5.0 mm 5.0 mm 5.0 mm
Color roja roja roja roja roja roja
Superficie seca lisa seca seca seca seca
Borde entero entero entero entero entero entero
Detalles ópticos opaca opaca opaca opaca opaca opaca
*Colonias originalmente blancas, tornándose rosadas cuando envejece el cultivo
Tabla IV. Utilización de diferentes fuentes de carbo- Tabla V. Respuesta ante las pruebas bioquímicas de
no por las cepas de Azospirillum spp. 8-I, 79-I las cepas de Azospirillum spp. 8I, 79I y 11I,
y 11-I comparada con las cepas patrones en comparación con las cepas patrones
A. brasilense Sp7 (ATCC 29145), A. lipoferum A. brasilense Sp7 (ATCC 29145), A. lipoferum
SpBr17 (ATCC 29709) y A. amazonense Y6 SpBr17 (ATCC 29709) y A. amazonense Y6
(ATCC 35121) en el medio NFb semisólido (ATCC 35121) en el medio NFb semisólido
Fuentes de carbono 8I 11I 79I 88I Sp 7 Sp Br17 Y6 Pruebas Cepas
Fructosa + + + + + + - 8I 11I 79I 88I Sp7 SpBr17 Y6
Manitol ± ± ± - - Requerimiento de biotina + + ± - - + -
Sorbitol ± ± + - - - Hidrólisis de la gelatina - - - - - - -
Sacarosa ± - - - - - + Hidrólisis del almidón - - - - - - -
Lactosa - - - - - - Prueba de la oxidasa + ± + + + + +
Maltosa - - - - - - Prueba de la fosfatasa + - + + + + +
Celobiosa - - - - - - Prueba de la catalasa + + + + + + +
Rhamnosa - - - - - - + Reducción de NO3-NO2 + + + + + + ±
Succinato + + + + + + + Indol a partir de triptofano - - - - - - -
Malato + + + + + + +
Lactato + + + + + + + + Buena reacción, ± poco reactivas, - no reaccionan
Glicerol + + + + + + -
Citrato ± ± ± + ± + -
Glucosa ± + + - - + +
Malonato + + + -
Ketoglutarato. ± ± ± + - ±
Arabinosa - - - + ± + +
Galactosa - ± - + ± + +
Tabla VI. Actividad nitrogenasa de cuatro cepas En la Figura 3 (A, B, C y D), también se pueden
autóctonas de Azospirillum aisladas de observar los efectos de las cepas autóctonas de
la rizosfera de caña de azúcar en com- Azospirillum 8-I y 79-I sobre vitroplantas de caña de azú-
paración con las cepas patrones Sp7 car de la variedad Ja60-5. Todas las variables del creci-
(A. brasilense) y SpBr17 (A. lipoferum) miento evaluadas resultan estadísticamente superiores
al control no inoculado y a la cepa patrón Sp7 incluida
Cepas nmol C 2H 4 .h -1.mL -1
en este estudio.
8I 42.12 a
79I 42.12 a De manera general, la inoculación con las cepas de
11I 34.71 bc Azospirillum favoreció el crecimiento de las plantas de
88I 7.90 c caña de azúcar, siendo el peso fresco del tallo la variable
Sp7 37.08 b que mejor representó el efecto de la inoculación. La cepa
SpBr17 37.08 b
8I logró efectos mayores y más estables, lo cual se po-
Esx 1.7 ***
CV % 5.2 dría deber a que esta fue capaz de colonizar externa e
internamente las raíces de esta planta. Sin embargo, se
Efectos de la inoculación del Azospirillum sobre conoce que la cepa Sp7 no es capaz de colonizar inter-
vitroplantas de caña de azúcar. En la Figura 2 (A, B, C y D), namente las raíces de las plantas (7).
se observan los resultados de la inoculación de diferen- Al igual que en esta investigación, otros autores, al
tes cepas de Azospirillum sobre vitroplantas de caña de inocular vitroplantas de caña de azúcar con A. brasilense,
azúcar de las variedades Ja60-5 y C120-78. obtuvieron incrementos en los pesos seco y fresco del
Se aprecia una respuesta estimuladora altamente sistema radical, así como en el tamaño y volumen radical
significativa de la cepa de Azospirillum brasilense 8I so- de las plantas (5); resultados similares se obtuvieron al
bre todas las variables de crecimiento determinadas, funda- inocular vitroplantas de caña de azúcar con cepas de los
mentalmente en la variedad C120-78 (Figura 2A, B, C y D). géneros fijadores de nitrógeno Herbaspirillum sp. y
Los valores absolutos obtenidos en los pesos seco y fresco Gluconacetobacter diazotrophicus (25).
de las vitroplantas de caña de azúcar en la variedad Actualmente, las cepas aisladas y caracterizadas
Ja60-5 fueron superiores, pudiéndose observar la mayor forman parte de la colección de microorganismos de inte-
influencia de las cepas en las variables peso fresco de la rés económico del INICA y la cepa 8 INICA que resultó la
raíz (Figura 2C) y tallo (Figura 2D). La cepa 11-I mantuvo de mejores resultados está siendo empleada en la
un comportamiento similar al control no inoculado en la biofertilización de la caña de azúcar.
variedad C120-78, mientras que en la variedad Ja60-5,
sus valores fueron inferiores.
cepa 8I
A 0.04 Esx=0.006* B
Esx= 0.004 cepa 8I cepa 11I
0.035 a a
0.2 cepa 11I
0.03 control
control
Peso (g)
0.15 0.025 b
b b
peso (g)
0.02
0.1 0.015 b
0.01
0.05 0.005
0
0
Ja60-5 C120-78 Ja60-5 C120-78
0.3
Peso (g)
0.1 a
b b 0.2
bb
0.05 0.1
0
0 Ja60-5 C120-78
Ja60-5 C120-78
Letras distintas indican que las medias son diferentes (Tukey 0.05)
Figura 2. Efecto de la inoculación de las cepas de Azospirillum 8-I y 11-I sobre las variables de crecimiento
peso seco de la raíz (A), peso seco del tallo (B), peso fresco de la raíz (C) y peso fresco del tallo (D)
en 10 vitroplantas de caña de azúcar de las variedades Ja60-5 y C120-78
Juana Pérez y M. Casas
Esx=0.008* 0.03
Esx=0.004* B
0.03 A a a
cepa 8I a
Peso (g)
cepa 8I
Peso (g)
0.025 a cepa 79I b
0.02 cepa 79I
0.02 aa cepa Sp7 cepa Sp7
0.015 control control
b 0.01
0.01 c
0.005
0
0 Ja60-5
Ja60-5
0.3 Esx=0.06*
C D
0.13 Esx=0.025* 0.25 a cepa 8I
a
Peso (g)
Peso (g)
cepa 8I
a 0.2 cepa 79I
a cepa 79I
0.09 c b cepa Sp7
b cepa Sp7 0.15
control
c control 0.1
0.05
0.05
0.01 0
Ja60-5 Ja60-5
Letras distintas indican que las medias son diferentes (Tukey 0.05)
Figura 3. Efecto de la inoculación de las cepas de Azospirillum 8-I, 79-I y Sp7 sobre las variables de creci-
miento, peso seco de la raíz (A), peso seco del tallo (B), peso fresco de la raíz (C) y peso fresco del
tallo (D) en 10 vitroplantas de caña de azúcar de la variedad Ja60-5
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