Grupo laboratorio de Microbiología, Programa de Ingeniería Agroindustrial, Escuela de

ingeniería en ciencias agrícolas, Facultad de ciencias agropecuarias y recursos naturales,

Universidad de los Llanos. Vereda Barcelona. Villavicencio, Colombia.

TÉCNICAS PARA EL AISLAMIENTO DE

MICROORGANISMOS & OBSERVACIÓN
MICROSCOPICA DE BACTERIAS
Laura Katherin BG 117003907; Sebastian Steven BJ 117003905; Gabriela Maite CM 117003913; Yeison
BR 117003906.
Facultad de ciencias agropecuarias y recursos naturales.
Ingeniería agroindustrial

RESUMEN
En la práctica se transfirió una muestra microbiológica conocida a un medio de cultivo, lo que permitió
obtener colonias aisladas. La aplicación de diversos procedimientos al realizar la practica determinan la
efectividad a la hora del conteo bacteriano y así mismo obtener cultivos puros (los cultivos puros existen
de manera artificial y se obtienen en el laboratorio, son aquellos donde solo hay una clase de
microorganismo presente) facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de
estos. Para la apreciación de algunas características físicas y morfológicas de las bacterias que se cultivaron
en la práctica se hizo una tinción de Gram y movimiento bacteriano para los Bacillus sp con contraste
cromático de las endosporas para los Bacillus sp; se dedujo de la observación de tinción de Gram que los
bacilos presentan coloración de Gram.
Palabras clave: aislamiento microbiano, cultivos puros, tinción.

ABSTRACT
In the practice transfire a microbiological sample known to a way of culture, which was allowed to obtain
isolated colonies. The application of diverse procedures on having realized the practice they determine the
efficiency at the moment of the bacterial count and likewise to obtain pure cultures (the pure cultures exist
in an artificial way and are obtained in the laboratory, are those alone where there is a class of present
microorganism) facilitating thus, the study, characterization, application and control of these. For the
appraisal of some physical and morphologic characteristics of the bacteria that were cultivated in the
practice Gram's tint and bacterial movement was done for the Bacillus sp by chromatic contrast of the
endosporas for the Bacillus sp; dedujo of the observation of Gram's tint that the bacilli present Gram's
coloration
Key words: Microbial isolation, pure cultures, tint.

1. INTRODUCCIÓN. área de trabajo, existen muchos otros

Para el aislamiento de los microrganismos se han
efectuado diferentes técnicas que permiten
cultivarlos de manera artificial y obtener colonias de
bacterias en cultivo puro o axénico. Un cultivo
axénico consiste en una sola especie microbiana,
proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos
son muy raros en la naturaleza. En los medios
naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el
cuerpo humano existen cultivos mixtos. En un
cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de
forma conjunta. Este cultivo se obtiene
artificialmente en un laboratorio, al efectuar estos
procedimientos, es necesario considerar que, en el
microorganismos; debido a esto, es necesario tomar
precauciones para impedir que éstos penetren y
contaminen los cultivos en estudio.
El segundo paso para obtener un cultivo axénico es
inocular o introducir, una sola célula de un
microorganismo en un medio sólido o líquido,
esterilizado previamente. De esta manera, aislamos
un solo microorganismo del resto y se podrá
multiplicar en condiciones favorables.
Los métodos utilizados en la práctica fueron:
siembra en superficie consiste en la siembra de un
volumen conocido de la dilución de la muestra sobre
la superficie de un medio de cultivo en la caja de
 Petri. En este método todas las colonias crecen sobre
la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta
técnica para el recuento de bacterias aerobias.
El otro método es siembra en profundidad consiste
en añadir medio de cultivo fundido sobre caja de
Petri que contiene una cantidad determinada de la
muestra diluida. Se tapa la caja y se rota para mezclar
la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se
incuban las cajas. Las colonias se desarrollan tanto
dentro del agar como en la superficie. Es un método
generalmente utilizado para el recuento de
microorganismos anaerobios facultativos o
microaerófilo
Para observar la movilidad de las bacterias se tomó
un asa y se extendiendo la bacteria por todo el
portaobjetos, después se fijó con calor muy
cuidadosamente de no matar el microrganismo, por
último, se llevó al microscopio a 100x con aceite de
inmersión.
Para la observación de la forma y la identificación
diversas estructuras celulares y tipo de las bacterias
que se cultivaron se hicieron tres tipos de tinciones:
 Tinción negativa o tinta china para capsula.
 Tinción de Gram
 Tinción de endosporas
2. MATERIALES/ METODOS
2.1.TÉCNICAS PARA EL AISLAMIENTO
DE MICROORGANISMOS
MATERIALES
Cajas usadas: 2 cajas de King B, 2 cajas de Agar
Nutritivo por grupo, 2 cajas de PDA, cajas de Petri
con microorganismos obtenidos en la práctica
anterior
 1 muestra de suelo de 10 gr por grupo: Se tomó
una muestra del suelo húmeda en la vereda
Barcelona/Meta a las 11:02 a.m. sobre un pedazo de
papel aluminio
 5 tubos de ensayo con 9 ml de agua estéril cada
uno: Se usaron cinco tubos de ensayo debidamente
esterilizados con aproximadamente 9ml de agua
estéril.
 Erlenmeyer de 100 ml, con 90 ml de agua
destilada: Se tuvo un Erlenmeyer de 100ml con 90ml
de agua destilada aproximadamente.
 4 pipetas Pasteur estériles: Se usaron 4 pipetas
Pasteur esterilizadas para añadir la disolución de la
muestra en cada tubo de ensayo evitando la
contaminación
 Asas bacteriológicas curvas y rectas: Se usó un
asa bacteriológica curva para tomar muestras de los
microorganismos ya sembrados, esterilizándola al
someter al fuego.
 Perlas de vidrio por grupo: Se usaron 4 perlas
de vidrio esterilizadas para así esparcir la muestra de
suelo tomada (4 perlas por cada caja de Petri),
haciendo un movimiento en ocho.
 Papel absorbente: Se usó papel absorbente
Scott para la limpieza de los mesones con alcohol
70% y para soporte de los materiales esterilizados
evitando el contacto directo con el mesón.
 1 gradilla para tubos de ensayo: Se usó una
gradilla para el soporte de los 5 tubos de ensayo
usados para la toma de muestra del suelo.
 Marcador de vidrio: Se usó un marcador
Sharpie color negro para marcar las cajas de Petri
con las muestras de suelo y de los microorganismos
anteriormente sembrados.
 Alcohol 70 % para desinfectar mesones: Se usó
alcohol al 70% para la esterilización del mesón,
esparciéndolo y limpiando debidamente con papel
absorbente.
 Pipeteador: Se usó un pipeteador para trasvasar
las muestras de suelo a las cajas de Petri.
 Encendedor: Se usó un encendedor para dar
llama al mechero usado en la esterilización del asa
curva.
Equipos para incubación, esterilización y para pesar:
Incubadora, autoclave, balanza electrónica
METODOS
Aislamiento de microorganismos por agotamiento y
punción. Se desinfecto el mesón con alcohol 70%, se
marcaron las cajas de Petri con el nombre del medio,
código del estudiante y fecha, luego se sembró el
agar nutritivo por la técnica de estriado, se incubo
24-48 horas a 25ºC, luego se sembró por la técnica
de punción muestras de la caja de hongos sembrada
en la práctica anterior, incubándolo también entre
24-48 horas a 25ºC viendo así un crecimiento
descrito macroscópicamente. Luego se realizó la
misma observación con el agar PDA.
Aislamiento de microorganismos por dilución.
Se tomó una muestra de 10 gr de suelo, la cual se
disolvió en 90ml de agua estéril, luego se tomó 1ml
agregándolo a un tubo de ensayo con 9ml de agua
estéril marcada con 10-1 (esto hasta llegar a la
disolución de 10-4). La disolución 10-3 fue
sembrada en agar King B con 0.1ml de suspensión
siendo esparcido con perlas de vidrio con ayuda del
movimiento de la caja sobre la mesa, luego se
desecharon las perlas y se incubo la caja entre 24-48
horas a 35°C para así hacer el conteo de colonias,
para afirmar la presencia de Pseudomonas
fluorescens se hizo en presencia de luz, presentando
pigmentos fluorescentes, después se realizó el
conteo de colonias, descripción macroscópica.
El mismo procedimiento del punto anterior, pero con
tinta china la cual se dejó secar al ambiente, luego
observado al microscopio en 100X
Tinción de Gram Realice un frotis y fíjelo con calor.
Primero se adiciono cristal violeta por 1 minuto,
luego se lavó. Al igual que con el Lugol, luego con
alcohol acetona y por último con fucsina, Se observó
en 100X
3. RESULTADOS

2.2.OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE
BACTERIAS

MATERIALES.
Cajas usadas: Caja de Petri con cultivos puro de
Bacillus sp, con E.coli, Klebsiella sp,
Staphylococcus sp.
Cubeta para coloración de Gram: Usada para las
tinciones y evitar manchar los mesones
Papel absorbente: Se usó papel absorbente Scott para
la limpieza de los mesones con alcohol 70% y para Figura No. 1. Resultado de la siembra en superficie
soporte de los materiales esterilizados evitando el de la dilución 10-4 en PDA
contacto directo con el mesón.
Asas redondas: Se usó un asa redonda para tomar
muestras de los microorganismos ya sembrados,
esterilizándola al someter al fuego.
Mecheros: Se usó para esterilizar el asa antes de
poner cada muestra en su respectivo portaobjeto.
Laminas porta objetos: Se usaron laminas
portaobjetos en los cuales se puso una gota de agua
con una muestra de los resultados de la incubación
de los microrganismos del suelo y hongos y
bacterias. Para las tinciones: Colorantes de Gram,
verde malaquita, tinta china, tubos con agua estéril.

METODOS
Montaje en fresco. Observación de movilidad.
Sobre un portaobjetos limpio se agregó una gota de
Figura No.2. resultado de la siembra en superficie,
agua destilada estéril con una porción del
dilución 10-5 en AN
microorganismo presente en la caja de Petri con un
asa flameada previamente. Luego se hizo su
observación en el microscopio a 100X
Tinción de endosporas.
Se realizó el frotis del microorganismo Bacillus sp
en un portaobjetos, fijándolo con calor, adicionando
posteriormente verde de malaquita, luego se secó a
la llama del mechero, luego se lavó con agua y luego
se observó al microscopio con el objetivo 100X
Tinción negativa o Tinta china para capsula.

Figura No 3. Resultados de la observación de la
tinción de endosporas.
Figura No. 4. Resultados de la observación de
bacilos por medio de la tinción Gram.
4. ANALISIS DE RESULTADOS
Tinción Gram positivas y negativas
La determinación de la movilidad bacteriana es uno
de los parámetros que se utiliza en la identificación
de bacterias. Esta capacidad usualmente se debe a la
presencia de flagelos, la movilidad bacteriana
capacita a la célula para alcanzar deferentes regiones
en su microambiente lo que representa una ventaja
(Pírez M., 2008).
El movimiento usual debido a la presencia de
flagelos se puede determinar al microscopio con una
preparación en fresco como se hizo en esta caso, es
importante diferenciar el movimiento traslatorio de
las bacterias del movimiento browniano que es el
movimiento vibratorio, originado por choque de las
moléculas del líquido contra las bacterias, que
provocan vibraciones sin desplazamiento; en este
caso la preparación a fresco constituye el método
más simple y rápido de determinar movilidad de
microorganismos (Pedro García Martos, 1994).
Las bacterias con forma de barras o varillas son
llamadas bacilos. En este caso la Figura No. 5
Clasificación de bacilos según su forma, se muestra
ubicación de bacilos en diferentes formas desde
bacilos simples hasta estreptobacilos, con extremos
de forma redonda y aguda en diferentes casos.
Figura No. 5 Clasificación de bacilos según su
forma.
En el desarrollo de las dos practicas se realizó la
siembra en superficie de una muestra de tierra
(10.678 g) disuelta en agua peptona, y se llevó un
procedimiento de dilución de la muestra. Se realizó
dos siembras por cada una de las diluciones
presentes (10-3, 10-4 y 10-5), intentando con esto
realizar un aislamiento con una proporción mayor y
finalmente un conteo de las colonias presentes en
cada una de las siembras, donde se seleccionaron
solo las diluciones 10-4 y 10-5 para la observación de
microrganismo en el microscopio. En la dilución 10-
4
, se pudo encontrar aproximadamente en promedio
más de 70x104 UFC/g, así demostrando la
efectividad que tiene la siembra en superficie en el
momento de las diluciones, ya que me disminuyen
las unidades formadoras de colonias en cada una de
ellas, esto se puede observar en la Figura No. 1.
Resultado de la siembra en superficie de la dilución
10-4 en PDA.
En la dilución 10-5, se pudo identificar más de 5x105
UFC/g y aproximadamente 3S, indicando de igual
manera la eficiencia que tiene la dilución ya que las
unidades formadoras de colonias se redujeron en una
proporción de aproximadamente de 2x105,
demostrando una reducción de estas unidades, esto
se puede observar Figura No.2. resultado de la
siembra en superficie, dilución 10-5 en AN.
Seguidamente, se realizó la extracción de las
muestras para cada una de las observaciones
realizadas en la práctica, las de GRAM (positivas y
negativas) y las de endosporas. En la tinción GRAM,
es una tinción de las más utilizadas en los
laboratorios de bacteriología, y permite de acuerdo
con la estructura y grosor de la pared bacteriana
agrupar las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas (Pírez M., 2008), por lo tanto en estas dos
practicas se realizó la siembra en superficie de una
muestra de tierra (10.678 g) disuelta en agua
peptona, y se llevó un procedimiento de dilución de
la muestra. Se realizó dos siembras por cada una de
las diluciones presentes (10-3, 10-4 y 10-5), intentando
con esto realizar un aislamiento con una proporción
mayor y finalmente un conteo de las colonias
presentes en cada una de las siembras, donde se pudo
determinar una gran cantidad de predominación de
GRAM positivas y en una pequeña proporción
GRAM negativas, estos resultados pudieron ser
alterados por el mal procedimiento en la tinción o
por un error humano. Esto se puede observar en la
Figura No. 6. Resultados de la observación de
bacilos por medio de la tinción Gram.
Además de una excesiva decoloración la edad del
cultivo influye en que las bacterias GRAM positivas
se observen total o parcialmente rosadas, debe
prestarse atención también a los lavados que se
realizan puesto que si se dejan excesos de agua se
puede presentar una dilución de los colorantes o
diferentes reactivos en este caso el yoduro.
Tinción de Endosporas
Las endosporas son formas de resistencia altamente
deshidratadas y con una serie de cubiertas muy poco
permeables, esto hace que sean difíciles de teñir,
excepto si se calienta la preparación para
permeabilizarlas (Pírez M., 2008), es por eso que se
flamea la muestra después de ser aplicado el
colorante.
Las endosporas bacterianas son muy resistentes a
procedimientos tinto riales usuales, la aplicación de
un solo colorante a una célula bacteriana que
contiene una endosporas, solo tiñe la célula, pero la
espora se mantiene incolora, para lograr aplicar
colorante dentro de la endosporas es necesario como
se mencionó anteriormente aplicar calor al medio
(Pedro García Martos, 1994).
En este caso se utilizó verde malaquita como
colorante primario el cual es eliminado del resto de
la célula por medio de un enjuague, pero no de la
espora.
Existen otros métodos de tinción de endosporas, uno
de los más conocidos es el método de schaeffer y
fulton, en el que el proceso se realiza de la misma
forma, pero el finalizar la coloración verde
malaquita se emplea safranina para teñir el resto de
la célula (Alarcón, 2001).
Es evidenciable que en la Figura No 3. Resultados
de la observación de la tinción de endosporas, no
proporciona una vista clara de las características de
las bacterias, sin embargo, al ser vistas
experimentalmente se concluyó le presencia de
bacilos en forma empalizada inmóviles con
extremos redondos y angulares en diferentes casos,
se presentan en poca cantidad estreptobacilos con la
mismas características y gran cantidad de esporas en
forma fusiliforme y oblonga.
5. CONCLUSIONES
 Se puede concluir que la preparación en fresco no
permite aumentar el contraste de la preparación
sin embargo la ventaja que tiene es que también
es útil para observar la movilidad de las bacterias.
 La preparación en fresco nos ayudó a observar la
morfología de las bacterias, aunque con un poco
más de trabajo y sin una clara distinción de la
forma que se apreciaba.
 La gruesa pared celular de las bacterias Gram
positivas está constituida principalmente por
peptidoglicano. Se cree que ésta gruesa capa de
peptidoglicano es la determinante de que estas
bacterias retengan el cristal violeta de la
coloración de Gram.
 Los conocimientos adquiridos en esta práctica son
de gran importancia ya que da conocimiento de la
conformación y estructura de las bacterias, se
logró el objetivo el cual era identificar a las
bacterias que se tenían tanto Gram positivas como
negativas. Con la gran ayuda de nuestro instructor
se pudo reforzar el aprendizaje que esta práctica
nos aportaba.
 Para empezar a trabajar en cualquier laboratorio
de Microbiología se requiere disponer de una serie
de medios de cultivo estériles. Para esto, resulta
 necesario conocer los métodos de preparación y
esterilización utilizados habitualmente en el
laboratorio.
 En la práctica se emplearon medios de cultivo
sólidos (agar nutritivo, King B y PDA), cabe
resaltar que, para hacer siembras en el laboratorio,
es necesario que los cultivos sean ricos en
nutrientes o que al menos satisfagan los
requerimientos básicos necesarios por el
microorganismo que se va a sembrar.
 Para la siembra del cultivo de hongos se empleó
agar PDA, el cual se caracteriza porque permite el
crecimiento de hongos y esporas debido a que
poseen cloranfenicol, un pH neutro y altas
concentraciones de glucosa.
 Se comprobó la presencia de microorganismos en
las diferentes muestras, ya que se encontraron
unidades formadoras de colonias. De lo anterior,
se pudo afirmar que en todo lo que nos rodea
podemos encontrar microorganismos, estos
pueden ser tan pequeños que simplemente no son
visibles al ojo humano, hay que resaltar que éstos
hacen posible que se cumplen diversas funciones
esenciales permitiendo que se desarrolle la vida en
el planeta.
5. BIBLIOGRAFIA
 Alarcon, L,R(2001). Manual de practicas de
microbiología básica y microbióloga de
alimentos, programa de nutrición UACJ
 Lichtman, J. J. y Conchillo, A. 2005.
Fluorescence microscopy. Nature Methods
 Pedro García Martos, F. P. (1994).
Microbiología clínica práctica. Servicio
Publicaciones UCA.
 Pírez M., M. M. (2008). Morfología y
estructura bacteriana. Bogota: Editorial
Universidad nacional de colombia.
6. ANEXOS
6.1.CUESTIONARIO
 Identifique los tipos de movilidad de las
bacterias.
Browniano: Movimiento aleatorio derivado del
empuje de moléculas de agua alrededor de la
bacteria. Es la constante vibración de las
bacterias en un punto fijo comportamiento que se
presenta por estar suspendidas en medio líquido
y por su pequeño tamaño.
Flagelar: Presentes en la mayoría de bacterias,
generalmente son rígidos, implantados en la
membrana celular mediante un corpúsculo basal.
Permiten a la mayoría de bacterias la movilidad
en medios líquidos, una excepción son las
bacterias deslizantes que se mueven por flexión
de la pared celular.
Desliz: Fallo involuntario, especialmente con
respecto a la relación sexual.
 ¿Que son las Archaeas?
Las Archaea, arqueas o arqueobacterias, son un
grupo de microorganismos unicelulares de
morfología procariota (sin núcleo ni, en general,
organelos membranosos internos), que forman
uno de los tres grandes dominios de los seres
vivos, y que son diferentes de las bacterias.
Las arqueas y bacterias son bastante similares en
tamaño y forma, aunque algunas arqueas tienen
formas muy inusuales, como las células planas y
cuadradas de Haloquadra walsbyi. A pesar de
esta semejanza visual con las bacterias, las
arqueobacterias poseen genes y varias rutas
metabólicas que son más cercanas a las de los
eucariotas, en especial en las enzimas implicadas
en la transcripción y la traducción.
 ¿Porque las endosporas bacterianas
resisten temperatura?
Las endosporas son formas de resistencia que
desarrollan ciertos bacilos y cocos Gram
positivos, ante los estímulos adversos del
ambiente.
Las endosporas están destinadas a proteger el
ADN y el resto del contenido citoplasmático,
cuya actividad metabólica se reduce al estado de
vida latente, pudiendo resistir temperaturas de
hasta 80 ºC y soportar la acción de diversos
agentes físicos y químicos.
 ¿Porque las endosporas pueden ser
teñidas con verde malaquita?
La verde malaquita es un colorante débilmente
básico y, por tanto, se une débilmente a la célula
bacteriana, penetra las células vegetativas,
cuando se penetra en la preparación también
penetra las esporas.