PRACTICA N° 2

PREPARACIONES MICROSCÓPICAS PARA EL ESTUDIO DE LA CELULA

I. INTRODUCCIÓN.

Para observar los objetos a través del microscopio óptico compuesto, es necesario que a
partir de las diversas muestras biológicas se realicen diversas preparaciones, ya sea colocando
directamente sobre una lamina porta objetos y sobre ella otra laminilla de vidrio más delgada
(Cubre objetos) obteniéndose una preparación microscópica la que puede durar poco tiempo
(preparación temporal), o puede ser guardada (preparación permanente), sometiéndolo a otros
pasos entre ellos a una fijación y posteriormente una coloración; en tal sentido y dependiendo el
tipo de preparación a realizar existen dos clases de preparaciones en particular: preparaciones
en fresco (temporales) y en seco (permanentes).

II. OBJETIVO.

En esta práctica se darán los lineamientos generales para hacer preparaciones microscópicas,
siendo la finalidad de:

2.1. Realizar e interpretar una adecuada preparación microscópica para la observación

de objetos a través del microscopio.

III. MARCO TEÓRICO

3.1. OBTENCION DE PREPARADOS.

En microscopia, los preparados para las observaciones pueden ser de dos clases:

3.1.1. PREPARADO EN FRESCO

Son aquellos en que la sustancia examen no se encuentra fija a la lámina

portaobjeto, pero está sumergida en una sustancia líquida y se utiliza una laminilla cubre
objetos para la observación, la cual no existe ninguna sustancia entre el lente frontal del
objetivo y el preparado, excepto el aire. Esta clase de preparados se observan con
objetivos a seco y el microscopio en posición normal.

3. 1.2. PREPARADOS EN SECO

Son aquellos cuando la sustancia examen se encuentra fija en la lámina

portaobjetos y existe una sustancia entre el lente frontal del objetivo y el preparado
llamado aceite de cedro, el cual presenta un índice de refracción semejante al del vidrio.
La observación de estos preparados previamente coloreados se realiza con el objetivo de
inmersión. Este tipo de preparados se hacen por extensión o frotis, de acuerdo al
siguiente procedimiento:
* EXTENSION: Consiste en extender la sustancia examen en el portaobjetos del
modo mas uniforme y fino en el centro de la lámina. La lámina debe estar completamente
limpia y utilizando para la extensión otra lámina portaobjeto, una torunda, mondadientes o
un asa de koll.

* FROTIS: Consiste en expandir la sustancia examen en el portaobjetos. En el

tercio externo de la lámina se coloca la sustancia examen (sangre) y con el borde de otra
lámina colocada sobre la muestra y a un ángulo de 45° de la otra lámina permitir que la
sustancia se extienda en todo el borde de la lámina superior y deslizar esta hacia el otro
extremo mediante un movimiento rápido, tratando de obtener un frotis fino y uniforme.
* FIJACION: Es un proceso que sigue a una extensión o a un frotis, mediante el
cual se consigue adherir la sustancia fuertemente a la lámina portaobjetos. La fijación
tiene por finalidad mantener o conservar sus propios elementos estructurales, con la más
mínima alteración. Los fijadores más utilizados en los preparados en seco son: alcohol,
calor del mechero y el medio ambiente.

3.2. COLORANTES Y COLORACIONES

Luego de la fijación prosigue el proceso de la COLORACIÓN, el cuál consiste en la toma
de color de un cuerpo por acción de otro cuerpo o sustancia llamada COLORANTE. La
coloración supone que el cuerpo coloreado no va a perder su color con lavados de agua
o cualquier otro disolvente.

3.2.1. COLORANTES:

Son sustancias capaces de transmitir su color a otros cuerpos. Los colorantes son
compuestos orgánicos que contienen radicales cromóforos, que producen color, y grupos
de auxocromos que forman sales. Los grupos nitro (-NO 2) y azo (-N=N) son
cromóforos; los radicales hidróxido (-OH) y amino (-NH2), son grupos auxocromos. Los
radicales cromóforos imparten la propiedad cromógena al colorante y los grupos de
auxocromo permiten que el colorante se una con la fibra o tejido. Muchos de los
colorantes del comercio son sales; pero se les denomina colorantes básicos si la porción
coloreada actúa como base, o ácidos si actúa como ácido. Puede obtenerse colorantes
básicos en forma de sales de sodio. Los colorantes ácidos se emplean para teñir material
básico, ejemplo: citoplasma; en tanto que los colorantes básicos colorean el núcleo,
algunos gránulos de secreción y otras sustancias ácidas.

Los colorantes se clasifican de la siguiente manera:

A. POR SU ORIGEN: Naturales y artificiales.

 Naturales: Aquellos que se originan de elementos animales o vegetales, tales como:

carmín, azafrán, hematoxilina, orceina, etc.

 Artificiales: Llamados también sintéticos, son aquellos que se obtienen como

productos derivados de la destilación fraccionada de la hulla, generalmente se les
conoce con el nombre de anilina.
 POR SU AFINIDAD TINTOREA: Erlich los divide en colorantes ácidos, básicos y
neutros.
 Colorantes ácidos: Son aquellos que tienen afinidad especial por colorear el
citoplasma, por los que les llaman colorantes citoplasmáticos, los más usados son:
eosina, fucsina ácida, ácido pícrico, azul de anilina, etc.

 Colorantes básicos: Son aquellos que tienen afinidad especial por colorear la
cromatina nuclear, llamándoseles por esto colorantes nucleares. Entre los más
usados están: hematoxilina, azul de metileno, fucsina básica, violeta de genciana,
azul de toluidina, etc..
 Colorantes neutros: Son aquellos que en el momento de colorear se disocian en sus
partes ácida y básica, donde la primera colorea al citoplasma y la segunda al núcleo.
Los más usados son: Leishman, Giemsa, Wright's, May Grunwall, etc..
3.2.2. COLORACIONES

Es el proceso mediante el cuál un cuerpo toma color bajo la acción de otro

cuerpo o sustancia llamado "colorante" y que no se decolora con lavados de agua o
cualquier otra sustancia empleada como disolvente.

* PASOS GENERALES DE UNA COLORACION

Toda coloración debe seguir los siguientes pasos generales:

a. Extensión: En lámina porta-objeto con asa bacteriológica u otro instrumento. El asa

debe ser esterilizada al rojo en el mechero antes y después de su empleo.
 b. Fijación: Con el fin de adherir firmemente la preparación sobre la lámina. Se emplea
para este fin el calor suave o el alcohol éter ( cuando se trate de muestras serosas).
c. Tinción: Con el colorante o con el grupo de colorantes elegidos.
d. Lavado a chorro con agua corriente.
e. Secado: Mediante el calor suave o al aire a presión.
f. Observación: Esperar a que la lámina coloreada se seque si se va ha usar o utilizar el
objetivo de inmersión.

Existen varios tipos de coloraciones, siendo las más comúnmente empleadas: coloración
simple, coloración doble, coloración neutra, coloración diferencial (Gram, Ziehl Neelsen),
coloraciones especiales (Fontana Tribondeau, Feulgen, Maneval, Hematoxilina-Eosina, carbol
fucsina).

A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas en las que se usa un solo colorante. Ejemplo: coloración con azul de
metileno, Ziehl u otro colorante.

B. COLORACIONES COMPUESTAS
Son aquellas en que se emplean más de un colorante. La más común es la de Gram, que
fue creada por Christian Gram, estudiante Danés, entre 1884 y 1886. Es la tinción más
importante y utilizada en MICROBIOLOGIA para la observación de organismos procarióticos
como las BACTERIAS.

Un término utilizado en las coloraciones es el MORDIENTE, que se trata de productos

químicos utilizados a veces para facilitar la captación o retención de algunos colorantes. Por
ejemplo, un método de tinción conocida como hematoxilina férrica depende de que los cortes se
traten primeramente con una sal de hierro (que en este caso es un mordiente) y que se combina
sólo con algunas proteínas, más tarde el colorante se fija al hierro unido.

IV. PREPARACIONES MICROSCOPICAS

4.1. OBSERVACION DE GOTA DE AGUA ESTANCADA: Preparado en FRESCO.

OBJETIVO

Identificar microalgas presentes en gota de agua estancada.

MATERIAL Y REACTIVOS

 Agua estancada.
 Lámina cubre objeto.
 Lámina porta objeto.
 Gotero.
 Microscopio compuesto de luz convencional.
 Aceite de inmersión.

PROCEDIMIENTO

 Colocar una gota de agua estancada en la lámina porta objeto.

 Colocar en la plátina.
 Observar a diferentes aumentos hasta observar con claridad.
 Esquematizar.
4.2. OBSERVACION DE CELULAS EPITELIALES EN MUCOSA BUCAL: Coloración SIMPLE.
Preparado en SECO.

OBJETIVO

 Reconocer la organización estructural de la célula.

 Comprender la importancia del conocimiento de la célula, a través de las técnicas de
coloración.

FUNDAMENTO

Mientras el examen de las células vivientes ofrece pocos detalles morfológicos, con el método
de fijación y coloración el aspecto de las células es más complejo y variado. Además de las
estructuras que se observan in-vivo y que son más o menos modificadas por la fijación, se
hallan otras que antes no eran aparentes debido a la similitud de su índice de refracción con el
resto de la célula.

La interpretación de estos aspectos estructurales debe hacerse con prudencia, pero no con
excesivo escepticismo. Tanto el examen de las células vivientes como el de las células fijadas y
coloreadas, es indispensable para conocer mejor la estructura celular. Ambos métodos no se
excluyen, se complementan.

MATERIAL Y REACTIVOS

 Isopos.
 Laminas portaobjeto.
 Mechero de alcohol.
 Microscopio.
 Azúl de metileno
 Aceite de inmersión.

PROCEDIMIENTO

 Extensión o frotis (sustancia examen: Mucosa bucal)

 Fijación (Alcohol, calor, otros).
 Colorear: 1' a 5' (colorante ácido ó básico).
 Lavar en agua corriente.
 Secar al medio ambiente ó al calor moderado del mechero).
 Observar con objetivo de inmersión ó gran aumento.
 Esquematizar lo observado.

Figura 2. Células de la mucosa epitelial. 10X. Coloración simple. Azul de metileno.