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un fragmento de DNA
¿Para qué?
investigación básica:
función de la proteína
regulación de la expresión
análisis de complementación
aislamiento para estudios bioquímicos
mutagénesis in vitro
Estrategia general:
1.Generación del fragmento a clonar
2.Elección del vector
3.Ligación
4.Transferencia a la célula huesped
5.Selección de los recombinantes
1.Generación del fragmento a clonar
Extremos cohesivos
Extremos romos
2. Elección del vector de clonación
Tipos de vectores
Vector Cel. huesped Tamaño inserto
Virus bacteriano
(fago λ) Bacteria Hasta 25 kb
BAC (bacterial
artificial Bacteria 100-500 kb
chromosome)
YAC (yeast
artificial Levadura 250-1000 kb
chromosome)
PLASMIDOS
Son DNA circular (excepciones) de doble cadena que
existen en bacterias y en el núcleo de algunas células
eucarióticas. Se pueden replicar independientemente
de la célula hospedera. El tamaño de un plásmido
oscila entre unas pocas kilobases hasta 100 kb.
Propiedades deseables de un plasmido:
Pequeño
Secuencia conocida
Origen de replicación
formación de nuevos
puentes entre los extremos
5’-P y 3’-OH
Condiciones estándar:
vector 50 µg + fragmento 100-150 µg
FRAGMENTAR EL ADN
ADN con el gen de interés Vector
Sitio de corte
único
Moléculas
Fragmentos Moléculas del vector
de ADN del vector religado
no ligado no ligado
transformación bacteriana
crear “huecos” en pared y membrana
celular para que entre el DNA exógeno
electroporación
Transformación: CaCl2
Transformación: CaCl2
-- -- --
-- -- -- -- --
-- -- -- -- Ca Cl2
+ + +- -- + +
+
-- -- -- +
+ +
+ + -- -- --
+ + -- --
+ + -- -- --
Bacteria
+
-- -- -- +
+
-- -- + + --
-- -- -- + + -- --
+ + + + -- --
+ + + +
-- -- -- -- -- -- Plasmidos
-- --
-- -- --
Electroporación
DNA
PULSE
Sitio de
permeación
Transformación
Agrobacterium
por núcleo
Plásmido Ti
Agrobacterium inductor de tumores cromosom
contiene oncogenes
(genes onc)
A. tumefaciens causa
agallas en dicotile-
dóneas, presenta el
plásmido Ti, inserta cromosoma
parte de él en el
cromosoma de la célula
vegetal
célula huésped.
tumores
Ingeniero
genético natural Proliferación de
tras sutitución hormonas crecimiento.
de genes onc Se forman tumores en
por genes de las zonas de la lesión
interés
Biobalística
El DNA se suministra en
microproyectiles de tungsteno
que son disparados a las
células u organelos.
Microinyección directa de DNA
Inyección de DNA
directamente sobre
oocitos ó embriones
1
Transfección
ampicillin
ampicillin
Vectores de expresión
Vectores de clonación
especializados que:
•Incluye secuencias
regulatorias que estimulen la
expresión del gen
(transcripción y traducción)
• Mamíferos:
– Vectores de expresión viral (terapia génica):
• SV40
• Virus de vacunas
• Adenovirus
• Retrovirus
– Líneas celulares estables (CHO, HEK293)
Vectores de expresión
• Producen gran cantidad de proteína
• Mal plegamiento
Proteínas producidas en cultivos
de células eucariotas
Proteína Condición
1 2 3 4 5 6 7 8
11.5 KDa