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Grupo laboratorio de Microbiología, Programa de Ingeniería Agroindustrial, Escuela de

ingeniería en ciencias agrícolas, Facultad de ciencias agropecuarias y recursos naturales,


Universidad de los Llanos. Vereda Barcelona. Villavicencio, Colombia.

TÉCNICAS PARA EL AISLAMIENTO DE


MICROORGANISMOS & OBSERVACIÓN
MICROSCOPICA DE BACTERIAS
Laura Katherin BG 117003907; Sebastian Steven BJ 117003905; Gabriela Maite CM 117003913; Yeison
BR 117003906.
Facultad de ciencias agropecuarias y recursos naturales.
Ingeniería agroindustrial

RESUMEN
En la práctica se transfirió una muestra microbiológica conocida a un medio de cultivo, lo que permitió
obtener colonias aisladas. La aplicación de diversos procedimientos al realizar la practica determinan la
efectividad a la hora del conteo bacteriano y así mismo obtener cultivos puros (los cultivos puros existen
de manera artificial y se obtienen en el laboratorio, son aquellos donde solo hay una clase de
microorganismo presente) facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de
estos. Para la apreciación de algunas características físicas y morfológicas de las bacterias que se cultivaron
en la práctica se hizo una tinción de Gram y movimiento bacteriano para los Bacillus sp con contraste
cromático de las endosporas para los Bacillus sp; se dedujo de la observación de tinción de Gram que los
bacilos presentan coloración de Gram.
Palabras clave: aislamiento microbiano, cultivos puros, tinción.

ABSTRACT
In the practice transfire a microbiological sample known to a way of culture, which was allowed to obtain
isolated colonies. The application of diverse procedures on having realized the practice they determine the
efficiency at the moment of the bacterial count and likewise to obtain pure cultures (the pure cultures exist
in an artificial way and are obtained in the laboratory, are those alone where there is a class of present
microorganism) facilitating thus, the study, characterization, application and control of these. For the
appraisal of some physical and morphologic characteristics of the bacteria that were cultivated in the
practice Gram's tint and bacterial movement was done for the Bacillus sp by chromatic contrast of the
endosporas for the Bacillus sp; dedujo of the observation of Gram's tint that the bacilli present Gram's
coloration
Key words: Microbial isolation, pure cultures, tint.

1. INTRODUCCIÓN. área de trabajo, existen muchos otros


Para el aislamiento de los microrganismos se han microorganismos; debido a esto, es necesario tomar
efectuado diferentes técnicas que permiten precauciones para impedir que éstos penetren y
cultivarlos de manera artificial y obtener colonias de contaminen los cultivos en estudio.
bacterias en cultivo puro o axénico. Un cultivo El segundo paso para obtener un cultivo axénico es
axénico consiste en una sola especie microbiana, inocular o introducir, una sola célula de un
proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos microorganismo en un medio sólido o líquido,
son muy raros en la naturaleza. En los medios esterilizado previamente. De esta manera, aislamos
naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el un solo microorganismo del resto y se podrá
cuerpo humano existen cultivos mixtos. En un multiplicar en condiciones favorables.
cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de Los métodos utilizados en la práctica fueron:
forma conjunta. Este cultivo se obtiene siembra en superficie consiste en la siembra de un
artificialmente en un laboratorio, al efectuar estos volumen conocido de la dilución de la muestra sobre
procedimientos, es necesario considerar que, en el la superficie de un medio de cultivo en la caja de
Petri. En este método todas las colonias crecen sobre muestra en cada tubo de ensayo evitando la
la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta contaminación
técnica para el recuento de bacterias aerobias.  Asas bacteriológicas curvas y rectas: Se usó un
El otro método es siembra en profundidad consiste asa bacteriológica curva para tomar muestras de los
en añadir medio de cultivo fundido sobre caja de microorganismos ya sembrados, esterilizándola al
Petri que contiene una cantidad determinada de la someter al fuego.
muestra diluida. Se tapa la caja y se rota para mezclar  Perlas de vidrio por grupo: Se usaron 4 perlas
la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se de vidrio esterilizadas para así esparcir la muestra de
incuban las cajas. Las colonias se desarrollan tanto suelo tomada (4 perlas por cada caja de Petri),
dentro del agar como en la superficie. Es un método haciendo un movimiento en ocho.
generalmente utilizado para el recuento de  Papel absorbente: Se usó papel absorbente
microorganismos anaerobios facultativos o Scott para la limpieza de los mesones con alcohol
microaerófilo 70% y para soporte de los materiales esterilizados
Para observar la movilidad de las bacterias se tomó evitando el contacto directo con el mesón.
un asa y se extendiendo la bacteria por todo el  1 gradilla para tubos de ensayo: Se usó una
portaobjetos, después se fijó con calor muy gradilla para el soporte de los 5 tubos de ensayo
cuidadosamente de no matar el microrganismo, por usados para la toma de muestra del suelo.
último, se llevó al microscopio a 100x con aceite de  Marcador de vidrio: Se usó un marcador
inmersión. Sharpie color negro para marcar las cajas de Petri
Para la observación de la forma y la identificación con las muestras de suelo y de los microorganismos
diversas estructuras celulares y tipo de las bacterias anteriormente sembrados.
que se cultivaron se hicieron tres tipos de tinciones:  Alcohol 70 % para desinfectar mesones: Se usó
 Tinción negativa o tinta china para capsula. alcohol al 70% para la esterilización del mesón,
 Tinción de Gram esparciéndolo y limpiando debidamente con papel
 Tinción de endosporas absorbente.
 Pipeteador: Se usó un pipeteador para trasvasar
2. MATERIALES/ METODOS las muestras de suelo a las cajas de Petri.
2.1.TÉCNICAS PARA EL AISLAMIENTO  Encendedor: Se usó un encendedor para dar
DE MICROORGANISMOS llama al mechero usado en la esterilización del asa
curva.
MATERIALES Equipos para incubación, esterilización y para pesar:
Cajas usadas: 2 cajas de King B, 2 cajas de Agar Incubadora, autoclave, balanza electrónica
Nutritivo por grupo, 2 cajas de PDA, cajas de Petri
con microorganismos obtenidos en la práctica METODOS
anterior Aislamiento de microorganismos por agotamiento y
 1 muestra de suelo de 10 gr por grupo: Se tomó punción. Se desinfecto el mesón con alcohol 70%, se
una muestra del suelo húmeda en la vereda marcaron las cajas de Petri con el nombre del medio,
Barcelona/Meta a las 11:02 a.m. sobre un pedazo de código del estudiante y fecha, luego se sembró el
papel aluminio agar nutritivo por la técnica de estriado, se incubo
 5 tubos de ensayo con 9 ml de agua estéril cada 24-48 horas a 25ºC, luego se sembró por la técnica
uno: Se usaron cinco tubos de ensayo debidamente de punción muestras de la caja de hongos sembrada
esterilizados con aproximadamente 9ml de agua en la práctica anterior, incubándolo también entre
estéril. 24-48 horas a 25ºC viendo así un crecimiento
 Erlenmeyer de 100 ml, con 90 ml de agua descrito macroscópicamente. Luego se realizó la
destilada: Se tuvo un Erlenmeyer de 100ml con 90ml misma observación con el agar PDA.
de agua destilada aproximadamente. Aislamiento de microorganismos por dilución.
 4 pipetas Pasteur estériles: Se usaron 4 pipetas Se tomó una muestra de 10 gr de suelo, la cual se
Pasteur esterilizadas para añadir la disolución de la disolvió en 90ml de agua estéril, luego se tomó 1ml
agregándolo a un tubo de ensayo con 9ml de agua
estéril marcada con 10-1 (esto hasta llegar a la
disolución de 10-4). La disolución 10-3 fue El mismo procedimiento del punto anterior, pero con
sembrada en agar King B con 0.1ml de suspensión tinta china la cual se dejó secar al ambiente, luego
siendo esparcido con perlas de vidrio con ayuda del observado al microscopio en 100X
movimiento de la caja sobre la mesa, luego se Tinción de Gram Realice un frotis y fíjelo con calor.
desecharon las perlas y se incubo la caja entre 24-48 Primero se adiciono cristal violeta por 1 minuto,
horas a 35°C para así hacer el conteo de colonias, luego se lavó. Al igual que con el Lugol, luego con
para afirmar la presencia de Pseudomonas alcohol acetona y por último con fucsina, Se observó
fluorescens se hizo en presencia de luz, presentando en 100X
pigmentos fluorescentes, después se realizó el
conteo de colonias, descripción macroscópica. 3. RESULTADOS

2.2.OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE
BACTERIAS

MATERIALES.
Cajas usadas: Caja de Petri con cultivos puro de
Bacillus sp, con E.coli, Klebsiella sp,
Staphylococcus sp.
Cubeta para coloración de Gram: Usada para las
tinciones y evitar manchar los mesones
Papel absorbente: Se usó papel absorbente Scott para
la limpieza de los mesones con alcohol 70% y para Figura No. 1. Resultado de la siembra en superficie
soporte de los materiales esterilizados evitando el de la dilución 10-4 en PDA
contacto directo con el mesón.
Asas redondas: Se usó un asa redonda para tomar
muestras de los microorganismos ya sembrados,
esterilizándola al someter al fuego.
Mecheros: Se usó para esterilizar el asa antes de
poner cada muestra en su respectivo portaobjeto.
Laminas porta objetos: Se usaron laminas
portaobjetos en los cuales se puso una gota de agua
con una muestra de los resultados de la incubación
de los microrganismos del suelo y hongos y
bacterias. Para las tinciones: Colorantes de Gram,
verde malaquita, tinta china, tubos con agua estéril.

METODOS
Montaje en fresco. Observación de movilidad.
Sobre un portaobjetos limpio se agregó una gota de
Figura No.2. resultado de la siembra en superficie,
agua destilada estéril con una porción del
dilución 10-5 en AN
microorganismo presente en la caja de Petri con un
asa flameada previamente. Luego se hizo su
observación en el microscopio a 100X
Tinción de endosporas.
Se realizó el frotis del microorganismo Bacillus sp
en un portaobjetos, fijándolo con calor, adicionando
posteriormente verde de malaquita, luego se secó a
la llama del mechero, luego se lavó con agua y luego
se observó al microscopio con el objetivo 100X
Tinción negativa o Tinta china para capsula.
moléculas del líquido contra las bacterias, que
provocan vibraciones sin desplazamiento; en este
caso la preparación a fresco constituye el método
más simple y rápido de determinar movilidad de
microorganismos (Pedro García Martos, 1994).

Las bacterias con forma de barras o varillas son


llamadas bacilos. En este caso la Figura No. 5
Clasificación de bacilos según su forma, se muestra
ubicación de bacilos en diferentes formas desde
bacilos simples hasta estreptobacilos, con extremos
de forma redonda y aguda en diferentes casos.

Figura No 3. Resultados de la observación de la


tinción de endosporas.

Figura No. 5 Clasificación de bacilos según su


forma.

En el desarrollo de las dos practicas se realizó la


siembra en superficie de una muestra de tierra
(10.678 g) disuelta en agua peptona, y se llevó un
procedimiento de dilución de la muestra. Se realizó
dos siembras por cada una de las diluciones
presentes (10-3, 10-4 y 10-5), intentando con esto
Figura No. 4. Resultados de la observación de realizar un aislamiento con una proporción mayor y
bacilos por medio de la tinción Gram. finalmente un conteo de las colonias presentes en
cada una de las siembras, donde se seleccionaron
4. ANALISIS DE RESULTADOS solo las diluciones 10-4 y 10-5 para la observación de
microrganismo en el microscopio. En la dilución 10-
4
Tinción Gram positivas y negativas , se pudo encontrar aproximadamente en promedio
La determinación de la movilidad bacteriana es uno más de 70x104 UFC/g, así demostrando la
de los parámetros que se utiliza en la identificación efectividad que tiene la siembra en superficie en el
de bacterias. Esta capacidad usualmente se debe a la momento de las diluciones, ya que me disminuyen
presencia de flagelos, la movilidad bacteriana las unidades formadoras de colonias en cada una de
capacita a la célula para alcanzar deferentes regiones ellas, esto se puede observar en la Figura No. 1.
en su microambiente lo que representa una ventaja Resultado de la siembra en superficie de la dilución
(Pírez M., 2008). 10-4 en PDA.

El movimiento usual debido a la presencia de En la dilución 10-5, se pudo identificar más de 5x105
flagelos se puede determinar al microscopio con una UFC/g y aproximadamente 3S, indicando de igual
preparación en fresco como se hizo en esta caso, es manera la eficiencia que tiene la dilución ya que las
importante diferenciar el movimiento traslatorio de unidades formadoras de colonias se redujeron en una
las bacterias del movimiento browniano que es el proporción de aproximadamente de 2x105,
movimiento vibratorio, originado por choque de las demostrando una reducción de estas unidades, esto
se puede observar Figura No.2. resultado de la se mencionó anteriormente aplicar calor al medio
siembra en superficie, dilución 10-5 en AN. (Pedro García Martos, 1994).
En este caso se utilizó verde malaquita como
Seguidamente, se realizó la extracción de las colorante primario el cual es eliminado del resto de
muestras para cada una de las observaciones la célula por medio de un enjuague, pero no de la
realizadas en la práctica, las de GRAM (positivas y espora.
negativas) y las de endosporas. En la tinción GRAM, Existen otros métodos de tinción de endosporas, uno
es una tinción de las más utilizadas en los de los más conocidos es el método de schaeffer y
laboratorios de bacteriología, y permite de acuerdo fulton, en el que el proceso se realiza de la misma
con la estructura y grosor de la pared bacteriana forma, pero el finalizar la coloración verde
agrupar las bacterias en Gram positivas y Gram malaquita se emplea safranina para teñir el resto de
negativas (Pírez M., 2008), por lo tanto en estas dos la célula (Alarcón, 2001).
practicas se realizó la siembra en superficie de una Es evidenciable que en la Figura No 3. Resultados
muestra de tierra (10.678 g) disuelta en agua de la observación de la tinción de endosporas, no
peptona, y se llevó un procedimiento de dilución de proporciona una vista clara de las características de
la muestra. Se realizó dos siembras por cada una de las bacterias, sin embargo, al ser vistas
las diluciones presentes (10-3, 10-4 y 10-5), intentando experimentalmente se concluyó le presencia de
con esto realizar un aislamiento con una proporción bacilos en forma empalizada inmóviles con
mayor y finalmente un conteo de las colonias extremos redondos y angulares en diferentes casos,
presentes en cada una de las siembras, donde se pudo se presentan en poca cantidad estreptobacilos con la
determinar una gran cantidad de predominación de mismas características y gran cantidad de esporas en
GRAM positivas y en una pequeña proporción forma fusiliforme y oblonga.
GRAM negativas, estos resultados pudieron ser
alterados por el mal procedimiento en la tinción o
por un error humano. Esto se puede observar en la 5. CONCLUSIONES
Figura No. 6. Resultados de la observación de  Se puede concluir que la preparación en fresco no
bacilos por medio de la tinción Gram. permite aumentar el contraste de la preparación
sin embargo la ventaja que tiene es que también
Además de una excesiva decoloración la edad del es útil para observar la movilidad de las bacterias.
cultivo influye en que las bacterias GRAM positivas  La preparación en fresco nos ayudó a observar la
se observen total o parcialmente rosadas, debe morfología de las bacterias, aunque con un poco
prestarse atención también a los lavados que se más de trabajo y sin una clara distinción de la
realizan puesto que si se dejan excesos de agua se forma que se apreciaba.
puede presentar una dilución de los colorantes o  La gruesa pared celular de las bacterias Gram
diferentes reactivos en este caso el yoduro.
positivas está constituida principalmente por
peptidoglicano. Se cree que ésta gruesa capa de
Tinción de Endosporas
peptidoglicano es la determinante de que estas
Las endosporas son formas de resistencia altamente
bacterias retengan el cristal violeta de la
deshidratadas y con una serie de cubiertas muy poco
coloración de Gram.
permeables, esto hace que sean difíciles de teñir,
excepto si se calienta la preparación para  Los conocimientos adquiridos en esta práctica son
permeabilizarlas (Pírez M., 2008), es por eso que se de gran importancia ya que da conocimiento de la
flamea la muestra después de ser aplicado el conformación y estructura de las bacterias, se
colorante. logró el objetivo el cual era identificar a las
Las endosporas bacterianas son muy resistentes a bacterias que se tenían tanto Gram positivas como
procedimientos tinto riales usuales, la aplicación de negativas. Con la gran ayuda de nuestro instructor
un solo colorante a una célula bacteriana que se pudo reforzar el aprendizaje que esta práctica
contiene una endosporas, solo tiñe la célula, pero la nos aportaba.
espora se mantiene incolora, para lograr aplicar  Para empezar a trabajar en cualquier laboratorio
colorante dentro de la endosporas es necesario como de Microbiología se requiere disponer de una serie
de medios de cultivo estériles. Para esto, resulta
necesario conocer los métodos de preparación y
esterilización utilizados habitualmente en el Flagelar: Presentes en la mayoría de bacterias,
laboratorio. generalmente son rígidos, implantados en la
 En la práctica se emplearon medios de cultivo membrana celular mediante un corpúsculo basal.
sólidos (agar nutritivo, King B y PDA), cabe Permiten a la mayoría de bacterias la movilidad
resaltar que, para hacer siembras en el laboratorio, en medios líquidos, una excepción son las
es necesario que los cultivos sean ricos en bacterias deslizantes que se mueven por flexión
nutrientes o que al menos satisfagan los de la pared celular.
requerimientos básicos necesarios por el
microorganismo que se va a sembrar. Desliz: Fallo involuntario, especialmente con
 Para la siembra del cultivo de hongos se empleó respecto a la relación sexual.
agar PDA, el cual se caracteriza porque permite el
crecimiento de hongos y esporas debido a que  ¿Que son las Archaeas?
poseen cloranfenicol, un pH neutro y altas Las Archaea, arqueas o arqueobacterias, son un
concentraciones de glucosa. grupo de microorganismos unicelulares de
 Se comprobó la presencia de microorganismos en morfología procariota (sin núcleo ni, en general,
las diferentes muestras, ya que se encontraron organelos membranosos internos), que forman
unidades formadoras de colonias. De lo anterior, uno de los tres grandes dominios de los seres
se pudo afirmar que en todo lo que nos rodea vivos, y que son diferentes de las bacterias.
podemos encontrar microorganismos, estos
pueden ser tan pequeños que simplemente no son Las arqueas y bacterias son bastante similares en
visibles al ojo humano, hay que resaltar que éstos tamaño y forma, aunque algunas arqueas tienen
hacen posible que se cumplen diversas funciones formas muy inusuales, como las células planas y
esenciales permitiendo que se desarrolle la vida en cuadradas de Haloquadra walsbyi. A pesar de
el planeta. esta semejanza visual con las bacterias, las
arqueobacterias poseen genes y varias rutas
5. BIBLIOGRAFIA metabólicas que son más cercanas a las de los
 Alarcon, L,R(2001). Manual de practicas de eucariotas, en especial en las enzimas implicadas
microbiología básica y microbióloga de en la transcripción y la traducción.
alimentos, programa de nutrición UACJ
 Lichtman, J. J. y Conchillo, A. 2005.  ¿Porque las endosporas bacterianas
Fluorescence microscopy. Nature Methods resisten temperatura?
 Pedro García Martos, F. P. (1994). Las endosporas son formas de resistencia que
Microbiología clínica práctica. Servicio desarrollan ciertos bacilos y cocos Gram
Publicaciones UCA. positivos, ante los estímulos adversos del
 Pírez M., M. M. (2008). Morfología y ambiente.
estructura bacteriana. Bogota: Editorial Las endosporas están destinadas a proteger el
Universidad nacional de colombia. ADN y el resto del contenido citoplasmático,
cuya actividad metabólica se reduce al estado de
6. ANEXOS vida latente, pudiendo resistir temperaturas de
hasta 80 ºC y soportar la acción de diversos
6.1.CUESTIONARIO
agentes físicos y químicos.
 Identifique los tipos de movilidad de las
bacterias.
 ¿Porque las endosporas pueden ser
Browniano: Movimiento aleatorio derivado del
teñidas con verde malaquita?
empuje de moléculas de agua alrededor de la
La verde malaquita es un colorante débilmente
bacteria. Es la constante vibración de las
básico y, por tanto, se une débilmente a la célula
bacterias en un punto fijo comportamiento que se
bacteriana, penetra las células vegetativas,
presenta por estar suspendidas en medio líquido
cuando se penetra en la preparación también
y por su pequeño tamaño.
penetra las esporas.