TÉCNICAS DE SIEMBRA, TINCIÓN Y RECUENTO DE HONGOS

a
Departamento de Ingeniería Bioquímica, Universidad Icesi, Cali, Colombia

RESUMEN
En todo lo que nos rodea podemos encontrar microorganismos, estos pueden ser tan pequeños que
simplemente no son visibles a ojo humano, pero aportan a que organismos de mayor tamaño
continúen con su existencia, ya que hacen posible que se cumplen diversas funciones esenciales
permitiendo que se desarrolle la vida. Gracias a esto, es importante que podamos interpretar los
resultados de las diferentes morfologías, agrupaciones y métodos más comunes para diferenciar
entre bacterias y hongos. Las diferentes morfologías y agrupaciones que posee cada
microorganismo es una de las rutas utilizadas para este fin, además uno de los métodos que más se
utilizan es la tinción de Gram, es empleada para entender la estructura de los microorganismos, con
eso se puede dar una idea del tipo de microorganismo que es, un ejemplo de esto E. coli el cual
presenta una tinción Gram negativa mientras que Bacillus sp presenta una Gram positiva.

PALABRAS CLAVES: Recuento, microorganismos, aislamientos, medio de cultivo

INTRODUCCIÓN
Conocer la estructura y composición de un determinado microorganismo es de vital importancia
dado que al estar presente en nuestro ecosistema deberemos saber cómo se relaciona con el
hombre o como pueda tener un uso a nivel industrial. Muchos de estos microorganismos han podido
ser utilizados por el ser humanos en diferentes industrias para lograr generar productos de interés.
Estos pueden ser para la fermentación en la industria cervecera, vacunas que pueden significar el
avance en medicina, elaboración de alimentos, industria textil, entre otras (Cifuentes & Espinosa,
2008).

Aunque existan diferentes medios de cultivo, podemos agruparlos según su estado físico, en sólidos,
líquidos y semisólidos, pero también según su utilización. En práctica para hacer un aislamiento de
un cultivo de hongos es posible utilizar el agar Rosa Bengala o el Sabouraud, esto es posible ya que
estos solo permiten el crecimiento de hongos y esporas debido a que poseen cloranfenicol, un pH
neutro y altas concentraciones de glucosa (INSTRUCCIONES DE USO - Medios en placa listos para
usar, 2013).

Mientras que, para realizar cultivos de bacterias es posible utilizar agares como lo son: MRS,
MacConkey, Casoy, XLD, Almidón, Cetrimide y Leche. El agar MRS, el agar Casoy es un medio
enriquecido debido a que además de tener sustancias indispensables para el crecimiento del
microorganismo, el agar MacConkey es por su parte, un inhibidor, ya que inhibe el crecimiento de
bacterias Gram positivas pero no el inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas, el medio
XLD, el Cetrimide y el XLD son medios selectivos porque permiten el crecimiento de colonias de una
población polimicrobiana. Por último el agar de leche es un medio de cultivo enriquecido.

Las bacterias pueden clasificarse en Gram positivas o en Gram negativas dependiendo de la

composición de su pared celular. Las Gram negativas poseen una capa delgada de péptido glucano
y una membrana externa, mientras que las Gram positivas poseen una capa gruesa de péptido
glucano y carecen de membrana externa. La tinción de Gram es una técnica diferencial que permite
hacer la clasificación descrita anteriormente, para ello, la muestra es puesta en contacto con cristal
violeta, el cual tiene afinidad con el péptido glucano y tiñe la pared de color morado, después se
adiciona lugol para formar un complejo cristal violeta-yodo y así evitar la salida del cristal violeta.
Posteriormente se añade una mezcla alcohol-acetona la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra
sus poros. Las bacterias Gram positivas retienen el complejo cristal violeta-yodo debido a que
presentan en mayor proporción péptido glucano, mientras que las bacterias Gram negativas se
decoloran al no poseer gran cantidad de esta estructura. Finalmente, se añade safranina, el cual es
un colorante secundario, que tiñe de rosado las bacterias que se decoloraron previamente (Gram
negativas).

Por medio de esta práctica se busca reconocer las diferencias macroscópicas y microscópicas de las
bacterias y hongos. Para lo anterior es necesario conocer las diferentes técnicas de siembra y
aislamiento de estos microorganismos, utilizando cultivos enriquecidos, selectivos y diferenciales
para dicho fin.

MATERIALES Y MÉTODOS

1.1) Materiales: Para llevar cabo la siembra de las bacterias Staphylococcus aureus, E. coli,
Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis se utilizaron los agares Casoy, XLD, MacConkey,
MRS, Leche, Almidón, Cetrimide. Para la siembra por estrías se utilizó 90ml de caldo Casoy
esteril y una muestra de agua. Para realizar las fijaciones se utilizaron diferentes láminas,
mechero y para su tinción su utilizó el kit de tinción de Gram, Para las diluciones se utilizó
una micro pipeta de 1000μL y tubos de ensayo de 16x150. Finalmente, para realizar la
caracterización y observar los detalles es preciso contar con un microscopio.

1.1.1) Técnica de sedimentación: Se marcaron las cajas de los agares Casoy, MacConkey y
MRS con los nombres de los diferentes lugares en los cuales se dejarían abiertos
durante 30 min, transcurrido este tiempo, se incubo a una temperatura de 35°C ±
2°C durante 48 horas.

1.1.2) Recuento: Al pasar las 48 horas realizar el conteo de colonias obtenidas en los
diferentes medios, realizando además una observación macroscópica de estas,
reportando el número de colonias en UFC/30 min

1.1.3) Siembra por estrías en superficie: adicionar la muestra de agua en 90mL caldo de
Casoy estéril, incubar durante 30 min. Transcurrido este tiempo, sembrar por
agotamiento en los diferentes medios. Posteriormente, volver a incubar a 35°C ±
2°C durante 48 horas y realizar la descripción de las colonias obtenidas.

1.1.4) Métodos de tinción: Tinción de Gram

Se deben marcar las diferentes láminas con los nombres de los microorganismos,
adicionar una gota de agua destilada a la lámina portaobjetos y con un asa
desechable tomar una pequeña porción de la muestra del cultivo y homogenizarla
con el agua destilada de la lámina. Seguido a esto, dejar secar empleando un
mechero, adicionar 10 gotas de cristal violeta sobre la homogenización y dejar
actuar durante 1 min, retirar el exceso de colorante con agua destilada y agregar 10
 gotas de lugol sobre la homogenización, dejar actuar esperando por 1 min, después
retirar el exceso nuevamente con agua destilada, a continuación, adicionar 10 gotas
de Alcohol acetona y dejar actuar durante 30seg retirando el exceso posteriormente
con agua destilada. Finalmente, adicionar 10 gotas de Fucsina sobre la lámina y dejar
actuar durante 1 min, retirando con agua destilada, fijar la muestra a la lámina para
obsérvala con un microscopio y detallar sus características.

1.2) Materiales: Para llevar cabo la siembra de hongos en las muestras de cascara de naranja,
agua residual, hojas y manos se utilizaron los agares de Sabouraud con cloranfenicol y Rosa
de Bengala.

1.2.1) Técnica de sedimentación: Se marcaron las cajas de los agares Sabouraud con
Cloranfenicol y Agar Rosa de Bengala con los nombres de los diferentes lugares en los cuales
se dejarían abiertos durante 30 min, transcurrido este tiempo, se incubo a una temperatura
de 35°C ± 2°C desde 48 horas a 5 días.

1.2.2) Recuento: Al pasar las 48 horas realizar el conteo de colonias obtenidas en los
diferentes medios, realizando además una observación macroscópica de estas, reportando
el número de colonias en UFC/30 min

1.2.3) Técnica de dilución: adicionar la muestra de agua en 90mL de agua peptonada

0,1%(p/v) estéril, agitar y realiza diluciones 1/10 hasta tener una dilución de 10-5.

1.2.4) Siembra en superficie: Marcar las cajas Petri, tomar 0,1 ml de cada dilución y realizar
la siembra en cada agar, después de esto incubar a 28°C ± 2°C desde 48 horas a 5 días.

1.2.5) Recuento: Pasado este tiempo, observar las diferentes siembras y seleccionar las que
tengan un rango de colonias entre 25-250, reportar el número de colonias en UFC/gmL.

1.2.6) Recuento en cámara de Nuebauer: Con la ayuda de un capilar rellenar la cámara y

hacer el conteo de las células que se encuentren en los cinco cuadrantes principales,
después calcular el número de células.

1.2.7) Siembra por estrías en superficie: Realizar siembra masiva en ¼ de la caja agar de
Sabouraud y Rosa de Bengala, relizar siembra por agotamiento. Posteriormente, volver a
incubar a 35°C ± 2°C durante 48 horas y realizar la descripción de las colonias obtenidas.

1.2.8) Caracterización Microscópica de Mohos:

Con ayudad de una cinta, tomar una muestra ejerciendo presión sobre el cultivo, luego
presionarla contra una lámina previamente con azul de lactofenol en su superficie, realizar
la descripción microscópica de los cultivos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para la técnica de sedimentación se emplearon tres medios de cultivo y se dejaron expuestos al
medio ambiente durante 30 minutos dentro de un carro. Los resultados obtenidos en cada agar, es
decir, las características macroscópicas de las colonias, se describen a continuación en la Tabla 1.

Tabla 1. Descripción de las colonias de bacterias formadas en la técnica de sedimentación.

Sitio de exposición Carro
Agar Casoy Agar MacConkey Agar MRS
Se observa crecimiento de 4 No se observa crecimiento Se observa crecimiento de cinco
colonias. Una de ellas es de de microorganismos en colonias, tres de ellas con forma
forma filamentosa y de gran este medio de cultivo circular, de color blanco-
tamaño, mientras que las otras amarillento y con bordes
tres tienen forma circular con completos. Las otras dos colonias
bordes bien definidos presentan un color amarillo en el
(completos). De estas últimas, centro y un color más claro en los
dos presentan un color blanco bordes.
y la otra un color amarillo.

En el agar casoy se obtuvieron 4 colonias/30 min de exposición en el interior del carro, en el

MacConkey no se observó formación de colonias y por último, en el agar MRS se obtuvieron 5
colonias/30 min de exposición en el interior del carro. El análisis de estos resultados se presenta
más adelante, junto con los resultados de la técnica 2.

Para la segunda técnica de siembra y aislamiento, se extrajo una muestra de agua de un lago cerca
de la universidad y se realizó posteriormente un sembrado por estrías en superficie en siete medios
de cultivo distintos. Las características macroscópicas de las colonias de bacterias que crecieron en
dichos medios se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2. Descripción de las colonias de bacterias formadas en la técnica de aislamiento en medios

selectivos.
Nombre de la muestra Agua de lago
Agar MRS Agar MacConkey Agar Casoy Agar XLD
Se observan muy Se observan tres En este agar se observan No se observa
pocas colonias, tres en colonias pequeñas de más colonias, alrededor crecimiento
total. Todas son de un color rosado en el de 8, sin embargo la de ninguna
forma circular, con centro y sus bordes un mayoría tiene forma colonia
bordes completos y de poco blancos. Todas irregular, las otras son
color blanco cremoso. son de forma circular y circulares. Algunas tienen
Dos de ellas son más con bordes completos. bordes completos y otras,
grandes. ondulados.
Agar Almidón Agar Cetrimide Agar Leche
Se observa gran cantidad de Se observan unas cuantas En este agar se observaron colonias
colonias, principalmente de colonias de color amarillo, grandes de forma irregular y de
forma irregular, de color de forma circular y con color blanco, con bordes lobulados.
blanco, algunas con bordes bordes completos. No También se evidenció una colonia
ondulados y otros presentan fluorescencia al de color amarillo y de forma
lobulados. Se ven unas exponerlas a luz UV. rizoide, con bordes filamentosos.
cuantas de forma circular
con bordes enteros.
En lo reportado por Benavides (2007), el agar MacConkey posee sales biliares y cristal violeta, los
cuales inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas en el medio, y al tener lactosa en su
composición, está diseñado para distinguir entre las enterobacterias (bacterias Gram negativas)
capaces de fermentar la lactosa de las que no tienen esta capacidad, bacterias Lac+ y bacterias
Lac-, respectivamente.

Las bacterias Lac+ se caracterizan por formar colonias rosadas en este medio, debido a que producen
ácidos y disminuyen el pH de este, identificándolas con el rojo neutro (componente del agar).
Mientras que las bacterias Lac-, usaran la peptona del medio para convertirla en amoniaco,
incrementando su pH y produciendo colonias de color blanco.

En la técnica de siembra por sedimentación, no se evidenció crecimiento de colonias en este medio,

lo cual era lo esperado por ser una muestra del interior de un carro, puesto que este agar es selectivo
para bacterias que están presentes en los intestinos de seres vivos, en heces, en suelo, plantas, y en
algunos medios acuáticos. Por otro lado, en la técnica de siembra por estrías en superficie, se
encontraron tres colonias pequeñas de color rosa, lo que indica la presencia de bacterias Lac+,
posiblemente de los géneros Escherichia, Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter (coliformes), que
están presentes, como ya se mencionó, en ambientes húmedos y heces.

El agar XLD (xilosa, lisina, desoxicolato) es un medio de cultivo empleado para el aislamiento de los
géneros Salmonella y Shigella, las cuales forman colonias de color negro y de color rojo,
respectivamente, y si hay presencia de coliformes, estos formaran colonias de color amarillo (Zajc-
Satler & Gragas, 1977).

Nye et al (2002) reportaron en su estudio que el agar XLD fue uno de los menos eficientes para aislar
Salmonella sp, frente a otros medios de cultivo, como el agar DCA y el agar MLCB. En este estudio
no se encontró ningún tipo de colonia en el agar XLD, lo que quiere decir que posiblemente no
estaba presente este microorganismo en la muestra o que se encontraba en muy pequeñas
cantidades. Tampoco se evidenciaron coliformes, puesto que este medio es más selectivo para las
dos especies ya mencionadas, y además, como se observó en el agar MacConkey (selectivo para
coliformes) había muy poca presencia de estos microorganismos.

El agar almidón permite el aislamiento de microorganismos amilolíticos, es decir, productores de

amilasas, las cuales degradan el almidón en sus componentes simples. Después de que se produzca
el crecimiento de las colonias se agregan unas gotas de lugol al medio para identificar la presencia
de dichos microorganismos. Este reactivo interacciona con el almidón, tiñendo sus moléculas de
azul-café. Las colonias amilolíticas presentarán un halo alrededor de ellas, indicando en que sitios
se consumió el almidón.

En este estudio, se identificaron varias colonias de estas bacterias amilolíticas, que según Buitrago
et al (2014), puede tratarse de géneros como Bacillus, Pseudomonas, Aeromonas, Acinetobacter y
Streptomyces, encontrados en sus aislamientos realizados hace algunos años en humedales de
Bogotá.

El agar de cetrimide se emplea para el aislamiento de Pseudomonas aeruginosa, puesto que es un

medio de cultivo selectivo para esta especie. Esto se da porque los compuestos de amonio
cuaternario presentes en el medio, poseen propiedades antimicrobianas, inhibiendo el crecimiento
de bacterias, e incluso el de otras especies de Pseudomonas. Sin embargo, P. aeruginosa es
resistente a estos compuestos. Además, esta especie produce fluorosceína, lo que la hace fácil de
identificar bajo luz ultravioleta, y es la única conocida que produce un pigmento llamado piocianina,
de color verdoso (Brown & Lowbury, 1965).

En el estudio de Brown & Lowbury (1965) se emplearon dos variaciones del agar cetrimide para
realizar aislamientos de esta especie y determinar cuál de los dos era más productivo. En ambos
agares se encontró un buen crecimiento, y solo varió en la cantidad producida de cada pigmento.

Por el contrario, en el presente estudio, se encontraron colonias amarillas en el agar de cetrimide,

las cuales no mostraban fluorescencia bajo luz UV, indicándonos, estas dos características, que no
se trataba de colonias de P. aeruginosa. Claramente, la muestra contenía otros microorganismos
diferentes a esta especie y posiblemente el medio de cultivo no tenía la suficiente concentración de
compuestos de amonio cuaternario que inhibieran estos otros géneros de bacterias.

El agar leche permite aislar microorganismos con capacidad de hidrolizar proteínas, es decir que son
productores de proteasas. Este agar, al estar compuesto de leche, posee la proteína principal de
dicha sustancia, la Caseína, la cual le da su color blanco característico. Cuando esta proteína es
hidrolizada y consumida por las bacterias que producen tales enzimas, el agar leche pierde su color
y se evidencia un halo alrededor de las colonias de estas bacterias (Benavides, 2007).

En la presente práctica no se evidenció tal halo alrededor de las colonias formadas en el medio de
cultivo, indicando que estos microorganismos posiblemente no son productores de proteasas, sin
embargo, al ser un medio enriquecido, se da el crecimiento de otro tipo de microorganismos.

El agar MRS es un medio de cultivo selectivo para bacterias acido lácticas, especialmente del género
Lactobacillus. Esta selectividad se da por la acción de uno de sus componentes, el citrato de amonio,
el cual fomenta el crecimiento de especies del género Lactobacillus, mientras que inhibe el
crecimiento de otros microorganismos (de Man, Rogosa, & Sharpe, 1960).

En la técnica de siembra por sedimentación se evidenciaron unas cuantas colonias de color blanco,
lo que indica que posiblemente hay presencia de Lactobacillus sp en el interior del carro. Estos
microorganismos están presentes en el tracto gastrointestinal de animales, en suelos, agua,
productos lácteos, plantas y heces. La presencia de estos microorganismos en este ambiente puede
ser debida a contaminación del mismo, por medio de las diferentes personas que utilizan el carro.

En la segunda técnica de siembra, por estrías en superficie, se evidenciaron tres colonias pequeñas
en el medio de cultivo, lo que nos indica que en la muestra de agua hay presencia de este género
de bacterias ácido lácticas, que como ya se mencionó, están presentes en suelos y ambientes
acuáticos.

En otro procedimiento, se evaluaron algunas características, macroscópicas y microscópicas, de los

microorganismos proporcionados por el profesor. En la Tabla 3, se registra la morfología de las
colonias y la clasificación de las diferentes bacterias de acuerdo a la composición de su pared celular,
realizando para ello, la tinción de Gram; Las bacterias que presentaron una tinción rosada fueron E.
coli y Klebsiella, evidenciando así, que son bacterias Gram negativas. Por el contrario, Bacillus y S.
aureus presentaron una tinción morada, por lo tanto, son bacterias Gram positivas
Tabla 3. Características macroscópicas y microscópicas de aislamientos de microorganismos
provistos por el profesor.
Microorganismo Morfología de las colonias Tinción de gram
Agar XLD: colonias amarillas,
circulares y planas
Escherichia coli Agar casoy: colonias blancas Bacilos gram negativos
Agar MacConkey: colonias
anaranjadas
En los tres agares, casoy,
almidón y leche, las colonias
Bacillus Bacilos gram positivos
presentaron forma circular y
color blanco
No se puede diferenciar las
Klebsiella Bacilos gram negativos
colonias
No se puede diferenciar las Cocos gram positivos
Staphylococcus aureus
colonias agrupados en racimos

Estos microorganismos evaluados son patógenos, por lo que es de gran interés conocer la
composición de su pared celular y otras estructuras externas, las cuales les dan soporte e integridad
a la bacteria. Es decir, si conocemos el tipo de pared celular podemos buscar un antibiótico
específico que ataque los componentes de ella, ingrese a la célula y provoque finalmente la muerte
del microorganismo. Así antibióticos como eritromicina, lincomicina y vancomicina atacan la pared
de bacterias Gram positivas, mientras que estreptomicina, gentamicina y norfloxacina atacan la
pared de bacterias Gram negativas (Hernández, 2002).

Por otra parte, el análisis de la morfología de colonias depende mucho de una buena técnica de
aislamiento por estrías en superficie. Sin embargo, las muestras de S. aureus y klebsiella tuvieron
una mala técnica de aislamiento y por ende no se pudieron diferenciar las colonias ni hacer una
descripción morfológica de ellas; por el contrario, en las muestras de E. coli y Bacillus se pudo
evidenciar claramente la morfología de las colonias. Esta morfología depende mucho del medio de
cultivo, ya que en cada uno de ellos se presentan nutrientes específicos que hacen que las bacterias
crezcan y modifiquen el agar de manera específica.

Pasando ahora a la práctica de cultivos de hongos, se realizó una técnica similar, en donde se
expusieron dos medios de cultivo (agar Sabouraud y agar Rosa-Bengala) durante 30 minutos en un
ambiente interior, específicamente, la sala de una casa y cerca de plantas. En la Tabla 4 se registra
la descripción macroscópica y microscópica de esta muestra.

Este ambiente generó que crecieran diferentes hongos que forman parte de nuestro hogar y
conviven con nosotros. Según la literatura, algunos de estos hongos son inofensivos, tales como
Saccharomyces cerevisiae y los del género Penicillium, que a su vez tienen gran importancia
industrial. S. cerevisiae es un levadura y se utiliza para la fabricación de pan, cerveza, vino,
biocombustible, y productos farmacéuticos a base de glicerol (Tortora, Funke, & Case, 2007); Los
hongos del género Penicillium son usados en la industria farmacéutica para la producción de
penicilina.
Por otro lado, hay hongos que pueden causar alergias cuando están expuestos a ambientes
húmedos como Alternaria, Cladosporium, Aspergillus, Helmin thosporium, Epicoccum, Fusarium y
Mucor. Estos microrganismos son causantes de rinitis, secreción y congestión nasal, resecación de
la piel y picazón en ojos, nariz y garganta (Centers for Disease Control and Prevention, 2003).

Tabla 4. Descripción de las colonias de hongos formadas en la técnica de sedimentación

Sitio de exposición
Agar Rosa de Bengala
Se observa crecimiento de 2
colonias: una es pequeña,
de forma circular y color
anaranjado.
La otra es de mayor
tamaño, con forma y
bordes filamentosos y es
de color blanco.
Sala de la casa
Agar Sabouraud con Cloranfenicol MICROSCOPIA
Se observa crecimiento de ocho - Mucorales: Hifas gruesas y
colonias, tres de ellas de color aseptadas, esporangios
negro, forma circular y gran - Alternaria: Hifas septadas
tamaño. Otras tres colonias dematiáceas, conidióforos
presentan forma irregular, tamaño septados de color café.
variado, de color amarillento y una
pequeña porción de color rosado.
Otra colonia presenta forma
circular, color anaranjado y el
centro negro. La última colonia
tiene forma filamentosa, es de
tamaño mediano y de color blanco.

Al comparar la literatura de los hongos comunes en el hogar con los recogidos en el cultivo o agar,
hubo similitud ya que, al realizar la prueba microscópica de estos, se obtuvieron microrganismos del
género Alternaria, y Geotrichum la presencia de este hongo se puedo dar por la cercanía a tierra y
material vegetal (plantas) (Tangarife, 2016). Además se observaron hongos de orden mucoral, y se
podría decir que son del género Mucor ya que estos presentan Hifas gruesas, septadas y esporangios
con esporangiosporas redondas, (Tangarife, 2016) estas características morfológicas fueron
similares a las observadas al realizar la prueba microscópica; los microrganismos pertenecientes a
este orden pueden causar enfermedades como mucormicosis a pacientes diabéticos e
inmunocomprometidos y se puede encontrar en ambientes como el suelo, en materiales en
descomposición, en el aire y pan, (Cabello, 2007) es por esto que es posible encontrarlos en
ambientes interiores que poseen los recursos adecuados para su crecimiento.

Tabla 5. Recuento de células en la suspensión de esporas y en la suspensión de levaduras de los

grupos de laboratorio.
Suspensión de Suspensión expresada Suspensión de Suspensión expresada
esporas (células/ml) en log levaduras (células/ml) en log
3,9x107 7,59106 2,3x107 7,36172
4 5
1,4x10 4,14613 1,7x10 5,23044
1,8x106 6,25527 5,6x106 6,74818
6 6
5x10 6,69897 7,5x10 6,87506
7,3x108 8,86332 2,3x107 7,36172
8 7
1,3x10 8,11394 7,4x10 7,86923
3,6x106 6,55630 1x109 9
Promedio:
∑𝑥
𝑋= 𝑛
(1)

X: Promedio
x: conjunto de observaciones
n: Número de observaciones

- Suspensión de Esporas = 6,8892

- Suspensión de levaduras = 7,2

Desviación estándar:

1
𝑆 = √𝑛−1 ∑𝑛𝑖=1(𝑥 − 𝑋)2 (2)

S: desviación estándar
X: Promedio
x: conjunto de observaciones
n: Número de observaciones

- Suspensión de Esporas = 1,5255

- Suspensión de levaduras = 1,1495

Coeficiente de variación
𝑆
𝐶𝑉 = 𝑋
∗ 100 (3)

CV: Coeficiente de variación

S: desviación estándar
X: Promedio

- Suspensión de Esporas = 22,14%

- Suspensión de levaduras = 15,96%

Gracias a estos coeficientes de variación se puede concluir que los datos obtenidos del
recuento en cámara de Nuebauer están dispersos en todo el grupo dado que el crecimiento
se realizó en una forma masiva con lo cual se pudo interpretar utilizando el log en base 10.
Estos datos no son aceptables dado que al tener un 22,14% en suspensión de esporas y un
15.96% en suspensión de levaduras, se puede decir que no es precisa.

Tabla 6. Descripción macroscópica y microscópica de las colonias de hongos formadas en las

muestras empleadas.
Origen de la muestra Descripción macroscópica Descripción microscópica
 Agar SAB RB SAB RB
Estructura fibrosa Número variado Se observan filamentos
sobre el agra de de colonias de tubulares, entrelazados y
color blanco, la color blanco que de color azul
Hoja de árbol cual presente en parecen algodón
el centro unas
coloraciones
oscuras
Base como un Base como un conidios de
algodón, algodón, color café,
pigmentación crecieron en con hifas que
Cascara de naranja amarilla con menor cantidad, presentan
colonias de un presentan una división
color negro colonias de un
color negro
Estructura Estructura
semejante al semejante al
sarro, de color sarro, de color
Manos NO SE REALIZÓ
blando con zonas blando pero con
un poco más zonas más
oscuras aglomeradas
Dos colonias Una colonia de Hifas las
separas, de color color blanco, de cuales no
blanco, se observa menor tamaño presentan
una estructura que las división y
Agua residual como de un encontradas en el además se
algodón agar SAB observan
esporas de
un color
gris oscuro.

Los posibles géneros asociados a la hoja de árbol detectados en la muestra son Alternaría y Mucoral,
debido a que en gran parte se pueden encontrar en el ambiente y por ende en plantas. Alternaria
tiene la capacidad de producir micotoxinas las cuales son capaces de contaminar alimentos o
materias primas originando así enfermedades o transtornos denominados micotoxicosis, también
son mohos causantes de gripas y están presentes en la aparición de infecciones en personas
inmunodeficientes (Pavón, González, Martín, & García, 2012).

Por otro lado, los hongos extraídos de la cascara de naranja crecieron abundantemente en los medio
de cultivo y presentaron diferentes morfologías (tabla 6), en la muestra de cascara de naranja se
observa un hongo de color verde (figura 1), al consultar en la literatura los hongos más comunes
presentes en cíclicos son Penicillium digitatum y penicillium italicum, y causan moho verde y moho
azul respectivamente (Zimmermann, 2018), por lo tanto se podría afirmar que el hongo presente en
la naranja es del género Penicillium; sin embargo al hacer la caracterización microscópica se
evidencia que el hongo presente es Aspergillus, este microorganismo provoca podredumbre en
cítricos post cosecha, y las cepas utilizadas en industrias pueden causar alergias por inhalación
produciendo aspergilosis; a pesar de esto el hongo A. niger tiene gran importancia industrial, este
utilizado para producción de ácido cítrico, ácido glucónico y enzimas como celulasa, invertasa,
amiloglucosidasa, amilasa, lactasa, proteasa ácida y pectinasa. (Devaney, 2018). Otros hongos que
se pueden encontrar en la cascara son Alternaria citri, Botrytis cinérea, Geotrichum candidum,
Phytophthora citrophthora, Phomopsis, Diplodia, Rhizopus nigricans, Trichotecium roseum,
Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Cladosporium herbarum y Trichoderma,
(www.tecnicoagricola.es, 2012) sin embargo estos hongos no se presentaron en la muestra.

Figura 2. Crecimiento de hongo en mandarina

En la muestra de agua estancada, crecieron diferentes colonias de hongos, la morfología se registra

en la tabla 6, sin embargo, al realizar la microscopia no se pudo identificar géneros de hongos
específicos. Según la literatura los hongos en sistemas acuícolas están presenten de forma natural
(Rocha, Lozano, & Ygnasio, 2006), entre los más comunes se encuentran géneros como Escherichia,
Salmonella, Pseudomonas, Aeromonas, Serratia, Nocardia y Spirochaeta, estos microorganismos
son de origen fecal o están implicados en procesos de biodegradación. (Galvin, 2003)

Al analizar los cultivos de hongos en las hojas se observaron diferentes colonias, las cuales se
describen en la (tabla 6); Los posibles géneros asociados a la hoja de árbol que podrían estar en la
muestra son Alternaría y Mucoral, debido a que en gran parte de estos microorganismos se pueden
encontrar en el medio ambiente y por ende en plantas. Alternaria tiene la capacidad de producir
micotoxinas las cuales son capaces de contaminar alimentos o materias primas originando así
enfermedades o trastornos denominados micotoxicosis, también son mohos causantes de gripas y
están presentes en la aparición de infecciones en personas inmunodeficientes (Pavón, González,
Martín, & García, 2012).

CONCLUSIONES
A partir de los resultados obtenidos en la tinción de Gram se puede comparar las diferentes
estructuras que componen la pared celular de las bacterias, E. coli y Klebsiella son bacterias Gram
positivas por lo que presentan una pared celular con gran porcentaje de péptido glucano, mientras
que, Bacillus y S. aureus son bacterias Gram negativas es decir presentan una pared celular
compuesta de membrana externa y en menor cantidad por peptidoglicano.

Las técnicas macroscópicas y microscópicas hicieron posible la diferenciación de bacterias y hongos,

en el caso de las bacterias la técnica de aislamiento permitió describir morfológicamente las colonias
y con esto se puede concluir que el medio de cultivo influye en la morfología colonial de las
bacterias, esto debido a que cada medio tiene componentes nutricionales diferentes.
Por otro lado, se evidencio la presencia de hongos y levaduras en ambientes comunes, algunos de
estos microorganismos son patógenos o pueden producir infecciones como Alternaría y Mucor,
mientras que otros conviven con nosotros sin generar ningún daño, y por el contrario son
microorganismos de gran importancia biotecnología, como A. niger, S. cerevisiae, Penicillium sp y E.
coli.

A partir de los resultados obtenidos al realizar el recuento de células en hongos se puede evidenciar
que la levadura crece más rápido que la suspensión de esporas.

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