EUROPOS SĄJUNGA

Europos socialinis fondas

KURKIME ATEITĮ DRAUGE!

PROJEKTAS „MAGISTRANTŪROS IR DOKTORANTŪROS STUDIJŲ

MODULIŲ KŪRIMAS IR PROGRAMŲ ATNAUJINIMAS STRATEGINĖSE
BIOMOKSLŲ SRITYSE“

Fermentinės katalizės pagrindai

Arvydas Markuckas
 Turinys

1. Enzimologijos istorija ..................................................................................................................... 5

1.1. Fermentai Antikoje ................................................................................................................ 5
1.2. Ankstyvoji enzimologija ........................................................................................................ 6
1.3. Mechanistinės enzimologijos raida ........................................................................................ 6
1.4. Fermentų struktūros tyrimai ................................................................................................... 7
1.5. Šių dienų enzimologija .......................................................................................................... 8
2. Fermentinės katalizės cheminiai mechanizmai............................................................................... 10
2.1. Kur, kodėl ir kaip reikalinga katalizė ................................................................................... 10
2.2. Fermentų aktyviųjų centrų ir substratų molekulių komplementarumas ................................. 13
2.3. Pereinamosios būsenos susidarymas .................................................................................... 15
2.4. Substratų pereinamosios būsenos stabilizavimas fermentų aktyviuosiuose centruose ........... 17
2.5. Hamondo postulatas ............................................................................................................ 20
2.6. Pereinamosios būsenos stabilizavimo cheminiai mechanizmai ............................................. 22
2.6.1. Reaguojančių molekulių suartinimas .......................................................................... 22
2.6.2. Kovalentinė katalizė .................................................................................................. 24
2.6.2.1. Nukleofilinė katalizė ...................................................................................... 25
2.6.2.2. Elektrofilinė katalizė ...................................................................................... 26
2.6.3. Bendroji rūgštinė-bazinė katalizė ............................................................................... 29
2.6.4. Konformaciniai pokyčiai ............................................................................................ 32
2.7. Entropijos kitimas – vidumolekulinės katalizės privalumo pagrindas ................................... 36
2.8. Elektrostatinė katalizė.......................................................................................................... 40
2.9. Katalizė metalų jonais ......................................................................................................... 42
2.10. Izotopų pakeitimo kinetiniai efektai ................................................................................... 43
2.11. Serino peptidazių veikimo mechanizmai ............................................................................ 47
2.12. Fermentų ir substratų komplementarumas. Sąveikos energijos panaudojimas katalizėje ..... 52
2.12.1. Sąveikos energijos įtaka konstantos kkat/KM skaitinei vertei ...................................... 52
2.12.2. Sąveikos ir aktyvacijos energijų virsmai................................................................... 53
2.12.3. Eksperimentai, įrodantys sąveikos energijos panaudojimą katalizėje ........................ 57
2.12.4. Fermentinių reakcijų greičio didinimo principai ....................................................... 60
2.12.5. Konstantos KM vertės ............................................................................................... 63
2
 2.12.6. Glikolizės metabolitų koncentracijos ląstelėse ir KM konstantų vertės ...................... 63
3. Fermentinių reakcijų nuostoviosios būsenos kinetika ..................................................................... 66
3.1. Michaelio ir Menten darbai .................................................................................................. 67
3.2. Nuostoviosios būsenos principas ......................................................................................... 69
3.3. Michaelio–Menten lygtis grįžtamajai fermentinei reakcijai .................................................. 72
3.4. Michaelio-Menten lygties transformacijos ir grafinis atvaizdavimas .................................... 75
3.5. Fermentinių reakcijų nuostoviosios būsenos greičio lygtys .................................................. 78
3.5.1. King–Altman metodas ............................................................................................... 78
3.5.2. King-Altman metodo variantai ................................................................................... 80
3.5.3. Reakcijos, turinčios pusiausvyros stadijas .................................................................. 85
3.5.4. Fermentinių reakcijų mechanizmų analizė pagal pagrindinio grafo išvaizdą ............... 86
3.6. Dvisubstratinės-dviproduktinės reakcijos ............................................................................. 88
3.6.1. Fermentinių reakcijų mechanizmų klasifikacija ir jų scheminis atvaizdavimas ........... 91
3.6.2. Dvisubstratinių reakcijų greičio lygtys ....................................................................... 91
3.6.3. Dvisubstratinių-dviproduktinių reakcijų pradinio greičio lygtys ................................. 93
4. Fermentų aktyvumo slopikliai. Fermentinių reakcijų lėtinimas ...................................................... 98
4.1. Konkurencinis slopinimas.................................................................................................... 99
4.2. Nekonkurencinis slopinimas .............................................................................................. 101
4.3. Mišrus slopinimas ............................................................................................................. 103
4.4. Bekonkurencinis slopinimas .............................................................................................. 105
4.5. Grafinis įvairių slopinimo atvejų iliustravimas ................................................................... 107
4.6. Slopinimo konstantų verčių apskaičiavimas ....................................................................... 108
4.6.1. Slopinimo konstantų verčių apskaičiavimas Lineweaver-Burk metodu..................... 108
4.6.2. Slopinimo konstantų verčių apskaičiavimas, brėžiant tiesės pasvirimo kampo
tangento priklausomybės nuo slopiklio koncentracijos grafikus ............................... 110
4.6.3. Slopinimo konstantų verčių apskaičiavimas Diksono metodu ................................... 113
4.6.4. Slopinimo konstantų verčių apskaičiavimas Cornish-Bowden metodu ..................... 115
4.6.5. Slopinimo konstantų verčių apskaičiavimas daliniais slopinimo atvejais .................. 116
5. Fermentinių reakcijų greičio priklausomybė nuo pH ir temperatūros ........................................... 118
5.1. Michaelio pH funkcijos ..................................................................................................... 119
5.2. pH įtaka Vmax ..................................................................................................................... 122
5.3. pH įtaka Michaelio konstantai KM...................................................................................... 126
5.4. Temperatūros įtaka fermentinių reakcijų greičiui ............................................................... 129
LITERATŪROS SĄRAŠAS ........................................................................................................... 133

3
 1. Enzimologijos istorija

Gyvose ląstelėse vyksta daug gerai suderintų cheminių reakcijų. Mėgintuvėliuose šios reakcijos
vyksta labai lėtai. Ląstelėse tokias reakcijas katalizuoja fermentai, kurie daug kartų padidina šių reak-
cijų greitį. Įvairiose gyvybės formose, pradedant virusais ir baigiant žmogumi, fermentų katalizinė ga-
lia panaudojama cheminėms reakcijoms pagreitinti. Daugelis iš ląstelių išskirtų fermentų yra kataliziš-
kai aktyvūs ir žmonija šią fermentų savybę panaudoja įvairiose ūkio ir mokslo šakose. Pradžioje žmo-
nės fermentus pradėjo naudoti sūrių, duonos ir alkoholinių gėrimų gamybai, mėsos minkštinimui.
Fermentai ir šiandien naudojami daugelyje maisto ir gėrimų gamybos procesų. Be to, fermentai yra
papildomos medžiagos tokių produktų kaip skalbimo priemonės, įvairūs valikliai, pvz., proteoliziniai
fermentai. Fermentai svarbūs ir medicinoje, nes daugelis ligų yra susijusios su pakitusiu vieno ar kelių
fermentų aktyvumu. Taigi fermentų savybės seniai domina mokslininkus, kurie stengiasi suprasti jų
veikimo mechanizmus, kad galėtų pritaikyti praktinėje veikloje.

1.1. Fermentai Antikoje

Seniausių duomenų apie fermentų panaudojimą galima rasti Hammurabi „Kodekse“ (Senovės Ba-
bilonas,  2100 m. pr. Kr.). Šiame „Kodekse“ aprašomas fermentų panaudojimas vyno gamybai. Mik-
roorganizmų ir fermentų panaudojimas rūgimui buvo plačiai paplitęs senovėje. Apie tai rašytinių šalt i-
nių aptinkama ne tik Senovės Babilone, bet ir Romos, Graikijos, Egipto, Kinijos, Indijos civilizacijose.
Daug rašytinių šaltinių randama ir apie kito produkto, t.y. maistinio acto gamybą, kuri paremta fermen-
tiniu alkoholio pavertimu acto rūgštimi. Maistinis actas senovėje buvo svarbi prekė, jis buvo naudoja-
mas ne tik maisto konservavimui, bet ir medicinoje.
Pieno produktai taip pat buvo labai svarbūs senovės žmonių mityboje. Kadangi ilgai išlaikyti švie-
žią pieną sudėtinga, senovės žmonės iš jo gamindavo sūrį ir tai suteikdavo jiems galimybę nugabenti šį
pieno produktą į tolimus kraštus. Sūris buvo gaminamas sutraukiant pieną įvairiais fermentais. Šiam
tikslui senovės žmonės vartojo ficiną, gaunamą iš figmedžio lapų, ir reneto fermentą, gaunamą iš šliu-
žo sienelės tų gyvūnų, kurie turi kelių kamerų skrandžius, pvz., karvių. Homeras „Iliadoje“ mini ficino
panaudojimą. Aristotelis yra aprašęs pieno sutraukimo procesą reneto fermentu ir net pasiūlęs hipote-
zę, kaip šis fermentas veikia. Jis manė, kad renetas yra ypatingas pienas, kuris susidaro gyvūno skran-
dyje panaudojant šilumą. Aristotelis renetą vadino pienu, turinčiu ugnies.
Kitas produktas, ypač svarbus senovėje, buvo duona, kurios kepimui reikalingos mielės, o jų fer-
mentai, gamindami anglies dvideginį, sukelia rūgimą.
Dar iki Antikos laikų žmonės vartojo fermentus mėsai suminkštinti. Ramiojo vandenyno salų gy-
ventojai žinojo, kad papajos vaisių sultys geba suminkštinti net pačią kiečiausią mėsą. Tai padarydavo
šiuose augaluose esanti peptidazė – papainas, kuris ir šiandien vartojamas mėsai minkštinti. Britai apie
1700 m. atplaukę į Ramiojo vandenyno salas pamatė, kaip vietiniai gyventojai vartoja papajos vaisius
4
ne tik mėsai minkštinti, bet ir trichofilijai gydyti. 18 a. Europoje ypač plačiai vartota papaja ir tai pas-
katino žmones pradėti tyrinėti virškinimo fermentus.

1.2. Ankstyvoji enzimologija

Antikoje fermentai buvo vartojami tik praktikoje. Empiriškai stebint, jų veikla buvo aprašoma
folklore, rašytiniuose šaltiniuose, tačiau sistemiškai jie nebuvo tyrinėjami, nebuvo aiškinamasi jų che-
minis veikimas. 18 ir 19 a. mokslininkai pradėjo tyrinėti fermentus, jų struktūrą, veikimo mechaniz-
mus. Tais laikais virškinimas buvo tyrimų objektas. Stebėdamas, kaip plėšrieji paukščiai virškina
mėsą, prancūzų mokslininkas Réaumur (1683–1757) atliko pačius pirmuosius virškinimo proceso ty-
rimus. Jis pirmasis iškėlė hipotezę, kad virškinimas yra cheminis procesas, o ne mechaninis maisto
susmulkinimas. Réaumur teigė, kad mėsą skrandyje suvirškina skrandžio sultys (jis rašė „tirpiklis“).
Réaumur atliko bandymus ne tik su mėsa, bet ir su kaulų bei augalų gabalėliais. Jis įrodė, kad mėsa,
kaulai suminkštėja veikiami skrandžio sulčių, o augalai „tirpiklio“ nebuvo veikiami. Tai buvo vienas
pirmųjų eksperimentų, parodžiusių fermentų savitumą. Réaumur darbus pratęsė Spallanzani (1729–
1799), kuris įrodė, kad mėsos virškinimas sultimis vyksta ne tik paukščių, bet ir kitų gyvūnų bei žmo-
gaus skrandyje. Spallanzani, panaudodamas savas skrandžio sultis, atliko eksperimentus in vitro ir pa-
rodė, kad skrandžio sultyse yra aktyvių medžiagų, kurios dalyvauja mėsos virškinime. Be to, jis nusta-
tė, kad virškinimo procesas priklauso nuo temperatūros bei nuo skrandžio sulčių kiekio. Šis moksli-
ninkas įrodė, kad skrandžio sulčių aktyvios medžiagos yra nestabilios. Spallanzani laikais tai buvo
nauji atradimai. Prasidėjo fermentų paieška įvairiose biologinėse sistemose. Aprašytas peroksidazės
veikimas iš krienų, -amilazės iš grūdų. Visi šie tyrimai buvo atliekami augalų ir gyvūnų audinių
ekstraktuose.
19 a. antrojoje pusėje ekstraktai pradėti frakcionuoti. Buvo bandoma išgryninti šias aktyvias me-
džiagas. 1897 m. Bertrand iš augalų sulčių grynino fermentą lakazę, o Biuchneris, panaudodamas
džiovintas mieles, parodė, kad alkoholinis rūgimas gali vykti ir be gyvų mielių ląstelių. Be to, jis nus-
tatė, kad penkias dienas palaikytas mielių ekstraktas, prarasdavo aktyvumą, tačiau į laikomą ekstraktą
pridėjus nendrių cukraus, aktyvumas išlikdavo iki dviejų savaičių. Taip buvo atrastas fermentų stabili-
zavimo jų substratais reiškinys. Tuo metu Kühne, tyrinėdamas katalizės procesus mielių ekstraktais,
šias aktyvias medžiagas pasiūlė vadinti „enzimais“ (žodis kilęs iš viduramžių Graikijos žodžio enzy-
mos, kuris reiškia rūgimą).

1.3. Mechanistinės enzimologijos raida

Tuo metu, kai buvo gauti pirmieji gryni arba iš dalies gryni fermentai, mokslininkai pradėjo tyri-
mus, norėdami išaiškinti šių medžiagų veikimo mechanizmus. 19 a. pabaigoje buvo suformuluota min-
tis, kad fermentai sudaro tarpinius junginius su savo substratų molekulėmis. Emilis Fišeris pasiūlė
„spynos ir rakto“ modelį, paaiškinantį sąveiką tarp fermento ir substrato molekulių. Šį modelį jis pa-
5
siūlė tyrinėdamas fermentinių reakcijų stereosavitumą. 20 a. pradžioje eksperimentiškai patvirtintas
fermento-substrato komplekso susidarymas. Tai, matuodamas fermentinių reakcijų greičius, 1902 m.
pirmasis paskelbė Braunas. Jis parodė, kad fermentinės reakcijos greitis priklauso nuo fermento-
substrato komplekso skilimo greičio. Braunas rašė: „Kad invertazė paverstų nendrių cukrų gliukoze ir
fruktoze, prieš tai nendrių cukrus turi prisijungti prie fermento“. C. O‘Sullivan ir Tompson įrodė, kad
nendrių cukrus apsaugo invertazę nuo aktyvumo praradimo keliant temperatūrą. 1880 m. Wurtz nusta-
tė, kad prieš fibrino hidrolizę papainas sudaro netirpų junginį su šiuo substratu. Tokie tyrimai leido
fermentinę reakciją suskirstyti į etapus ir atvėrė galimybę matematiškai modeliuoti fermentines reakci-
jas. 1903 m. Victor Henri pirmasis paskelbė matematinį modelį, aprašantį fermentinės reakcijos kine-
tiką. 1913 m. Michaelis ir Menten, pratęsdami Henri darbus, išvedė fermentinės reakcijos greičio lygtį,
kuri šiandien vadinama Michaelio-Menten lygtimi ir yra pagrindinė lygtis, taikoma sudėtingesniems
fermentinių reakcijų mechanizmams analizuoti. 20 a. pirmojoje pusėje buvo pradėti tyrimai, kuriais
siekiama paaiškinti, kaip fermentai pagreitina reakcijas. 1948 m. L. Polingas nustatė, kad fermentai
pagreitina reakcijas, stabilizuodami savo aktyviuose centruose substratų molekules cheminės reakcijos
pereinamojoje būsenoje. Vėliau ši hipotezė buvo patvirtinta daugybe eksperimentų.
1950–1960 m. buvo atlikta daug darbų tyrinėjant fermentų savitumą. Košlandas iškėlė hipotezę,
kad, sąveikaujant fermentui ir substratui, kinta jų struktūros, sąveikos metu substrato molekulės indu-
kuoja fermento aktyvaus centro struktūros pokyčius. Tokie pokyčiai didina substratų ir fermentų gimi-
ningumą. Pastebėta, kad mažos molekulės gali reguliuoti fermento aktyvumą. Jos gali susirišti su skir-
tingomis fermento molekulės vietomis ir, pakeisdamos fermentų konformaciją, gali padidinti arba su-
mažinti reakcijos greitį. 1965 m. Monod, Wyman ir Changeux pasiūlė alosterinės reguliacijos mecha-
nizmą, paaiškinantį šį reiškinį.

1.4. Fermentų struktūros tyrimai

Vienas pagrindinių moderniosios enzimologijos principų yra tai, kad fermentinėje reakcijoje rea-
guojančios molekulės sąveikauja su fermentu. Šie sąveikos etapai apibrėžia fermentų veiklos katalizinį
mechanizmą. Atliekant fermentų struktūros tyrimus pradėti naudoti fizikiniai metodai. Fermentų veik-
los mechanizmams tirti naudojami spektroskopiniai metodai, rentgenostruktūrinė kristalografinė anali-
zė, BMR metodai. 20 a. pirmojoje pusėje rentgenostruktūrinė kristalografinė analizė pradėta naudoti
atliekant mažų molekulių struktūros tyrimus. 1926 m. James Sumner pirmasis gavo fermento ureazės
kristalus (1 pav.).
Šis mokslininkas ne tik atvėrė kelią baltymų rentgenostruktūrinės kristalografijos analizei, bet ir
įrodė, kad šie kristalai, ištirpinti vandenyje, turi fermentinį aktyvumą ir yra baltymų kristalai. Jo darbai
yra labai svarbūs enzimologijos mokslui. Per 20 metų nuo Sumner darbų gauta daugiau kaip 130 fer-
mentų kristalų. Tačiau per šį laiką nenustatyta nė vieno baltymo struktūra. 1957 m. Kendrew pirmasis
nustatė erdvinę baltymo mioglobino struktūrą.

6
 1 pav. Ureazės kristalai (padidinta 728 kartus)
Antrojoje 20 a. pusėje buvo sukurti baltymų aminorūgščių sudėties nustatymo bei sekvenavimo
metodai. Baltymai buvo hidrolizuojami ir analizuojami cheminiais bei chromatografiniais metodais.
Edmanas sukūrė metodus, kuriuos naudojant galima atskelti nuo polipeptido N-galo po vieną ami-
norūgštį. 1955 m. Sanger pirmasis nustatė hormono insulino aminorūgščių seką, panaudodamas Ed-
mano sukurtą metodą. 1963 m. nustatyta pirmo fermento – ribonukleazės aminorūgščių seka.

1.5. Šių dienų enzimologija

Dabar sprendžiami fundamentiniai klausimai aiškinantis fermentų veiklos mechanizmus ir jų ryšį

su fermentų molekulių struktūra. Spręsdami šiuos klausimus, mokslininkai naudojasi biofizikiniais bei
molekulinės biologijos metodais. Rentgenostruktūrinė kristalografinė analizė ir šiandien naudojama
tiriant fermentų bei fermento-ligando kompleksų struktūras. Naudojant daugiadimensinės BMR spekt-
roskopijos metodus, galima nustatyti nedidelių fermentų erdvinę struktūrą tirpale.
Panaudojant Laue difrakcinius metodus bei sinchrotrono spektroskopinius metodus, galima suži-
noti fermentinių reakcijų tarpinių junginių struktūras, kurios įgalina sukurti detalų, susidedantį iš e-
tapų, fermentinės reakcijos vaizdą. Fermentinės reakcijos, vykstančios tirpaluose, tiriamos optiniais
(cirkuliarinis dichroizmas, UV matomos šviesos spektroskopija, fluorescencinė spektroskopija), vibra-
ciniais (infraraudonoji, Raman spektroskopija) metodais. Be to, molekulinės biologijos eksperimentai
įgalina klonuoti įvairių fermentų genus ir tirti jų raišką. Molekulinio klonavimo metodais buvo nusta-
tyti ir charakterizuoti iki šiol niekada neišgryninti fermentai. Fermentų genų klonavimas prokariotų
ląstelėse leido išgryninti ir charakterizuoti fermentus, kurie ląstelėse gyvuoja keletą minučių, o jų kie-
kiai nedideli. Molekulinės biologijos metodai suteikia galimybes tyrėjams keisti aminorūgščių sekas
fermentų molekulėse. Šių dienų enzimologijoje plačiai taikomi kryptingos ir delecinės mutagenezės
metodai, kurie įgalina nustatyti chemines grupes, betarpiškai dalyvaujančias katalizėje.
Fermentų tyrimai reikšmingi ne tik moksliniam pažinimui. Fermentai naudojami įvairiose ūkio sri-
tyse. Tradiciškai jie naudojami maisto ir gėrimų gamyboje, be to, vis plačiau naudojami įvairių chemi-
nių junginių sintezei. Fermentai naudojami stereosavitajai cheminei sintezei.
Šių dienų enzimologijoje, medicinoje ir veterinarijoje plačiai naudojami įvairių fermentų slopik-
liai. Daugelis vaistų yra fermentų slopikliai, pvz., aspirinas, kuris plačiai vartojamas kaip priešužde-
giminis vaistas, slopina fermentą prostaglandinų sintazę. 1 lentelėje pateikiami įvairūs slopik-
7
liai/vaistai, vartojami kai kurioms ligoms gydyti, ir slopinantys tam tikrus fermentus. Kai kurių slopik-
lių molekulės yra sukurtos panaudojus kompiuterinius fermentų aktyviųjų centrų modeliavimo meto-
dus. Naudojant šiuos metodus, galima sukurti slopiklių molekulių struktūras, kurias turėdamos jos būtų
pačios efektyviausios. Remiantis sukurtomis struktūromis, šios molekulės yra sintetinamos ir išban-
domos.

1 lentelė. Fermentų slopikliai/vaistai

Slopiklis/vaistas Liga/būsena Slopinamas fermentas
Acetazolamidas Glaukoma Karboanhidrazė
Acikloviras Herpesinė infekcija Virusų DNR polimerazė
Alopurinolis Podagra Ksantino oksidazė
Argatrobanas Kraujo krešėjimas Trombinas
Aspirinas, ibuprofenas, Uždegimas, skausmas, karščiavimas Prostaglandinų sintazė
DuP697
-laktamo antibiotikai Bakterinės infekcijos D-Ala-D-Ala transpeptidazė
Brekvinaras Organų persodinimas Dihidroorotato dehidrogenazė
Kandoksatrilis Padidėjęs kraujospūdis, kongestinis Atriopeptidazė
širdies nepakankamumas
Kaptoprilis Padidėjęs kraujospūdis Angiotenziną konvertuojantis
fermentas
Klavulanatas Bakterinės infekcijos -laktamazė
Ciklosporinas Organų persodinimas Ciklofilinas/kalcineurinas
DuP450 AIDS ŽIV peptidazė
Enoksimonas Kongestinis širdies nepakankamu- cAMP fosfodiesterazė
mas, išemija
Fluoruracilas Vėžys Timidilato sintazė
3-fluorvinilglicinas Bakterinės infekcijos Alanino racemazė
Lovastatinas Didelė cholesterolio koncentracija HMG KoA reduktazė
Metotreksatas Vėžys Dihidrofoliato reduktazė
Nitekaponas Parkinsono liga Katecholių O-metiltransferazė
Norfloksacinas Šlapimo takų infekcijos DNR girazė

Šių dienų enzimologija remiasi genomikos ir proteomikos pasiekimais. Tai suteikia galimybę ge-
riau suprasti įvarius ląstelės fiziologinius bei patologinius procesus. Žmogaus fiziologijoje ir patologi-
joje nustatyta tūkstančiai fermentų, dalyvaujančių pasireiškiant vienai ar kitai ligai bei jai progresuo-
jant. Dėl šios priežasties reikia vis naujų ir įvairių fermentų slopiklių, kurie gali būti vartojami ateities
medicinoje.
Rekomenduojama literatūra norintiems išsamiau susipažinti su enzimologijos mokslo istorija:

1. Kornberg A. (1989) For the Love of Enzymes. The Odyssey of a Biochemist, „Harvard Uni-
versity Press“, Cambridge, MA.
2. Werth B. (1994) The Billion Dollar Molecule, „Simon & Schuster“, New York.

8
 2. Fermentinės katalizės cheminiai mechanizmai

Pagrindinis fermentų vaidmuo fiziologiniuose procesuose – žymiai pagreitinti ląstelėse vykstan-

čias chemines reakcijas. Tai labai saviti katalizatoriai – vienų ar kitų fermentų molekulės pagreitina tik
tam tikras chemines reakcijas. Fermentinių reakcijų metu susidaro įvairūs produktai. Šios dvi savybės
suteikia fermentams galimybę efektyviai ir suderintai vykdyti ląstelėse metabolizmą.
Šiame skyriuje nagrinėjami mechanizmai, kuriais fermentai greitina reakcijas ir turi didelį savitu-
mą substratams. Fermentų molekulės, turėdamos trimatę struktūrą, prisijungia substratus, kurių prisi-
jungimo vieta fermento molekulėje vadinama aktyviuoju centru. Taigi aktyviajame centre yra chemi-
nės reaktyvios grupės, susidarančios iš aminorūgščių bei prijungtų kofaktorių. Šių cheminių grupių
išsidėstymas aktyviajame centre sukuria tam tikrą aktyvaus centro topologiją, kuriai būdinga ypatinga
stereochemija, hidrofobiškumas ir elektrostatinė būsena. Visa tai ir lemia, kad aktyviajame centre pri-
jungtos substratų molekulės yra paverčiamos reakcijos produktais. Evoliucijos eigoje fermentų akty-
vieji centrai prisiderino prie substratų molekulių struktūros taip, kad sąveikos metu substrato moleku-
lėse sukuriamos tam tikros būsenos, kurios vadinamos pereinamosiomis būsenomis. Sąveikos su fer-
mentu metu substratai yra stabilizuojami pereinamojoje būsenoje. Substratų molekulės, esančios perei-
namojoje būsenoje, tirpaluose paprastai yra nestabilios. Vykstant fermentinei reakcijai, pereinamosios
būsenos pasiekimui reikia žymiai mažiau energijos ir tai suteikia fermentams galimybę greitinti reakci-
jas.

2.1. Kur, kodėl ir kaip reikalinga katalizė

Fermentų katalizinė galia yra stulbinanti. 2 lentelėje pateikta keletas fermentų katalizinės galios
pavyzdžių [1–5].

2 lentelė. Fermentų katalizinė galia

Fermentai kkat/knekat
Orotidino 5′-fosfato dekarboksilazė 1,4 × 1017
Fumarazė 3,5 × 1015
Karboksipeptidazė B 1,3 × 1013
AMP nukleozidazė 6,0 × 1012
Adenozino deaminazė 2,1 × 1012
Citidino deaminazė 1,2 × 1012
Ketosteroidų izomerazė 3,9 × 1011
Fosfotriesterazė 2,8 × 1011
Triozių fosfatų izomerazė 1,0 × 109
Karboanhidrazė 7,7 × 106
Chorizmato mutazė 1,9 × 106
Ciklofilinas (rotamazė) 4,6 × 105

9
 Ypatinga orotidino 5′-fosfato dekarboksilinimo reakcija. Neutraliuose vandeniniuose tirpaluose
kambario temperatūroje šios reakcijos puslaikis t1/2 yra 78 milijonai metų. Orotidino 5′-fosfato dekar-
boksilazė, prisijungusi orotidino 5′-fosfatą aktyviajame centre, pagreitina dekarboksilinimo reakciją
1017 kartų. Kaip ir kokiu būdu fermentai padidina cheminių reakcijų greitį ir kur slypi jų milžiniška
katalizinė galia? Norėdami sužinoti, kodėl fermentai yra tokie efektyvūs katalizatoriai, pirmiausia tū-
rėtume išsiaiškinti, kodėl nekatalizuojamos reakcijos tirpaluose vyksta lėtai. Pažvelkime į esterių ir
acetalių hidrolizės reakcijas, kurias gali katalizuoti chimotripsinas ir lizocimas. Nekatalizuojamose es-
terių hidrolizės reakcijose vandens molekulių atakos metu susidaro pereinamoji būsena, kurioje susida-
ro teigiamas krūvis vandens molekulėje ir neigiamas krūvis esterio molekulės karbonilo grupės deguo-
nies atome:

O
O
-

R' C
R' C
OR
OR

O 
O
H H H H
PB

Nekatalizuojamose acetalių hidrolizės reakcijose susidaro pereinamoji būsena, kurios struktūra yra
artima oksokarbenio ir alkoksido jonų struktūroms:

O O
 
-

OR OR

PB

Abiem atvejais pereinamosiose būsenose susidarę krūviai yra nestabilūs ir ji gali labai greitai suir-
ti. Stabilizavus šiuos krūvius, vyktų katalizė, kurios metu sumažinama pereinamosios būsenos energi-
ja. Esterių hidrolizės reakcijose vandens molekulėje susidaręs teigiamas krūvis gali būti stabilizuoja-
mas prijungus protoną prie kokios nors bazės:

O
O
-

R' C
R' C
OR
OR

O O
H H H H
-O
O 
CCH3 CCH3
O O PB

Bendroji bazinė katalizė acetato jonais

Tai vadinama bendrąja bazine katalize. Panašiai gali būti stabilizuojamas ir neigiamas krūvis, su-
sidaręs acetalių hidrolizės metu, tik šiuo atveju nuo kokios nors rūgšties yra prijungiamas protonas:
10
 O
O
OR 
OR

H
H
O
-

O
CCH3
CCH3
O
O PB

Bendroji rūgštinė katalizė acto rūgštimi

Tai vadinama bendrąja rūgštine katalize.

Pereinamosiose būsenose teigiami ir neigiami krūviai gali būti stabilizuojami elektrostatinės kata-
lizės metu, pvz., teigiamai įkrautas oksokarbenio jonas negali būti stabilizuojamas bendrąja baze, nes
jis nesijonizuoja, tačiau gali būti stabilizuojamas neigiamai įkrauto karboksilato jono elektros lauku.
Neigiamus krūvius gali stabilizuoti teigiamai įkrauti metalų jonai, pvz., Zn2+ ar Mg2+. Neigiamų krūvių
stabilizavimas, pvz., elektrono, vyksta elektrofilinės katalizės metu.
Bendrosios rūgštinės-bazinės, elektrostatinės ir elektrofilinės katalizės metu yra stabilizuojama pe-
reinamoji būsena nesikeičiant reakcijos mechanizmui. Tačiau kai kuriais atvejais katalizės metu gali
kisti reakcijos eiga, pvz., acilgrupės pernašos ar hidrolizės reakcijų nukleofilinės katalizės metu. Pa-
vyzdžiui, acto rūgšties anhidrido hidrolizės reakcija katalizuojama piridinu. Reakcijos metu greitai su-
sidaro labai reaktyvus acetilpiridino jonas, kuris antroje reakcijos stadijoje yra hidrolizuojamas:

O O
CH3C C
O
O CH3 H2O
+ -
C N 2 CH3CO2 + + NH
N
H3C
+
-
CH3CO2

Tam kad nukleofilinė katalizė būtų efektyvi, katalizatoriaus nukleofiliškumas turi būti didesnis už
reakcijos metu atsiskiriančios grupės nukleofiliškumą, o susidaręs tarpinis junginys reaktyvesnis už
pradines reaguojančias medžiagas. Nukleofilinės katalizės metu substratų molekulės modifikuojamos
susidarant kovalentiniam ryšiui su fermentu – tai kovalentinė katalizė. Elektrofilinės katalizės metu
taip pat gali susidaryti tarpiniai kovalentiniai junginiai, pvz., elektronų neigiamas krūvis stabilizuoja-
mas piridoksalio fosfato, tiamino difosfato fermentų katalizuojamose reakcijose.
Tam, kad daugiamolekulinėse reakcijose susidarytų pereinamoji būsena, kelios skirtingų substratų
molekulės turi susidurti tarpusavyje. Be to, kad šie susidūrimai būtų produktyvūs, molekulės turi būti
reikiamai orientuotos viena kitos atžvilgiu. Šie veiksniai lėtina reakcijas, taigi šiuo atveju ypatingą ver-
tę įgauna vidumolekulinė katalizė ir entropijos pokyčiai.

11
 2.2. Fermentų aktyviųjų centrų ir substratų molekulių komplementarumas

Baltymo molekulės jungimasis su kokiu nors ligandu, susidarant kompleksui, yra termodinamiškai
nepalankus procesas, palyginti su laisvu baltymu ir laisvu ligandu, esančiu tirpale. Tokia sistema, ku-
rioje yra susidaręs kompleksas, turi būti palaikoma tam tikrų jėgų, kurios stabilizuoja baltymo-ligando
sąveiką: vandeniliniai ryšiai, hidrofobinė, van der Waals, elektrostatinė sąveikos ir kt. Visos šios jėgos
įneša tam tikrą įnašą į bendrą sąveikos energiją, susidarant kompleksui, ir kompensuoja rotacinės ir
transliacinės entropijos netekimą jam susidarant. Tos pačios jėgos veikia ir tada, kai fermentai susiriša
su savo substratų molekulėmis. Žinoma, kad fermento-substrato komplekso susidarymas yra pirmasis
etapas fermentais katalizuojamose reakcijose. Susidarius pradiniam kompleksui (fermento-substrato,
ES arba Michaelio kompleksas), fermento aktyviajame centre vyksta procesai, kurių metu susidaro re-
akcijos pereinamosios būsenos kompleksas (ES ‡) ir fermento-produkto kompleksas (EP), kuris suskyla
į fermento ir produkto molekules. Ks yra pradinio fermento-substrato komplekso disociacijos konstan-
ta. Fermento-substrato komplekso skilimo greitis dažnai aprašomas jungtine greičio konstanta kkat. kkat
konstantos skaitinė vertė dažniausiai priklauso nuo pereinamosios būsenos ES‡ susidarymo greičio.
Pati paprasčiausia schema, aprašanti fermentinę reakciją, pateikiama 2 pav.

Ks kkat
E + S ES E + P
‡
Gs G
kkat /Ks
‡
E + S ES
‡
Ea = GPB

2 pav. Bendroji fermentinės reakcijos schema

Įvairių fermentų aktyvieji centrai yra unikalūs, tačiau galima padaryti tam tikrus apibendrinimus:
A. Fermento aktyvusis centras yra santykinai mažesnis už bendrą fermento molekulės dydį.
B. Fermento aktyvusis centras yra trimatės struktūros: aktyviajame centre aminorūgščių šoninės
grupės ir kofaktoriai yra išsidėstę tiksliai tam tikra tvarka vienas kito ir prijungtos substrato mo-
lekulės atžvilgiu. Aktyviojo centro struktūra susidaro formuojantis baltymo tretinei struktūrai.
C. Pradinė sąveika tarp fermento ir substrato molekulių dažniausiai yra nekovalentinė, susidarant
vandeniliniams ryšiams, elektrostatinei bei hidrofobinei sąveikoms ir van der Waals jėgoms.
D. Fermento aktyvusis centras dažniausiai yra tam tikra įdauba ar plyšys baltymo molekulėje. To-
kia aktyviojo centro struktūra išstumia iš jo tirpiklio (vandens) molekules, kurios paprastai su-
mažina fermento katalizinį aktyvumą. Kitaip tariant, įvyksta substrato molekulių desolvatacija
ir substrato molekulės fermento aktyviajame centre yra apsaugotos nuo aplink esančių tirpiklio
molekulių. Solvatacija vandeniu pakeičiama solvatacija baltymu.

12
 E. Funkcinių grupių išsidėstymas aktyviajame centre yra komplementarus substrato molekulių
struktūrai.
ES komplekso susidarymo mechanizmai pradėti tyrinėti 19 a. pabaigoje. Šio komplekso susida-
rymas pastebėtas tiriant fermentų stabilumą, fermentinių reakcijų slopinimą ir nuostoviosios būsenos
kinetiką. Tuo metu Emilis Fišeris pasiūlė „rakto ir spynos“ modelį (3 pav.).

Viršus Viršus

Šonas Šonas

3 pav. Fermento ir substrato sąveikos „rakto ir spynos“ modelis

Pagal šį modelį fermento aktyvusis centras ir substrato molekulė yra statinės, nelanksčios struktū-
ros. Substratas susiriša su fermento aktyviuoju centru taip, kaip raktas su spyna, t.y. substrato moleku-
lės struktūra visiškai atitinka aktyviojo centro struktūrą. Tokios sąveikos metu turi būti stereocheminis
substrato ir aktyviojo centro atitikimas bei elektrostatinis jų komplementarumas, sumažinantis arba
pašalinantis atostūmio jėgas. Be to, abi šios struktūros turi atitikti hidrofobinės sąveikos bei vandenili-
nių ryšių atžvilgiu. Tai labai sustiprina fermento ir substrato sąveiką. Taigi fermentinė katalizė daž-
niausiai yra stereomeriškai, regionomeriškai ir enantiomeriškai selektyvi.
Substrato prisijungimui prie fermento reikia mažiausiai trijų kontaktinių taškų, pvz., alkoholio
dehidrogenazė, katalizuojanti etilo alkoholio oksidaciją, redukuojant NAD+ kofermentą ir susidarant
NADH ir acetaldehidui. Šios reakcijos metu hidridas (H -) atskeliamas nuo etanolio metileno grupės ir
prijungiamas prie NAD+ ketvirtojo anglies atomo [6, 7]. Panaudojus etanolį, kuriame metileno grupės
vandenilio atomai pakeisti deuteriu, alkoholio dehidrogenazė perneša tik pro-R vandenilio atomą. To-
kie tyrimai parodė, kad alkoholis prisijungia fermento aktyviajame centre stereosavitai ir šioje sąveiko-
je dalyvauja jo metilo, hidroksilo grupės ir pro-R vandenilio atomas. Susidaro trijų taškų sąveika su
aktyviojo centro grupėmis ( 4 pav.).
Alkoholio dehidrogenazės aktyviajame centre etanolio pro-R vandenilio atomas yra šalia NAD+
kofermento. Trijų sąveikos taškų hipotezė dažnai taikoma įvairių fermentinių reakcijų stereosavitumui
paaiškinti.

13
 4 pav. Etanolio ir NAD+ išsidėstymas alkoholio dehidrogenazės aktyviajame centre
Taikant „rakto ir spynos“ ir „trijų sąveikos taškų“ modelį, galima paaiškinti fermentų savitumą ir
struktūrinį komplementarumą tarp fermento aktyviojo centro ir substrato molekulių. Tačiau šis modelis
nerodo, kokios formos turi būti substratų molekulės, kurių struktūros yra komplementarios fermentų
aktyviesiems centrams. Sukūrus pereinamosios būsenos teoriją [8], įrodyta, kad fermentų aktyvieji
centrai yra komplementarūs substratų, esančių pereinamojoje būsenoje, struktūroms, pvz., slopiklių
molekulės, kurių struktūra yra artima pereinamosios būsenos substratų struktūrai, prisijungia prie fer-
mento žymiai tvirčiau nei pats substratas ar produktas. Mokslininkai teigia, kad fermentų katalizinė
galia pasireiškia stabilizuojant substratų struktūras, esančias pereinamojoje būsenoje [9]. Manoma, kad
susidarant pradiniams kompleksams, substratų molekulės, esančios bazinėse būsenose, turi būti gimi-
ningos fermentų molekulėms ir ši sąveikos energija turėtų būti panaudojama pereinamosios būsenos
susidarymui [10]. Daugybė eksperimentų akivaizdžiai rodo fermentų aktyviųjų centrų komplementa-
rumą pereinamosios būsenos substratų molekulėms ir tai yra fermentų savitumo bei katalizinės galios
pagrindas. Nuostoviosios būsenos kinetiniai tyrimai, matuojant konstantos kkat/KM vertes, leido nusta-
tyti įvairių fermentinių sistemų savitumą skirtingiems substratams. Šiais tyrimais nustatyta, kad įvairių
substratų KM vertės skiriasi nežymiai, dažniausiai 10 kartų ar net mažiau. Fermentinių reakcijų kkat
konstantų skaitinės vertės rodo, ar substratai „geri“, ar „blogi“. Taigi fermentų savitumas substratams
slypi jų struktūros, esančios pereinamojoje būsenoje, giminingume aktyviesiems centrams.

2.3. Pereinamosios būsenos susidarymas

1998 m. Cannon ir Benkovic pasiūlė alternatyvų konformaciniams pokyčiams fermentų veiklos

modelį, pagal kurį fermentų aktyvieji centrai yra tokios struktūros, kuri optimaliai komplementari pe-
reinamosios būsenos substratų molekulėms. Šis modelis yra panašus į Fišerio pasiūlytą „rakto“ ir
„spynos“ modelį. Fermentinių reakcijų termodinaminių ir kinetinių konstantų apskaičiavimui Cannon
ir Benkovic pasiūlė šią schemą:

14
 knekat
E+S E + S‡

K=1 KPB

E+S ES ES‡
KM kkat

Komplekso ES‡ disociacijos konstanta KPB yra lygi konstantų (kkat/KM)/knekat santykiui, čia knekat
yra substrato pereinamosios būsenos susidarymo greičio konstanta reakcijoje be katalizatoriaus. Ka-
dangi fermentų aktyvusis centras yra komplementarus pereinamosios būsenos substratų molekulėms,
todėl įprastai konstanta KPB yra žymiai mažesnė už Ks ir laisvosios energijos pokytis, susidarant ES‡,
yra didelis. Fermento aktyviajame centre jungiantis S‡ arba S, laisvųjų energijų skirtumus galima pa-
aiškinti dvejopai. Pirma, fermento aktyviajame centre pereinamosios būsenos substratų molekulės S‡
jungiasi žymiai tvirčiau nei S molekulės. Kai kuriems fermentams tai yra nustatyta. Antra, kad tirpale
iš S susidarytų S‡, turi įvykti S molekulių desolvatacija. Tirpiklio molekulės stipriau sąveikauja su
substrato S forma nei su S‡, todėl pereinamosios būsenos susidarymo metu S molekulių desolvatacijai
reikia sunaudoti daug energijos. Fermentų aktyviuosiuose centruose S molekulės yra desolvatuotos.
Taip sumažinamas su substratų solvatacija susijęs energetinis barjeras susidarant pereinamajai būsenai
S‡ . Cannon ir Benkovic teigia, kad fermentinėje katalizėje realizuojami abu šie būdai, tačiau su subst-
ratų solvatacija susijusio energetinio barjero sumažinimas yra pereinamosios būsenos susidarymo va-
romoji jėga. Jie palygino įvairių fermentinių pirmojo ir pseudopirmojo laipsnio reakcijų bei atitinkamų
modelinių reakcijų tirpaluose disociacijos konstantų KPB ir greičio konstantų kkat bei knekat vertes. Jeigu
fermentinių reakcijų varomoji jėga būtų tvirtas pereinamosios būsenos substrato molekulių S‡ prisijun-
gimas aktyviajame centre, tai kuo mažesnės disociacijos konstantų KPB vertės, tuo didesnės būtų kons-
tantų kkat vertės. Jeigu fermentinės reakcijos varomoji jėga būtų su substratų solvatacija susijusio ener-
getinio barjero sumažinimas, tai fermentinių reakcijų, kurių konstantų KPB vertės yra mažos, analogiš-
kos reakcijos tirpaluose turėtų vykti labai lėtai (konstantų knekat vertės turėtų būti mažos). Konstantų
palyginimas parodė neigiamą koreliaciją tarp KPB ir knekat, o koreliacijos tarp KPB ir kkat negauta. Pada-
ryta išvada, kad reakcijų, vykstančių tirpaluose, kinetinės savybės ir substratų molekulių solvatacija
yra lemiami veiksniai, sąlygojantys konstantos KPB vertę.
Cheminėse reakcijose, vykstančiose tirpaluose, susidarant pereinamajai būsenai, vyksta ryškūs
pokyčiai reaguojančių molekulių solvatacijoje, ir tai lėtina reakcijas. Cheminės reakcijos greitis prik-
lauso nuo terpės dielektrinių savybių ir poliškumo. Fermentų aktyvieji centrai yra labai hidrofobiški ir
jų dielektrinės konstantos yra mažos, tačiau dažnai juose yra įvairių įkrautų cheminių grupių, kurios
sukuria stiprius elektros laukus. Tai įgalina fermentų molekules elektrostatiškai sąveikauti su pereina-
mosios būsenos substratais ir taip pašalinti aukščiau aprašytą tirpiklio įtaką. Cannon ir Benkovic įrodė,
kad fermentų aktyviųjų centrų konformaciniai pokyčiai vyksta lėtai, palyginti su fermentinių reakcijų
15
greičiais, todėl tai būtų papildomas barjeras reakcijoje. Tiesa, cheminių ryšių virpėjimo dažnis (1014-
1013 s-1) derinasi su fermentinių reakcijų greičiais ir yra svarbus susidarant naujiems ryšiams, kai
substratai jungiasi aktyviuosiuose centruose.
Fermentų aktyviuosiuose centruose esančios rūgštinės/bazinės grupės, vandenilinius ryšius suda-
ryti gebančios grupės, aktyvūs nukleofilai ir kt. destabilizuoja pereinamosios būsenos substratų mo-
lekules. Kadangi aktyvieji centrai yra komplementarūs pereinamosios būsenos substratams, fermentai
pagreitina reakcijas žymiai sumažindami energijos kiekį, reikalingą substratų pereinamąjai būsenai su-
sidaryti reakcijos metu, o ne stabilizuodami pereinamąją būseną, tvirtai prijungdami substratų moleku-
les aktyviuosiuose centruose.

2.4. Substratų pereinamosios būsenos stabilizavimas fermentų

aktyviuosiuose centruose

Cheminės reakcijos, kurių metu molekulės S (substratai) virsta molekulėmis P (produktai) vyksta
pereinant substrato struktūrai į daug energijos ir trumpą gyvavimo laiką (skilimo puslaikis ~10 -13 s)
turinčią būseną, kuri vadinama pereinamąja būsena (S‡). Reakcijos pradžioje tirpale įvyksta fermento
ir substrato molekulių sąveika, kurios metu susidaro nestabilus Michaelio kompleksas ES. Įprastai, re-
akcijos pusiausvyra yra palanki tokio komplekso susidarymui. ES susidarymo G apytikriai lygi nuo -
3 iki -12 kcal/mol. Pradžioje susidaręs ES kompleksas vėliau virsta pereinamosios būsenos kompleksu
ES‡. Tokio pereinamosios būsenos komplekso susidarymui reikia energijos. Įveikus šį energetinį barje-
rą, labiausiai tikėtina, kad reakcija vyks išsiskiriant energijai. Fermentu katalizuojamoje reakcijoje su-
sidaro EP kompleksas, kuris suskyla į produkto ir aktyvaus fermento molekules. Taigi aktyvus fermen-
tas yra abiejuose reakcijos pusėse (tiek reaguojančių medžiagų, tiek produktų pusėse) ir reakcijos ter-
modinaminiu požiūriu jis išlieka nepakitęs. Taigi reakcijos laisvoji energija priklauso vien tik nuo san-
tykinių S ir P koncentracijų:

 [ P] 
G   RT ln   . (2.1)
 [S] 
Ši G išraiška yra tokia pati kaip ir nekatalizuojamai reakcijai S  P ir tai reiškia, kad G funkci-
ja nepriklauso nuo vykstančios reakcijos kelio. Kitaip tariant, G vertė priklauso vien tik nuo reakcijos
pradinės ir galutinės būsenų, bet nepriklauso nuo įvairių reakcijos tarpinių būsenų (pvz., ES, ES ‡ ir
EP). Galima teigti, kad reakcijos metu fermentai nekeičia pusiausvyros tarp produktų ir substratų.
Tuomet kokia gi yra fermentų svarba cheminėje reakcijoje? Į tai galima atsakyti taip, kad fermentai,
kaip ir visi katalizatoriai, sutrumpina laiką, reikalingą pusiausvyrai pasiekti cheminėse sistemose: fer-
mentai didina cheminių reakcijų greitį. Ši fermentų savybė yra svarbiausia ląstelėse vykstančiuose me-
taboliniuose procesuose.

16
 Kokiu būdu fermentai pagreitina reakcijas? Į šį klausimą galima atsakyti apibrėžiant cheminių re-
akcijų aktyvacijos energiją. Fermentai sumažina cheminės reakcijos aktyvacijos energijos barjerą,
stabilizuodami substratų ir produktų molekules pereinamojoje būsenoje. Substratų sunaudojimo grei-
tis, υ, priklauso nuo reakcijos aktyvacijos energijos:

 d [S]  k BT   E 
υ   [S] exp   a  . (2.2)
dt  h   RT 
Kai temperatūra 25C ir [S] vertė lygi 1 (santykiniai vienetai), o RT=0,59 ir kBT/h=6,21012s-1 ir
reakcijos aktyvacijos energija 10 kcal/mol, tai reakcijos greitis υ=6,21012s-1 .1 (santykinis vienetas) e-
10/0,59
= 2,7105 (santykinių vienetų) s-1. Jeigu aktyvacijos energija sumažėtų iki 5 kcal/mol, tai tuomet
υ=6,21012s-11 (santykinis vienetas) e-5/0,59 = 1,3109 (santykinių vienetų)  s-1. Aktyvacijos energijai
sumažėjus 5 kcal/mol, reakcijos greitis padidėjo apie 5000 kartų! Tiesiškai mažėjant aktyvacijos ener-
gijai, reakcijos greitis didėja eksponentiškai. Taip būtent ir veikia fermentai. Jie padidina cheminių re-
akcijų greitį, stabilizuodami substratus ir produktus pereinamojoje būsenoje, taip sumažindami energe-
tinį barjerą.
Panagrinėkime nekatalizuojamų ir katalizuojamų cheminių reakcijų energetiką. Fermentinėse re-
akcijose galima išmatuoti laisvosios energijos pokyčius, susijusius su skirtingomis reakcijos būseno-
mis, esančiomis pusiausvyroje. Jeigu pradiniame E + S reakcijos etape laisvąją energiją prilygintume
0, tuomet galėtume sužinoti laisvosios energijos pokytį susidarant ES ‡ (kai substrato perteklius reakci-
jos mišinyje). Laisvosios energijos pokytis lygus:

k  k T 
Ea  ΔGES‡   RT ln  kat   RT ln  B  . (2.3)
 Ks   h 
ES komplekso susidarymo laisvosios energijos pokytis gali būti apskaičiuotas žinant konstantos Ks
vertę pusiausvyros sąlygomis, arba tiriant reakcijos kinetiką:

 1 
ΔGES   RT ln   . (2.4)
 Ks 
Laisvosios energijos pokytis, susijęs su kkat, gali būti apskaičiuotas pagal Eyring lygtį, kai reakcija
vyksta nuostoviosios būsenos sąlygomis:

 k T  
ΔGkkat  RT  ln  B   ln( k kat )  (2.5)
  h  
GES vertė gaunama atėmus (2.5) lygtį iš (2.3) lygties. Taigi visos reakcijos aktyvacijos energija Ea
susideda iš dviejų dalių – GES ir Gkkat . Gkkat rodo energijos kiekį, kuris reikalingas pereinamajai

būsenai susidaryti (ryšių susidarymui ir jų suardymui), tuo tarpu GES – energijos kiekis, kuris išsiski-
ria jungiantis substratui su fermentu [11].

17
 Laisvosios energijos pokytis, susijęs su EP kompleksu, randamas tiriant reakcijos pusiausvyrą ar-
ba fermentų aktyvumo slopinimą susidarančiais produktais, kai reakcija vyksta nuostoviosios būsenos
sąlygomis. Be to, katalizuojamai ir nekatalizuojamai reakcijoms aktyvacijos energija gali būti randama
pagal Arenijaus lygtį, tiriant reakcijos greičio priklausomybę nuo temperatūros:

  Ea 
k kat  A exp  . (2.6)
 RT 
Pažymėtina, kad nekatalizuojamai reakcijai (2.6) lygtyje kkat pakeičiama reakcijos pirmojo laips-
nio greičio konstantos verte.
Nekatalizuojamų cheminių ir katalizuojamų fermentinių reakcijų eigą galima atvaizduoti sudarant
reakcijų energetines diagramas, kurios pavaizduotos 5 pav.

[S] > Ks
S‡

ES‡
Laisvoji energija

ΔGES‡ ΔGk kat EP

E+S
ΔGES

ES
E+P

Reakcijos eiga

5 pav. Nekatalizuojamų ir fermentinių reakcijų energetinės diagramos

Reakcijose, be fermentų, daug energijos sunaudojama energetiniam barjerui nugalėti ir pereinama-
jai būsenai S ‡ susidaryti. Fermentinėse reakcijose pirmiausia susidaro ES kompleksai. Šie kompleksai
yra tarpiniai junginiai, kurių nėra nekatalizuojamose reakcijose. ES komplekso susidarymo metu išsis-
kyrusi energija (sąveikos energija) gali būti panaudota pereinamajai būsenai pasiekti. Susijungus subst-
ratui su fermentu, destabilizuojama substrato molekulių pagrindinės būsenos konfigūracija, o tai ener-
getiškai palanku siekiant pereinamosios būsenos. ES‡ susidarymui reikia mažiau energijos nei S‡. To-
liau reakcija vyksta susidarant kitai tarpinei būsenai – fermento-produkto kompleksui EP, kuris susky-
la susidarant produkto ir fermento molekulėms. Taigi pradinės ir galinės reakcijos stadijos energetiškai
yra identiškos katalizuojamose ir nekatalizuojamose reakcijose, tačiau bendras aktyvacijos energijos
barjeras fermentinėse reakcijose yra žymiai sumažinamas. Sumažėjus aktyvacijos energijos barjerui,
labai padidėja reakcijos greitis (2.2 lygtis). Reakcijų pagreitinimui tokią strategiją naudoja visi fermen-
tai.

18
 Fermentai padidina cheminių reakcijų greitį, stabilizuodami substratus ir produktus pereinamojoje
būsenoje ir taip sumažindami reakcijos aktyvacijos energijos barjerą.

2.5. Hamondo postulatas

Hamondo (1955 m.) teigimu, jeigu reakcijos metu susidaro nestabilus tarpinis junginys, tai jo
struktūra yra artima pereinamosios būsenos struktūrai. Šiuo postulatu remiamasi tiriant molekulių
struktūros ir reaktyvumo tarpusavio ryšį. Nestabilaus tarpinio junginio energetinė būsena yra labai ar-
tima pereinamajai būsenai ir reakcijos eigos energetinėje diagramoje ji užima nedidelę įdubą kreivės
viršūnėje (6 pav.).

Pereinamoji būsena

Tarpinis junginys

Reakcijos eiga

6 pav. Reakcijos eigos energetinė diagrama. Pereinamosios būsenos energija yra didžiausia. Nes-
tabilaus tarpinio junginio energetinė būsena yra nedidelėje įduboje

I II III

PB3
PB1

PB2
G A
B

A
B
B
A

Reakcijos eiga

7 pav. I – endoterminė reakcija; junginio struktūra, pereinamojoje būsenoje esančio PB1, artima
produkto B struktūrai; II – silpnai egzoterminė reakcija, kurios aktyvacijos energetinis barjeras
pakankamai aukštas; junginio struktūra pereinamojoje būsenoje esančio PB2 nėra artima A ir B
struktūroms; III – stipriai egzoterminė reakcija; junginio struktūra pereinamojoje būsenoje esančio
PB3 artima A struktūrai

19
 Hamondo postulatas taikomas vienmolekulinėms reakcijoms. Dvimolekulinėms reakcijoms šio
postulato tiesiogiai taikyti negalima, nes dvimolekulinių reakcijų metu pereinamoji būsena susidaro
jungiantis skirtingoms molekulėms, o reakcijos laisvosios energijos pokyčio priežastis yra entropijos
sumažėjimas. Jeigu reakcijos metu susidariusio produkto molekulės yra nestabilios, tai pagal Hamondo
postulatą jų struktūra yra artima pereinamajai būsenai. Tai taikytina ir reaguojančių substratų moleku-
lėms (7 pav.).
Hamondo postulatas remiasi tuo, kad reakcijos energetinėje diagramoje substratų, tarpinių reakci-
jos junginių ir produktų laisvosios energijos vertės yra U-formos energetinėse įdubose (8 pav.). Šios
U-įdubos yra parabolės formos. Hamondo postulato cheminis pagrindas paaiškėja nubraižius reakcijos
eigos diagramą, kurioje pavaizduotos substrato ir reakcijos produkto energetinės parabolės (8 pav.).

‡
G S' ‡
G
G ‡
S

r
Reakcijos eiga (r)

8 pav. Hamondo efektas. Substrato ir produkto Gibso laisvosios energijos kreivės (juodos linijos)
susikerta taške, atitinkančiame reakcijos pereinamąją būseną (‡). Pakeitus substrato S struktūrą į
S′, jo molekulės destabilizuojamos ir susidaro nauja energetinė būsena (raudona kreivė). Ji su pro-
dukto kreive susikerta pereinamosios būsenos taške (‡), kurio laisvosios energijos vertė yra arti-
mesnė S′ būsenos energijai nei S laisvoji energija pereinamajai būsenai (‡)
Substratų S ir S′ energetinės kreivės susikerta su produkto P energetine kreive taškuose, atitinkan-
čiuose reakcijos pereinamąsias būsenas (8 pav.). Truputį pakeitus substrato struktūrą, jo laisvosios e-
nergijos vertė padidėja G dydžiu, o pereinamosios būsenos (‡) laisvosios energijos vertė tampa di-
desnė už pereinamosios būsenos (‡) vertę. Pereinamoji būsena (‡) pasiekiama greičiau nei būsena (‡).
Kuo substrato molekulės nestabilesnės, tuo jų struktūra yra artimesnė pereinamosios būsenos struktū-
rai. Pasikeitus substratų molekulių energetinei būsenai, G verte, G‡ verte pakinta ir aktyvacijos
laisvoji energija. G‡ pokyčio dydis priklauso nuo kreivių formos ir susikirtimo taško padėties.
G‡/G santykis vadinamas Brenstedo  koeficientu. Nežymiai kintant G, jis yra pastovusis dy-
dis. Taigi stebima tiesinė priklausomybė tarp pusiausvyros laisvosios energijos ir aktyvacijos laisvo-
sios energijos pokyčių. Paprastoms reakcijoms koeficiento vertė kinta intervale nuo 0 iki 1. Brenste-

20
do koeficientas rodo, kokiu mastu pereinamojoje būsenoje yra suirę senieji cheminiai ryšiai ir susidarę
naujieji.

2.6. Pereinamosios būsenos stabilizavimo cheminiai mechanizmai

Pereinamojoje būsenoje substratų ir produktų molekulės yra stabilizuojamos fermento aktyviaja-

me centre. Šiai būsenai stabilizuoti fermentai naudoja tam tikrus cheminius mechanizmus, kurie gali
būti suskirstyti į keturis tipus [12]:
a) reaguojančių medžiagų molekulių suartinimas;
b) kovalentinė katalizė;
c) bendroji rūgštinė-bazinė katalizė;
d) konformaciniai pokyčiai.
Aukščiau išvardytus mechanizmus aptarsime atskirai, tačiau reikia pabrėžti, kad fermentinės reak-
cijos metu gali pasireikšti keletas ar net visi išvardyti efektai. Dažnai šie efektai persidengia, todėl nub-
rėžti griežtas linijas tarp jų sudėtinga.

2.6.1. Reaguojančių molekulių suartinimas

Substratų molekulės, patekusios į fermento aktyvųjį centrą, yra suartinamos ir taip šalia viena ki-
tos atsiduria ir jų reaktyvios grupės, pvz., dvimolekulinė reakcija: reaguoja A ir B substratų molekulės
ir susidaro kovalentinis junginys A–B. Kai šios molekulės reaguoja tirpale, tai pirmiausia: 1) jų tarpu-
savio susidūrimų skaičių lemia difuzijos greitis, be to, šie susidūrimai turi būti orientuoti tam tikra
kryptimi; 2) turi pasikeisti reaguojančių substratų solvatacija, kad galėtų persidengti jų molekulinės
orbitalės; 3) reikia įveikti van der Waals atostūmio jėgas; 4) turi įvykti tam tikri pokyčiai reaguojančių
molekulių elektroninėse orbitalėse, kad būtų pasiekta pereinamoji būseną. Tirpaluose vykstančių reak-
cijų greitį sąlygoja reaguojančių substratų susidūrimų dažnis. Jis žymiai padidėja keliant temperatūrą
arba didinant reaguojančių medžiagų koncentraciją. Fermentų aktyviuosiuose centruose substratų mo-
lekulės yra sukoncentruojamos ir taip jų efektyvioji koncentracija labai padidėja.
Kita reaguojančių substratų molekulių suartinimo svarba yra ta, kad aktyviajame centre substratai
yra savitai orientuojami. Daugumoje dvimolekulinių reakcijų abi substratų molekulės orientuojamos
taip, kad pereinamoji būsena būtų pasiekiama lengviausiai. Tirpaluose substratų molekulės įvairiai o-
rientuotos ir tai mažina reakcijos greitį. Žinoma, kad tam tikri erdviniai ir orientaciniai ribojimai, esan-
tys fermento aktyviajame centre, yra susiję su reakcijos entropiniais pokyčiais, kurie suteikia pranašu-
mą reakcijoms, vykstančioms aktyviuosiuose centruose. Vykstant reakcijai tarp dviejų substrato mo-
lekulių, esančių aktyviajame centre, dideli entropijos pokyčiai yra eliminuojami ir fermentinėje katali-
zėje tai kompensuojama substrato ir fermento sąveikos energija, išsiskiriančią susidarant ES komplek-
sui. Taigi substratų koncentravimo ir orientavimo efektai fermentų aktyviuosiuose centruose apibrė-
žiami kaip giminingumas arba suartinimas.

21
 Šių efektų vertė išryškėja sulyginus tokių pat vidumolekulinių ir tarpmolekulinių reakcijų greičius
[13]. Fersht ir Kirby sulygino greičius vidumolekulinės aspirino hidrolizės, katalizuojamos vidinio
karboksilato, ir tokios pat reakcijos, katalizuojamos tirpale esančiais acetato jonais (9 pav.).

Vidumolekulinė reakcija

Tarpmolekulinė reakcija

9 pav. Aspirino hidrolizės vidumolekulinė ir tarpmolekulinė katalizė

Aspirino hidrolizės pirmojo laipsnio vidumolekulinės reakcijos greičio konstanta k1=1,110-5 s-1, o
antrojo laipsnio reakcijos, katalizuojamos acetato jonais, esančiais tirpale, – k2=1,2710-6 M-1s-1. Suly-
ginus šių reakcijų greičius, galima būtų sužinoti, kokia turėtų būti acetato jonų koncentracija tirpale,
kad tarpmolekulinės reakcijos greitis pasiektų vidumolekulinės reakcijos greitį. Tai galima būtų rasti iš
k1/k2 santykio. Koncentracija būtų 8,7 M, tačiau acetatas yra labiau bazinis (pKr 4,76) nei aspirino kar-
boksilatas (pKr 3,69). Įvertinus tai, efektyviąją acetato jonų koncentraciją gauname 13 M. Taigi vidu-
molekulinė reakcija vyksta žymiai greičiau nei tarpmolekulinė reakcija tirpale.
Fiksuojant substratų molekules fermentų aktyviuosiuose centruose, vyksta reaguojančių medžiagų
molekulių orbitalių orientavimas. Orbitalių orientavimo hipotezė teigia, kad substrato ir fermento ak-
tyviojo centro reaktyvių grupių suartinimo nepakanka efektyviai katalizei pasiekti. Fermento aktyvia-
jame centre turi būti labai tiksliai orientuojamos substrato molekulių molekulinės orbitalės. Pagal šią
hipotezę fermento aktyviajame centre esančios grupės evoliucionavo kryptimi, užtikrinančia optimalų
substrato molekulių orbitalių orientavimą. Be abejonės, fermentinės katalizės metu vyksta substrato
molekulių molekulinių orbitalių orientavimas, tačiau yra bent du argumentai, kurie prieštarauja šio
reiškinio pagrindiniam vaidmeniui, stabilizuojant pereinamąją būseną: 1) substrato molekulių, esančių
aktyviajame centre, šiluminiai virpesiai turi padidinti orientacinius pokyčius, tačiau fiziologinėje tem-
peratūroje nustatyta tokių virpesių amplitudė prieštarauja teiginiui, kad substrato molekulinės orbitalės
yra labai tiksliai orientuotos aktyviajame centre; 2) tiriant molekulinių orbitalių orientavimą, nustatyta,
kad Morsė kreivėje gaunamas lėkštas energijos minimumo profilis, o pagal molekulinių orbitalių o-
rientavimo hipotezę jis turėtų būti gilus ir siauras, kad būtų galima tiksliai orientuoti orbitales. M.L.
Bender darbe pateikta daug argumentų už ir prieš molekulinių orbitalių labai tikslaus orientavimo hi-
potezę [14].

22
 Reakcijos metu vyksta ir tam tikri substratų solvatacijos pokyčiai. Tirpale vykstančiai reakcijai
desolvatacijos energija gali būti dideliu energetiniu barjeru. Fermentinėse reakcijose reaguojančių me-
džiagų desolvatacija vyksta jungiantis substratams prie aktyviajame centre esančių hidrofobinių vietų.
Taip substratų molekulės apsaugomos nuo aplinkoje esančio tirpiklio. Desolvatacija kompensuojama
sąveikos tarp fermento ir substrato energija ir neturi įtakos fermentinės reakcijos aktyvacijos energijos
barjerui [12].
Van der Waals atostūmio jėgų nugalėjimas yra labai svarbus vidumolekulinių ir fermentinių reak-
cijų požymis. Tai pasiekiama orientaciniais efektais bei indukuojant tam tikras įtampas reaguojančių
substratų molekulėse.
Visi aprašyti reiškiniai pasireiškia substrato molekulėms jungiantis prie aktyviojo centro. Suarti-
nimo efektai padidina fermentinės reakcijos greitį susidarant įvairioms sąveikoms tarp fermento ir
substrato molekulių, kurios yra reakcijos varomosios jėgos.

2.6.2. Kovalentinė katalizė

Daug yra fermentinių reakcijų, kurios vyksta susidarant tarpiniam kovalentiniam junginiui tarp
fermento ir substrato molekulių. Tokie tarpiniai kovalentiniai junginiai aptikti atliekant kinetinius ma-
tavimus, išskirti ir identifikuoti, o jų struktūros nustatytos rentgenostruktūrinės kristalografinės anali-
zės metodais. Tarpiniai kovalentiniai junginiai susidaro veikiant serino peptidazėms (acil-serinas), cis-
teino peptidazėms (acil-cisteinas), baltymų kinazėms ir fosfatazėms (fosforilintos aminorūgštys), piri-
doksalio fosfato fermentams (piridoksalio fosfato ir aminorūgščių Šifo bazės).

35

30

25
[p-Nitrofenolis] (μM)

20

15

10

0
0 2 4 6 8 10 12 14
Laikas (min.)

10 pav. Fermentinės reakcijos „protrūkis“. p-nitrofeniletilkarbonato hidrolizė chimotripsinu susi-

darant p-nitrofenoliui. Chimotripsino koncentracija: 8 (▲), 16 (), 24 (◆), 32 (■) M. Reakcijos
pradžioje, ypač esant didesnėms fermento koncentracijoms, įvyksta reakcijos „protrūkis“ [15]

Šių fermentų veikloje tokių tarpinių kovalentinių junginių susidarymas yra būtina reakcijos stadi-
ja, kuri sumažina aktyvacijos energetinį barjerą. Reakcija vyksta dviem etapais: a) tarpinio kovalenti-
nio junginio susidarymas; b) šio junginio suirimas. Fermentinės reakcijos greitį ribojančios stadijos

23
dažniausiai yra tarpinio kovalentinio komplekso susidarymas arba jo suirimas. 10 pav. pavaizduotos p-
nitrofeniletilkarbonato hidrolizės chimotripsinu kinetinės kreivės.
Nustatomas p-nitrofeniletilkarbonato hidrolizės reakcijos greitis esant įvairioms fermento koncent-
racijoms. Reakcijos greitis didėja didinant fermento koncentraciją, tačiau kinetinės kreivės susikerta su
y ašimi ne nuliniame taške, o atkertamos ant y ašies atkarpos dydis priklauso nuo fermento koncentra-
cijos. Atkertama ant y ašies atkarpos vertė atitinka fermento aktyviųjų centrų koncentraciją tirpale.
Fermentinės reakcijos pradžioje įvyksta staigus reakcijos „protrūkis“, kurio metu stechiometriškai su-
sidaro tarpinis kovalentinis acil-fermento junginys ir reakcijos produktas. Tokio tarpinio junginio susi-
darymas įvyksta labai greitai, tačiau jo suirimas yra pakankamai lėtas ir ribojantis viso proceso greitį.
Taigi p-nitrofeniletilkarbonato hidrolizės fermentinė reakcija vyksta labai greitai susidarant tarpiniam
kovalentiniam acil-chimotripsino junginiui ir pakankamai lėtai jam yrant.
Fermentinėse reakcijose tarpiniai kovalentiniai junginiai dažniausiai susidaro nukleofilinės ir e-
lektrofilinės katalizės metu.

2.6.2.1. Nukleofilinė katalizė

Nukleofilinių reakcijų metu formuojantis kovalentiniam ryšiui pereinamojoje būsenoje, fermento

aktyviajame centre esanti nukleofilinė grupė perneša elektronus substrato molekulei:

+ 
Nuk: + Sub Nuk Sub

Nukleofilinės reakcijos greitis priklauso nuo atakuojančio nukleofilo stiprumo ir nuo substrato
molekulėje esančios elektrofilinės grupės jautrumo atakai (atsiskiriančios grupės prigimties). Atakuo-
jančių grupių nukleofiliškumą lemia įvairūs veiksniai; vienas pagrindinių veiksnių yra grupės baziš-
kumas. Baziškumas – tai dydis, rodantis gebėjimą pernešti elektronų porą protonui. Nukleofilinių re-
akcijų greičių konstantų vertės gerai dera su nukleofilų pKr vertėmis. Struktūriškai panašiems nukleofi-
lams braižant antrojo laipsnio greičio konstantų (k2) logaritmų priklausomybės nuo nukleofilų pKr ver-
čių grafikus, gaunamos tiesinės priklausomybės (11 pav.).

2
Logk2

-2

-4

0 2 4 6 8 10 12 14
pKτ

11 pav. p-nitrofenilacetato nukleofilinės atakos imidazolo junginiais (■) ir fenoliatais () Brenste-
do grafikas. Kitaip nei bendrojoje bazinėje katalizėje tokio paties baziškumo N- ir O- nukleofilai
pasižymi skirtingomis savybėmis [16]
24
 Brenstedo grafikai pirmiausia buvo panaudoti tiriant reakcijos greičio priklausomybę nuo pKr ver-
čių bendrojoje rūgštinėje-bazinėje katalizėje. Kiti veiksniai, sąlygojantys nukleofilų stiprumą, yra ok-
sidacinis potencialas, gebėjimas poliarizuotis, jonizuojamasis potencialas, elektroneigiamumas, aukš-
čiausios užpildytos molekulinės orbitalės energija, kovalentinio ryšio stiprumas ir pačios grupės dydis.
Taigi, nukleofilinės reakcijos greitis priklauso ne tik nuo nukleofilo pKr, bet ir nuo jo cheminės
prigimties [6, 17]. Tai yra pagrindinis skirtumas tarp nukleofilinės katalizės ir bendrosios bazinės kata-
lizės, kurios metu reakcijos greitis priklauso nuo bendrųjų bazių pKr verčių ir nepriklauso nuo jų pri-
gimties. Nukleofilinės katalizės metu tarp nukleofilo ir substrato molekulių susidaro kovalentinis
ryšys. Labai dažnai šį tarpinį kovalentinį junginį galima išskirti ir identifikuoti.
Elektrofilų jautrumas nukleofilinėse reakcijose yra sąlygotas keleto veiksnių. Pagrindinis veiksnys
yra atsiskiriančios grupės protonizacijos laipsnis. Matuojant įvairių nukleofilinių reakcijų greičius, kai
reaguoja vienas ir tas pats nukleofilas su skirtingais substratais, turinčiais įvairias atsiskiriančias gru-
pes, nustatytas ryšys tarp reakcijos greičio ir atsiskiriančių grupių pKr verčių. Įarodyta, jog kuo silp-
nesnės atsiskiriančios grupės bazinės savybės, tuo ši grupė lengviau atsiskiria. Kaip ir įvairių nukleofi-
lų atveju atsiskiriančios grupės prigimtis taip pat reikšminga katalizėje.
Fermentinėje nukleofilinėje katalizėje nukleofilinės grupės dažniausiai yra fermento aktyviajame
centre esančios aminorūgštys. Tikėtina, kad kuo baziškesnės aminorūgštys, tuo stipresnėmis nukleofi-
linėmis savybėmis pasižymi, tačiau daugumas fermentų veikia siaurame pH verčių intervale (pH~ 7,4)
ir tai riboja fermento molekulėje esančių grupių nukleofiliškumo priklausomybę nuo jų pKr verčių,
pvz., arginino guanidino grupė galėtų būti stipriu nukleofilu (pKr 12,5), tačiau pagal Hendersono-
Haselbalcho lygtį, esant fiziologinei pH vertei (pvz., 7,4), ši grupė yra protonizuotos konjuguotos rūgš-
ties formos ir negali veikti kaip nukleofilas fermentinėje katalizėje. Serinas, treoninas, cisteinas, aspar-
tatas, glutamatas, lizinas, histidinas ir tirozinas yra nukleofilinės aminorūgštys. 3 lentelėje pateikiamos
fermentų nukleofilinės grupės ir reakcijų metu susidarantys tarpiniai kovalentiniai junginiai.

3 lentelė. Fermentų nukleofilinės grupės ir reakcijų metu susidarantys tarpiniai kovalentiniai jun-
giniai [18]
Nuleofilinė grupė Fermentas Tarpinis kovalentinis junginys
Serinas (–OH) Serino peptidazės Acil-fermentas
Cisteinas (–SH) Tiolinės peptidazės Acil-fermentas
Aspartatas (–COO )-
ATPazės Fosforil-fermentas
Lizinas (–NH2) Piridoksalio fosfato fermentai Šifo bazės
Histidinas Fosfoglicerato mutazė Fosforil-fermentas
Tirozinas (–OH) Glutamino sintazė Adenil-fermentas

2.6.2.2. Elektrofilinė katalizė

Elektrofilinės katalizės metu tarp fermento katijoninės elektrofilinės grupės ir elektronais turtingos
substrato molekulės grupės susidaro kovalentinis ryšys. Kadangi aminorūgščių šoninės grupės nepasi-
žymi geromis elektrofilinėmis savybėmis, fermentinėje elektrofilinėje katalizėje dažnai naudojami į-
25
vairūs organiniai kofaktoriai arba metalų jonai. Yra labai daug fermentų, kurių aktyviuosiuose centruo-
se metalų jonai atlieka elektrofilinio katalizatoriaus vaidmenį. Fermentinėje katalizėje metalai ekra-
nuoja substratų molekulėse esančius neigiamus krūvius ir taip sustiprina nukleofilinę ataką. Be to, me-
talų jonai gali sustiprinti tam tikros grupės reaktyvumą, patraukdami elektronus bei sujungdami subst-
ratų molekules ir nukleofilines grupes. Metalų jonai gali pakeisti šalia esančių nukleofilinių grupių pKr
vertes ir reaktyvumą. Kai kurie fermentai metalų jonus naudoja substratų molekulių prijungimui, pvz.,
daugelyje citochromų heme esanti geležis prisijungia substratų molekules prie vieno iš šešių koordi-
nuojančių ryšių ir taip palengvina elektronų pernešimą substratams. Metalų jonai, prisijungę prie subst-
ratų molekulių, gali pakeisti substratų konformaciją ir taip sustiprinti katalizę. ATP vartojančios bal-
tymų kinazės (fermentai, pernešantys -fosfato grupę nuo ATP ant baltymo molekulės) reakcijoje nau-
doja ne ATP, bet ATP-Mg2+ kompleksą. Prie ATP molekulės galinių fosfatų prisijungęs Mg 2+, ekra-
nuodamas neigiamus krūvius, palengvina nukleofilinę ataką į -fosforo atomą.
Dažnai fermentinės elektrofilinės katalizės metu substrato molekulė sąveikauja su katalizine grupe
ir šios sąveikos metu susidaro elektrofilas, turintis katijoninį azoto atomą. Azoto atomas nėra pakan-
kamai stiprus elektrofilas, tačiau jis gali būti labai lengvai protonizuojamas arba gali sudaryti neso-
čiuosius katijoninius junginius. Šie junginiai yra efektyvios elektronų talpyklos. Tokių elektrofilinių
reakcijų pavyzdžiai – fermentinės reakcijos, kuriose dalyvauja piridoksalio fosfatas. Jis yra būtinas į-
vairiose -aminorūgščių apykaitos reakcijose. Piridoksalio fosfato fermentai katalizuoja reakcijas,
vykstančias prie  ir  anglies atomų. Šių reakcijų metu tarp aminorūgščių ir kofermento susidaro
katijoninis iminas (Šifo bazė):

R
O
+N
H
OH
2-
O4P O
+ H2N R 2-
O4P
+
N Aminas +
H N
H
Piridoksalio
Piridoksalio fosfatas
fosfatas Šifo bazė
Šifo bazė
Reakcijos metu Šifo bazės susidarymas sumažina reikalingą aktyvacijos energijos kiekį. Piridok-
salio fosfatas veikia kaip elektronų talpykla, stabilizuodamas susidariusį karbanijono tarpinį junginį.
Nuo prijungtos aminorūgšties  anglies atomo jis atitraukia elektronus katijoninio azoto link ir taip
aktyvuoja visas tris padėtis aminorūgšties molekulėje. Kadangi katijoninis iminas yra konjuguojamas
su heteroaromatiniu piridino žiedu, įvyksta žymus krūvio persiskirstymas ir piridoksalio fosfatas tampa
labai efektyviu elektrofiliniu katalizatoriumi. Visi piridoksalio fosfato fermentai veikia per tris pagrin-
dines stadijas: a) katijoninio imino susidarymas; b) cheminiai pokyčiai susidarant tarpiniam karbanijo-
nui; c) produkto imino hidrolizė. Reaguojant piridoksalio fosfatui su -aminorūgštimis, pašalinamas
-vandenilio atomas, susidarant pagrindiniam tarpiniam junginiui, kuris toliau, priklausomai nuo fer-
26
mento prigimties, gali dalyvauti peramininimo, racemizacijos, dekarboksilinimo, šoninės grupės pakei-
timo reakcijose (12 pav.) [19].

A
(A) B H
R CO2-
C

O
H +N
H
OH R CO2-
2-
O4P C 2-
O-
+ O4P
+
N NH3+ +
H N
H

R CO2-
C

+N
HC H
+
H 2-
O-
O4P
..
N
H

(B)
B

R CO2- R CO2-
C C
+
BH
+N +N
HC H H2C H H2O
O- 2-
O-
2- O4P
O4P
.. +
N N
H H

NH3+
CH2
- O
O
2-
O4P
+
+ R CO2-
N
H

12 pav. Elektrofilinė katalizė piridoksalio fosfatu: A – -vandenilio atomo pašalinimas; B – pe-

ramininimo reakcijos pirmoji stadija

Peramininimo reakcijoje (12 pav.), pašalinus -vandenilio atomą, įvyksta protono prijungimas
prie piridoksalio fosfato karbonilo grupės anglies atomo, susidarant -ketorūgšties-piridoksamino
fosfato Šifo bazei. Hidrolizuojant šį junginį, gaunama -ketorūgštis ir piridoksamino fosfatas. Toliau
reaguojant piridoksamino fosfatui ir ketorūgščiai, susidaro iminas ir, prisijungus protonui, gaunama
nauja aminorūgštis bei regeneruojamas piridoksalio fosfatas. Taip baigiasi vienas katalizinis ciklas.
4 lentelėje pateikiami fermentinės elektrofilinės katalizės pavyzdžiai.

27
 4 lentelė. Elektrofilinė katalizė fermentinėse reakcijose
Fermentas Elektrofilas
Acetoacetato dekarboksilazė Lizino-substrato Šifo bazė
Aldolazė Lizino-substrato Šifo bazė
Aspartato aminotransferazė Piridoksalio fosfatas
Karboanhidrazė Zn2+
L-obuolių rūgšties fermentas Mn2+
Piruvato dekarboksilazė Tiamino difosfatas

2.6.3. Bendroji rūgštinė-bazinė katalizė

Beveik kiekvienoje fermentinėje reakcijoje vyksta protonų pernaša, kuriai būtinos įvairių junginių
rūgštinės ir bazinės grupės. Kai kuriose fermentinėse reakcijose protonai, susidarę iš hidronio jono
H3O+, ir hidroksido jonai OH - patys veikia kaip rūgštinės ir bazinės grupės, katalizuojančios reakciją.
Tai vadinama savitąja rūgštine-bazine katalize. Tačiau dažniausiai fermentinėse reakcijose substratų,
kofaktorių ar aminorūgščių šoninės grupės atlieka rūgšties ar bazės vaidmenį, veikdamos kaip
Brenstedo-Loury rūgštys ir bazės. Tai vadinama bendrąja rūgštine-bazine katalize.
Cheminėse reakcijose, katalizuojamose mažų molekulių, bendrąją rūgštinę-bazinę katalizę galima
atskirti nuo savitosios rūgštinės-bazinės katalizės, tiriant rūgščių ar bazių koncentracijų įtaką reakcijos
greičiui. Esant bendrajai rūgštinei-bazinei katalizei, reakcijos greitis priklauso nuo bendrosios rūgšties
ar bazės koncentracijos, o savitosios rūgštinės-bazinės katalizės atveju, priešingai – reakcijos greitis
nepriklauso nuo koncentracijos (13 pav.).

1,0
Bendroji rūgštinė-bazinė
0,8 katalizė
Reakcijos greitis

0,6

0,4
Savitoji rūgštinė-bazinė
0,2 katalizė

0,0
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Rūgšties/Bazės koncentracija

13 pav. Reakcijos greičio priklausomybė nuo rūgšties ar bazės koncentracijos bendrojoje rūgštinė-
je-bazinėje ir savitojoje rūgštinėje-bazinėje katalizėje
Daugelyje fermentinių reakcijų vyksta bendroji rūgštinė-bazinė katalizė, tačiau pakankamai sunku
nustatyti rūgštinių ar bazinių grupių koncentracijų įtaką reakcijos greičiui, nes šios grupės yra fermento
molekulės aktyviajame centre. Esančios fermentų aktyviuosiuose centruose svarbios katalizėje bendro-

28
sios rūgštinės ar bazinės grupės nustatomos keliais būdais: tiriant reakcijos terpės pH įtaką reakcijos
greičiui; chemiškai modifikuojant aminorūgščių liekanas; kryptingos mutagenezės būdu; rentge-
nostruktūrinės kristalografinės analizės metodu.
Bendrosios rūgštys yra aktyvios terpėje, kurios pH mažesnis už atitinkamų rūgščių pKr vertes, o
bendrosios bazės – kai terpės pH didesnis už jų pKr vertes. Taigi, reakcijos greičio priklausomybės nuo
terpės pH grafikai yra sigmoidiniai ir panašūs į titravimo kreives (14 pav.).

1 A 1
B
0,8 0,8
Reakcijos greitis

Reakcijos greitis
0,6 0,6

0,4 0,4

0,2 0,2

0 0
3 4 5 6 7 8 9 3 4 5 6 7 8 9
pH pH
14 pav. Bendrosios bazinės katalizės (A) ir bendrosios rūgštinės katalizės (B) reakcijų greičių
priklausomybė nuo terpės pH
Log k (k – reakcijos greičio konstanta) priklausomybės nuo terpės pH grafikas yra tiesinis. Ši
empirinė priklausomybė išreiškiama Brenstedo lygtimis bendrajai rūgštinei (2.7 lygtis) ir bendrajai ba-
zinei katalizei (2.8 lygtis):

log k  A  αpK r . (2.7)

log k  A  βpK r . (2.8)
Brenstedo lygtyse A yra konstanta, kurios vertė priklauso nuo reakcijos prigimties, α ir β vertės
rodo rūgšties ar konjuguotos bazės efektyvumą katalizėje. Brenstedo lygtis bendrajai bazinei katalizei
yra panaši į lygtį, aprašančią nukleofilinę katalizę. Tačiau priešingai nukleofilinei katalizei bendrosios
bazinės katalizės efektyvumas priklauso vien nuo katalizatoriaus pKr ir nepriklauso nuo katalizinės
grupės prigimties (11 pav.).
Brenstedo lygtis rodo, kad kuo stipresnė rūgštis, tuo ji efektyvesnė bendrojoje rūgštinėje katalizė-
je. Kuo stipresnė bazė, tuo ji efektyvesnė bazinėje katalizėje. Tačiau reikėtų pabrėžti, kad katalizės e-
fektyvumas taip pat priklauso nuo rūgšties ir bazės koncentracijų santykio reakcijos mišinyje. Šis kon-
centracijų santykis savo ruožtu priklauso nuo katalizatorių pKr verčių ir reakcijos mišinio pH, pvz., pa-
gal Brenstedo lygtį rūgštis, kurios pKr 5, turėtų būti efektyvesnė nei bendroji rūgštis, kurios pKr 7. Jei-
gu reakcijos mišinio pH 7, tai tik 1proc. stipresnės rūgšties (pKr 5) yra rūgštinėje formoje, o 99 proc.
jos yra konjuguotos bazės formos. Tuo tarpu silpnesnės rūgšties (pKr 7) šiame reakcijos mišinyje yra
50 proc. rūgštinės formos. Taigi šiuo atveju silpnesnė rūgštis yra efektyvesnis katalizatorius. Todėl ga-
lima teigti, kad reakcijos, katalizuojamos bendrąja rūgštimi / baze, greitis didžiausias, kai reakcijos mi-
šinio pH yra artimas katalizinių grupių pKr vertėms. Dėl to fermentų aktyviuosiuose centruose randa-
29
mos tik tos rūgštinės / bazinės grupės, kurių pKr vertės yra artimos fiziologinei pH vertei (7,4). Tik tos
aminorūgščių šoninės grupės, kurių pKr vertės yra nuo 4 iki 10, gali dalyvauti bendrojoje rūgštinėje-
bazinėje katalizėje. Fermentų molekulėse aspartato, glutamato, histidino, cisteino, tirozino ir lizino šo-
ninės grupės bei N- ir C-galinės aminorūgštys geriausiai tinka bendrajai rūgštinei-bazinei katalizei.
Būtina pažymėti, kad aminorūgščių šoninių grupių pKr vertės labai priklauso nuo aplinkos, esančios
fermentų aktyviuosiuose centruose, pvz., papaino 159 histidino pKr vertė 3,4, o lizocimo 35 glutamo
rūgšties pKr 6,5.
Bendrosios rūgštinės-bazinės katalizės esmė yra tai, jog katalizinė grupė dalyvauja protonų perna-
šoje, kuri stabilizuoja cheminės reakcijos pereinamąją būseną. Pavyzdžiu galėtų būti fermentinė esterių
hidrolizė. Esterių hidrolizės metu turi susidaryti pereinamoji būsena, kurioje krūvis iš dalies pasiskirsto
tarp esterio ir vandens molekulių (15 pav.). Ši pereinamoji būsena gali būti stabilizuojama bazine gru-
pe (B:), kuri veikia kaip vandens molekulės protono akceptorius, taip padidindama dalinio teigiamo
krūvio stabilumą joje (15 B pav.). Kita vertus, pereinamoji būsena gali būti stabilizuojama rūgštine
grupe (A-H), kuri yra protonų donoras esterio karbonilo grupės deguonies atomui (15 A pav.).

(A)
A (B)
B
A H
 -  -

C C
R OR' R OR'
+ +
O O
H H H H

..
B

15 pav. Esterinio ryšio hidrolizės reakcijos pereinamosios būsenos stabilizavimas bendrąja rūgš-
timi (A) ir bendrąja baze (B)
Toks rūgštinis / bazinis pereinamosios būsenos stabilizavimas yra dažnas fermentinėje katalizėje,
pvz., serino peptidazėse aktyviojo centro histidino liekana taip stabilizuoja peptidų hidrolizės reakcijos
pereinamąją būseną.
Fermentinių reakcijų pereinamoji būsena gali būti stabilizuojama tiek bendrosios rūgštinės-
bazinės, tiek nukleofilinės katalizės metu. Abu šie mechanizmai yra kinetiškai panašūs, todėl iškyla jų
atpažinimo problema. Šiems mechanizmams nustatyti M.L. Bender siūlo tokius kriterijus [14]:
1. Jeigu atsiskiriančioji grupė gali pati katalizuoti vykstančią reakciją, tuomet vyrauja bendroji
bazinė katalizė, pvz,

O O
B
+ H2O + HB
R B R OH
Jeigu šios reakcijos metu vyktų B molekulių nukleofilinė ataka į karbonilo grupę, tai reakcijos
produktas būtų buvęs toks pat kaip pradinis reaguojantis junginys. Taigi B veikia kaip bendro-
ji bazė.
30
 2. Jei katalizatorius sąveikauja su substratu stechiometriškai, tai vyksta nukleofilinė katalizė.
Stechiometriškumo nėra bendrosios bazinės katalizės metu.
3. Jei reakcijos metu susidaro tarpinis kovalentinis junginys, tuomet vyksta nukleofilinė katalizė.
Jei tokio junginio nėra, tai bendroji bazinė katalizė.
4. Bendrosios bazinės katalizės metu katalizatoriaus efektyvumas priklauso tik nuo jo bazišku-
mo ir nepriklauso nuo jo prigimties. Priešingai, nukleofilinių katalizatorių efektyvumas prik-
lauso nuo jų prigimties. Kitaip tariant, jei to paties baziškumo, bet skirtingos struktūros katali-
zatoriai skiriasi savo efektyvumu, tai tuomet vyksta nukleofilinė katalizė. Tai galima nustatyti
braižant Brenstedo grafikus.
5. Erdviniai trukdžiai nereikšmingi bendrojoje bazinėje katalizėje, tačiau labai svarbūs nukleofi-
linėje katalizėje. Taip yra todėl, kad bendroji bazė sąveikauja tik su protonu, o nukleofilinis
katalizatorius atakuoja anglies atomą, be to, dar apsuptą įvairių cheminių grupių.
6. Jeigu reakcija sulėtėja, kai į reakcijos mišinį papildomai pridedama reakcijos metu susidaran-
čių jonų, tai vyksta nukleofilinė katalizė. Reakcija lėtėja, nes turi susidaryti tarpinis kovalenti-
nis junginys, pvz., piridinu katalizuojama acto rūgšties anhidrido hidrolizės reakcija, kurios
metu susidaro acetato jonai:

O O O O
+ + +
H3C O CH3 H3C N
N H3C O
acetato jonas
Acetato jonas

O
H2O
+
H3C OH N

Acetato jonų pridėjimas į reakcijos mišinį labai sulėtina reakciją. Piridinas yra šios reakcijos nuk-
leofilinis katalizatorius.

2.6.4. Konformaciniai pokyčiai

Fermentų veiklos efektyvumo negalima paaiškinti vien reaguojančių medžiagų molekulių suarti-
nimu, kovalentine katalize ir rūgštine-bazine katalize. Gerai žinoma, kad, veikiant daugumai baltymų,
tarp jų ir fermentų reakcijos metu susidarant pereinamajai būsenai, stebimi konformaciniai substratų ir
fermentų pokyčiai. 16 pav. parodyti konformaciniai pokyčiai, vykstantys cheminio ryšio suardymo re-
akcijoje.

31
 E ES ES

S 1 2 3

A+B
EP ES‡

A B

5 4

16 pav. Fermento ir substrato sąveikos modelis: 1) fermento ir substrato molekulės reakcijos mi-
šinyje; 2) substrato patekimas į aktyvųjį centrą; 3) fermento aktyviojo centro kataliziškai aktyvios
konformacijos susidarymas (indukuotas atitikimas); 4) fermento aktyviojo centro konformaciniai
pokyčiai, indukuojantys deformacijas substrato molekulėje (pereinamosios būsenos susidarymas);
5) susidarius įtampoms substrato molekulėje, suardomas cheminis ryšys ir gaunami reakcijos pro-
duktai A ir B

Reakcijos metu fermento aktyvusis centras keletą kartų keičia savo konformaciją ir tai sąlygoja
konformacinius substrato molekulės pokyčius – palengvina cheminio ryšio suardymą [20]. Nustatyta,
kad fermentinių reakcijų metu vykstantys konformaciniai pokyčiai turi įtakos reakcijos substratiniam
savitumui. Substrato molekulių savitumo matas yra antrojo laipsnio greičio konstanta kkat/KM. KM ver-
tės rodo fermentų giminingumą substratams, esant jų pertekliui. Tiriant fermentų katalizinį efektyvumą
(kkat/KM), rasta, kad katalizinių konstantų kkat vertės yra labai skirtingos substratams, kurių KM panašios.
Šie duomenys gauti tiriant sintetinių peptidų hidrolizę pepsinu [14]. Gauti rezultatai pateikiami 5 lente-
lėje.

5 lentelė. Sintetinių peptidų hidrolizės pepsinu nuostoviosios būsenos sąlygomis KM, kkat ir kkat /
KM konstantų vertės
Peptidasa KM (mM) kkat (s-1) kkat /KM (mM-1 s-1)
Kbz-G-H-F-F-OEt 0,8 2,4300 3,04000
Kbz-H-F-W-OEt 0,2 0,5100 2,55000
Kbz-H-F-F-OEt 0,2 0,3100 1,55000
Kbz-H-F-Y-OEt 0,2 0,1600 0,80000
Kbz-H-Y-F-OEt 0,7 0,0130 0,01860
Kbz-H-Y-Y-OEt 0,2 0,0094 0,04700
Kbz-H-F-L-OMe 0,6 0,0025 0,00417
a
Kbz – benziloksikarbonilo grupė; OEt – etilo esteris; OMe – metilo esteris

5 lentelėje pateikiami duomenys rodo, jog įvairių peptidų hidrolizės reakcijoje pepsinu katalizinis
efektyvumas (kkat/KM) skiriasi daugiau kaip 1000 kartų. Nors sintetinių peptidų KM vertės yra panašios,
t.y. skirtumas tik keturi kartai, kkat skiriasi daugiau nei 1000 kartų. Akivaizdu, kad peptido, turinčio di-
džiausią KM vertę, hidrolizė vyksta greičiausiai, o tai reiškia, kad fermento ir substrato sąveikos savi-
tumas turi mažą įtaką fermentinės reakcijos efektyvumui. Panašūs rezultatai buvo gauti tiriant kitų

32
fermentų ir jų substratų sąveiką. Nustatyta, kad fermentai veikia efektyviausiai, sąveikaudami su subst-
ratais, turinčiais pereinamosios būsenos struktūrą.
Panašūs duomenys gauti kryptingos mutagenezės metodu tiriant fermentą tirozil-tRNR sintetazę,
kuris prijungia aminorūgštį tiroziną prie tRNR [21]. Šio fermento veiklai reikalingas ATP, o reakcijos
metu fermento aktyviajame centre susidaro tirozil-AMP pereinamoji būsena. Žinodamas pereinamo-
sios būsenos komplekso erdvinę struktūrą, Leatherbarrow postulavo, kad katalizėje svarbiausios turėtų
būti dviejų aminorūgščių liekanos: Thr 40 ir His 45. Kryptingos mutagenezės būdu buvo sukonstruoti
trys skirtingi tirozil-tRNR sintetazės mutantai: Thr 40-Ala; His 45-Gly ir dvigubas mutantas Thr 40-
Ala/His 45-Gly. Mutantinių fermentų kinetiniai parametrai buvo palyginti su gamtinės tirozil-tRNR
sintetazės parametrais. Nustatyta, kad mutantinių fermentų konstantos Ks vertės tirozinui ir ATP be-
veik nesiskyrė nuo gamtinės tirozil-tRNR sintetazės Ks verčių (didžiausias skirtumas keturi kartai), o
tuo tarpu kkat labai pasikeitė. Gamtinės tirozil-tRNR sintetazės katalizinės konstantos kkat vertė yra 38 s-
1
. His 45-Gly mutanto kkat vertė buvo 0,16 s-1, Thr 40-Ala mutanto – 0,0055 s-1, o dvigubo mutanto –
0,00012 s-1. Šie duomenys rodo, kad fermento aktyviajame centre esančios aminorūgščių Thr 40 ir His
45 liekanos ypač yra svarbios fermento sąveikai su tirozil-ATP, esančia pereinamojoje būsenoje, ir
nereikšmingos prijungiant tiroziną ir ATP aktyviajame centre.
1969 m. Jencks įrodė, kad fermentinei reakcijai vykstant priešinga kryptimi (grįžtamoji reakcija),
yra būtini ES komplekso konformaciniai pokyčiai. Jis tyrė grįžtamąją fermentinę reakciją, kurios metu
buvo stebima nukleofilinė ataka į substrato molekulėje esančią cheminę grupę. Fermento aktyvųjį
centrą galima įsivaizduoti kaip tam tikros konformaciškai stabilios struktūros ertmę, kuri atitinka
substrato molekulės struktūrą. Tuomet, patekus substrato molekulei į aktyvųjį centrą, atstumą tarp nuk-
leofilinio atomo, esančio fermento molekulėje ir atakuojamo anglies atomo substrato molekulėje, nu-
lems tarpusavyje sąveikaujančių atomų van der Waals spinduliai. Esant tokiai standžiai ir nesikeičian-
čiai aktyviojo centro struktūrai, reakcijos metu susidariusio produkto molekulių struktūra negalėtų ati-
tikti aktyviojo centro struktūros. Tokiu atveju fermento–produkto kompleksas būtų destabilizuojamas,
palyginti su fermento–substrato kompleksu, ir tuomet būtų prarasta dalis sąveikos energijos. Norėdama
šito išvengti, fermento molekulė privalėtų taip deformuoti susidariusio produkto molekules, kad jų
struktūra būtų kuo panašesnė į substrato molekulių struktūrą, o tai sukurtų palankias sąlygas vykti grįž-
tamajai reakcijai. Jeigu fermento aktyviojo centro struktūra atitiktų tik reakcijos produkto molekulių
struktūrą, tai tuomet substrato molekulės sunkiau patektų į aktyvųjį centrą, o tai sumažintų tiesioginės
reakcijos greitį. Efektyviai pagreitinti tiesiogines ir grįžtamąsias reakcijas fermentai gali tik tuomet, kai
aktyviojo centro struktūra atitinka struktūrą, tarpinę tarp substrato ir produkto – tai pereinamosios
būsenos struktūra. Remiantis aukščiau minėtais argumentais ir eksperimentiniais duomenimis, mano-
ma, kad fermento ir substrato sąveikos metu vyksta konformaciniai pokyčiai, kurių metu susidaro pe-
reinamoji būsena. Sukurti trys modeliai, aiškinantys konformacinių pokyčių svarbą fermentinėje kata-

33
lizėje: indukuoto atitikimo modelis; neproduktyvaus prisijungimo modelis; indukuotų deformacijų mo-
delis.
1958 m. Košlandas paskelbė indukuoto atitikimo modelį, pagal kurį fermento aktyvusis centras
nėra stabilios nesikeičiančios struktūros. Košlandas teigė, kad tais atvejais kai reakcijos mišinyje nėra
substrato molekulių, tai fermento aktyvusis centras yra katalizei nepalankioje konformacijoje. Patekus
į tokį aktyvųjį centrą „geram“ substratui, sąveikos energija yra panaudojama aktyviojo centro konfor-
maciniam pokyčiui. Nors toks konformacinis pokytis energetiškai yra nepalankus, tačiau tik tuomet
aktyvusis centras įgauna kataliziškai aktyvią konformaciją (16 pav.). „Blogų“ substratų molekulės, ne-
būdamos reikiamos struktūros, negali indukuoti aktyviojo centro konformacinių pokyčių ir tuomet
fermentinė reakcija nevyksta. Pagal šį modelį, vykstant fermentinei reakcijai, optimalus reakcijos Vmax
yra pasiekiamas tik su tais substratais, su kuriais sąveikaujant lengviausiai pakinta aktyviojo centro
konformacija.
Neproduktyvaus prisijungimo modelis teigia, kad fermento aktyvusis centras yra stabilios ir nesi-
keičiančios struktūros. „Geri“ substratai yra tokie, kurie komplementarūs atitinkamoms aktyviojo cent-
ro vietoms ir yra savitai orientuoti. Kitokios struktūros ar konformacijos substratų molekulės taip pat
gali patekti į aktyvųjį centrą, tačiau jų prisijungimas bus neproduktyvus. Pagal šį modelį „blogų“
substratų molekulėse nėra atitinkamų funkcinių grupių, kurios yra būtinos tinkamam prisijungimui ak-
tyviajame centre, arba tos grupės yra katalizei nepalankiose padėtyse (17 pav.). Fermentinėse reakcijo-
se su „blogais“ substratais Vmax vertė yra maža, nes didžioji molekulių dalis prisijungia aktyviajame
centre neproduktyviai. Neproduktyvaus prisijungimo modelis dažnai naudojamas aprašyti fermentinių
reakcijų lėtinimą, esant didelei substrato koncentracijai.

17 pav. Neproduktyvaus prisijungimo modelis. „Geri“ substratai turi tinkamai orientuotas chemi-
nes grupes, kurios yra būtinos produktyviai sąveikai su fermentu (A). „Blogi“ substratai, neturė-
dami reikiamų funkcinių grupių, aktyviajame centre gali būti prijungiami labai įvairiai (C, D), ta-
čiau tik viena konformacija yra kataliziškai aktyvi (B). Neproduktyvus substratų prisijungimas lė-
tina fermentinę reakciją
34
 Indukuotų deformacijų modelis teigia, kad sąveikos jėgos tarp substratų ir fermentų yra tiesiogiai
panaudojamos substratų molekulėms deformuoti. Taip pasiekiama reakcijos pereinamoji būsena. Tei-
giama, kad stabiliausia fermento aktyviojo centro konformacija yra ta, kuri komplementari substratų
molekulėms, esančioms pereinamojoje būsenoje. Reakcijos metu aktyviajame centre prisijungus subst-
rato molekulei, susidaro fermento ir substrato kompleksas ES, kurio struktūra labai greitai persitvarko
susidarant pereinamajai būsenai ES‡. Atrodytų, kad šis modelis yra labai panašus į indukuoto atitikimo
modelį, tačiau pagal indukuotų deformacijų modelį fermento ir substrato sąveikos energija yra tiesio-
giai panaudojama reakcijos aktyvacijos energijai mažinti, keičiantis aktyviojo centro konformacijai ir
deformuojantis substrato molekulei (18 pav.).

E ES

S 1
2

A+B

EP ES‡

A B

4 3

18 pav. Indukuotų deformacijų modelis. 1 – fermento ir substrato sąveika. Aktyviojo centro kon-
formacija yra komplementari pereinamosios būsenos substratų molekulėms; 2 – jungiantis substra-
tui, pakinta aktyviojo centro konformacija ir susidaro ES; 3 – konformacinių įtampų energija, e-
santi ES komplekse, yra panaudojama pereinamosios būsenos ES ‡ susidarymui; 4 – fermento ir re-
akcijos produktų A, B susidarymas EP komplekse
Substratų molekulių deformacijas gali sukelti ne tik konformaciniai pokyčiai aktyviajame centre.
Substrato molekulių deformacijai, susidarant pereinamajai būsenai, panaudojama elektrostatinė sąvei-
ka, pvz., jeigu fermento hidrofobiniame aktyviajame centre yra neigiamai įkrauta aminorūgšties grupė,
kuri poliarizuoja substratų molekules, tai neįkrautoms molekulėms bus nepalanku prisijungti. Jeigu,
susidarant pereinamajai būsenai, substrato molekulėje formuojasi katijoninis centras, tai neigiamo krū-
vio buvimas fermento aktyviajame centre katalizuos pereinamosios būsenos susidarymą. Vandeniliniai
ryšiai ir hidrofobinė sąveika taip pat yra reikšmingi deformuojant substratų molekules, susidarant pe-
reinamajai būsenai.

2.7. Entropijos kitimas – vidumolekulinės katalizės privalumo pagrindas

Pats paprasčiausias entropijos paaiškinimas yra tas, kad entropija yra sistemos netvarkingumo ma-
tas. Kuo sistema netvarkingesnė, tuo didesnė jos entropija. Įvairūs erdviniai atomų ir molekulių suvar-
žymai turi įtakos sistemos entropijai. Katalizinis vidumolekulinių reakcijų pranašumas prieš tokias pa-
čias tarpmolekulines reakcijas taip pat remiasi entropijos pokyčiais. Tarpmolekulinėse reakcijose dvi
35
ar daugiau molekulių turi susijungti tarpusavyje, kad susidarytų produkto molekulė. Vykstant šioms
reakcijoms sistema tampa „tvarkingesnė“ ir entropija sumažėja. Iš tokių entropijos pokyčių reakcijos
metu galima sužinoti efektyviąją reaguojančių medžiagų koncentraciją.
Molekulės entropija susideda iš jos slenkamojo judesio, sukimosi ir vidinės entropijos. Slenkamo-
jo judesio ir sukimosi entropijos gali būti tiksliai suskaičiuotos, žinant molekulių, esančių dujų fazėje,
masę ir geometriją. Molekulėje esančių cheminių ryšių virpėjimo entropija gali būti apskaičiuojama
žinant virpėjimo dažnį, o vidinė sukinio entropija randama žinant sukinio laisvosios energijos barjero
dydį.
Slenkamojo judesio entropija yra didelė – apie 120 J/deg/mol 1 M mažų molekulių tirpale. Tai ati-
tinka apie 40 kJ/mol, kai temperatūra 25ºC (298 K). Molekulių slenkamojo judesio entropija priklauso
nuo jų užimamo tūrio: kuo mažesnis tūris, tuo labiau riboti molekulių slenkamieji judesiai ir tuo ma-
žesnė entropija. Be to, entropija mažėja didėjant molekulių koncentracijai. Pažymėtina, kad slenkamo-
jo judesio entropija nežymiai priklauso nuo molekulių masės (6 lentelė).
Molekulių sukimosi entropija taip pat yra didelė – iki 120 J/deg//mol didelėms organinėms mo-
lekulėms. Jos skaitinė vertė lėtai didėja didėjant molekulių masei, tačiau nepriklauso nuo koncentraci-
jos.
Kovalentinių ryšių silpnų virpesių entropija yra labai maža. Mažai suvaržytų atomų žemo dažnio
virpesių entropija yra tik keli vienetai. Molekulių vidinio sukinio entropija yra nuo 13 iki 21 J/deg/mol
(6 lentelė).
J.D. Dunitz nustatė entropijos pokyčius molekulių hidratacijos metu. Hidratuoto vandens moleku-
lių entropija kristaluose ar mineraluose yra 42 J/mol/K ir tai yra stipriai prijungtų molekulių žemutinė
riba. Skysto vandens molekulių entropija yra 67-71 J/mol/K, o tai atitinka silpnai susietų vandens mo-
lekulių, esančių tirpale, viršutinę ribą. Taigi vandens molekulių fiksavimo hidratacijos metu energijos
vertė yra nuo 0 iki 8,3 kJ/mol, kai temperatūra 25ºC (298 K).

6 lentelė. Molekulių slenkamojo judesio, sukinio ir virpėjimo entropijos (298 K) *

Judesio pobūdis Entropija (J/deg/mol)
Molekulių (Ms 20–200) trimatis slenkamasis 120–150
judėjimas (konc. 1 M)
Trimatis sukimasis:
vanduo 44
n-propanas 90
endo-diciklopentadienas 114
Sukimasis molekulės viduje 13–21
Virpėjimas (cm ):
-1

1000 0,4
800 0,8
400 4,2
200 9,2
100 14,2
*
M.I. Page, W.P. Jencks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 1678 (1971)

36
 Vykstant reakcijai, kurios metu tarpusavyje jungiasi dvi molekulės ir susidaro trečia, reaguojan-
čios molekulės praranda savo slenkamųjų judesių ir sukimosi entropijas. Susidariusio produkto slen-
kamojo judesio ir sukimosi entropijos yra nežymiai didesnės nei kiekvienos reaguojančios molekulės,
nes šių entropijų skaitinės vertės beveik nepriklauso nuo molekulių dydžio. Reaguojant mažoms mo-
lekulėms, entropija sumažėja apie 190 J/deg/mol. Tai atitinka apie 57 kJ/mol, kai temperatūra 25ºC.
Toks entropijos sumažėjimas iš dalies kompensuojamas susidariusio produkto molekulių vidine entro-
pija, nes po reakcijos atsiranda naujų susidariusių ryšių virpėjimas ir kitokių vidinių sukinių galimy-
bės. 19 pav. parodyti reakcijos metu vykstantys entropijos pokyčiai, kai tarpusavyje jungiasi dvi mo-
lekulės ir susidaro viena produkto molekulė.

19 pav. Entropijos pokyčiai reakcijos metu, reaguojant dviem molekulėms ir susidarant vienai.
Kiekviena reaguojanti molekulė praranda slenkamojo judesio ir sukimosi entropiją. Po reakcijos
jau tik vienos produktų molekulės turi slenkamojo judesio ir sukimosi entropijas, bendroji siste-
mos entropija sumažėja. Šis sumažėjimas iš dalies kompensuojamas produktų molekulėse naujai
susidariusių ryšių virpėjimo ir vidinio sukinio entropijomis
Jungiantis tarpusavyje dviem baltymų molekulėms, entropija dar labiau sumažėja, nes baltymų
molekulės yra žymiai didesnės. Šis sumažėjimas daugiausia yra kompensuojamas naujai susidariusių
ryšių virpėjimo entropija, nes gautame komplekse abiejų baltymų laisvasis sukimasis yra sunkesnis. B.
Tidor ir M. Karplus nustatė, kad insulino dimerų susidarymo iš monomerų metu, kai temperatūra 300
K, slenkamojo judesio entropija sumažėja 180 J/deg/mol, o molekulių sukimosi entropija – 200
J/deg/mol. Šie entropijų sumažėjimai iš dalies kompensuojami 100 J/deg/mol dėl insulino dimere nau-
jai susidariusių ryšių virpėjimo.
Pateikti entropijų pokyčiai gauti standartinėmis sąlygomis, kai molekulių koncentracijos yra 1 M.
Mažesnės koncentracijos tirpaluose entropijos sumažėjimas reakcijos metu bus dar didesnis, nes mo-
lekulių slenkamojo judesio entropija didėja mažėjant jų koncentracijai.
Palyginkime dvi reakcijas:

37
 A+B AB ‡ AB

A B AB ‡ AB

Dvisubstratinėje tarpmolekulinėje reakcijoje, susidarant pereinamajai būsenai AB ‡, reaguojančios

molekulės A ir B netenka slenkamojo judesio ir sukimosi entropijų, o vidumolekulinėje reakcijoje ent-
ropija sumažėja tik dėl vidinių sukinių pokyčių. Vidumolekulinių reakcijų entropinis pranašumas yra
apie 190 J/deg/mol ir tai atitinka apie 57 kJ/mol, kai temperatūra 25ºC. Toks vidumolekulinių reakcijų
entropinis pranašumas padidina reakcijos greičio konstantą 6×109 kartų. Įvertinę pirmojo ir antrojo
laipsnio reakcijų molekulingumo skirtumus, gautume, kad efektyvioji reaguojančių grupių koncentra-
cija turėtų būti 6×109 M, t.y., kad molekulės B dvisubstratinėje tarpmolekulinėje reakcijoje reaguotų
tokiu pat greičiu kaip ir vidumolekulinėje reakcijoje, A molekulių koncentracija turėtų būti 6×10 9 M.

COOH

CH2

CH2

COOH
Efektyvioji reaguojančių molekulių koncentracija labai sumažėja, kai sumažėja jų vidinių sukinių
entropija, pvz., gintaro rūgšties molekulėje yra galimas laisvas sukimasis tarp karboksigrupių ir meti-
leno grupių bei dviejų metileno grupių. M.I. Page ir W.P. Jencks nustatė, kad tais atvejais, kai gintaro
rūgšties molekulėje nėra laisvo sukimosi tarp dviejų metileno grupių, entropija sumažėja apie 13
J/deg/mol, o kai nėra laisvo sukimosi tarp abiejų karboksigrupių ir metileno grupių – 25 J/deg/mol.
Jeigu gintaro rūgšties molekulėje nebūtų galimi visi trys sukimaisi, šalia esančių karboksigrupių efek-
tyvioji koncentracija turėtų padidėti iki 5×108 M. Gauti duomenys akivaizdžiai parodo vidumolekuli-
nių reakcijų entropinį pranašumą, o teorinės reaguojančių medžiagų efektyviųjų koncentracijų vertės
atrodo visiškai realios.
Vienas svarbiausių veiksnių fermentinėje katalizėje yra entropijos pokyčiai cheminių reakcijų me-
tu. Katalizuojamų reakcijų, vykstančių tirpaluose, greitis yra mažas, nes katalizatoriaus ir substrato
molekulių sąveikos metu labai sumažėja bendroji sistemos entropija. Fermentinės reakcijos vyksta ak-
tyviuosiuose centruose, kuriuose reaguojančių substratų molekulės yra atskirtos nuo tirpiklio moleku-
lių. Fermento ir substrato komplekse ES katalizinės grupės ir substratas yra to paties komplekso dalys,
todėl pereinamosios būsenos susidarymo metu neprarandama sistemos slenkamojo judesio ir sukimosi
entropija. Aktyviajame centre katalizinių grupių efektyvioji koncentracija yra žymiai didesnė nei tirpa-
luose vykstančiose dvisubstratinėse reakcijose. Šie vidumolekulinių reakcijų entropiniai pranašumai
yra „apmokami“ fermentų ir substratų sąveikos energijos – slenkamojo judesio ir sukimosi entropijų
substratai netenka, prisijungdami fermentų aktyviuosiuose centruose, o ne cheminių reakcijų metu.
Entropijos sumažėjimas, susidarant fermento-substrato kompleksui, padidina jo disociacijos konstantą.

38
 2.8. Elektrostatinė katalizė

Cheminėse reakcijose, vykstančiose vandeniniuose tirpaluose, elektrostatinė katalizė dėl didelės

vandens dielektrinės konstantos nėra labai reikšminga. Elektrostatinės sąveikos tarp dviejų taškinių
krūvių e1 ir e2 energija yra lygi:

e1 e 2
E ,
Dr 2

čia D – terpės dielektrinė konstanta, r – atstumas tarp dviejų taškinių krūvių.

Protono ir elektrono, esančių vakuume (D=1) 0,33 nm atstumu vienas nuo kito, elektrostatinės są-
veikos energija yra – 418 kJ/mol, o vandenyje – (D=79) tik – 5,4 kJ/mol.
Vandens molekulės sumažina elektrostatinės sąveikos energiją neįsiterpdamos tarp dviejų taškinių
krūvių. Tai įrodyta tiriant bazinių aminų hidrazino ir trietildiamino protonizavimą vandeniniuose tirpa-
luose:

pKr = 8 pKr = -1
H2NNH2 H2NNH3+ + H3NNH3+
+ +
H H

pKr = 8,8 pKr = 3

N N N NH+ + HN NH+
+ +
H H

Hidrazino dikatijone atstumas tarp teigiamai įkrautų krūvių yra 0,15 nm. Vakuume elektrostatinio
atostūmio energija turėtų būti lygi 920 kJ/mol, tačiau neprotonizuotos ir protonizuotos hidrazino formų
pKr vertės skiriasi 9 vienetais ir tai atitinka tik 50,2 kJ/mol. Trietildiamino molekulėje atstumas tarp
dviejų azoto atomų yra 0,26 nm. Vakuume elektrostatinio atostūmio energija tarp teigiamai įkrautų a-
zoto atomų turėtų būti 546 kJ/mol, tačiau yra tik 33,4 kJ/mol. Abiem atvejais dielektrinės konstantos
vertė yra lygi 17. Teigiamai įkrauti jonai poliarizuoja tirpiklio molekules ir taip indukuoja dipolių su-
sidarymą. Elektrostatinės sąveikos metu dipoliai sumažina katijonų teigiamą krūvį ir taip, neįsiterpda-
mi tarp azoto jonų, susilpnina atostūmio jėgas. Elektrostatinė sąveika yra žymiai stipresnė organiniuo-
se tirpikliuose nei vandenyje, nes organinių tirpiklių dielektrinės konstantos yra mažesnės. Ši savybė
panaudojama fermentinėje katalizėje, aktyviuosiuose centruose stabilizuojant įkrautus pereinamosios
būsenos substratus. Fermentų aktyviųjų centrų dielektrinių konstantų vertės yra mažos, todėl čia esan-
tys teigiami ir neigiami krūviai stipriai sąveikauja su poliniais pereinamosios būsenos substratais. Nors
elektrostatinė katalizė dažna fermentinėse reakcijose, tačiau dėl didelio fermentų molekulių heteroge-
niškumo (nepolinės alkilinės grupės yra greta polipeptido polinių amidinio karkaso grupių) ją sunku
aprašyti. Du ar trys fiksuoti dipoliai fermento aktyviajame centre (pvz., polipeptido karkaso -NH- gru-
pės) taip pat gali efektyviai stabilizuoti įkrautas molekules kaip ir vanduo. Fiksuoti dipoliai, esantys
aktyviajame centre, gali stabilizuoti jonų porą žymiai efektyviau nei vandens molekulės. Vanduo hid-

39
ratuoja jonus, susidarant aplink juos vandens molekulių sluoksniui. Šis sluoksnis yra apsuptas kitu
vandens molekulių sluoksniu, tarp kurių yra dipolinė elektrostatinė sąveika. Hidratuoto jono išorinio
vandens sluoksnio molekulės sudaro vandenilinius ryšius su tirpiklio vandens molekulėmis. Šie ryšiai
susidaro atsitiktinai, todėl išoriniame sluoksnyje yra suardoma vandens molekulių dipolių orientacija.
Nustatyta, kad jono hidratacijos energija yra didžiausia tuomet, kai jį supa 10 vandens molekulių. Gal-
būt primityviausi fermentai stabilizuodavo įkrautas hidratuotas pereinamosios būsenos substratų mo-
lekules, prijungdami jas hidrofobiniuose aktyviuosiuose centruose. Fermentų aktyviuosiuose centruose
esantys dipoliai yra tiksliai fiksuoti tam tikroje erdvinėje orientacijoje, kuri užtikrina optimalią sąveiką
su substratų molekulėmis. Elektrostatinės katalizės metu fermentų aktyviuosiuose centruose pereina-
mosios būsenos substratų molekulės yra solvatuojamos. Hidratuoto vandens molekulių sluoksnis pa-
keičiamas aktyviajame centre esančiomis polinėmis grupėmis (20 pav.).

20 pav. Substratų molekulių solvatacija fermentų aktyviuosiuose centruose

Elektrostatinės katalizės metu pereinamosios būsenos substratų molekulėse atsiranda „elektrosta-
tinių deformacijų“, kurioms susidaryti panaudojama fermento ir substrato sąveikos energija bei poli-
peptido -spiralėje esančių orientuotų dipolių energija.
Taigi fermentai žymiai efektyviau nei vanduo stabilizuoja jonų poras ir kitus pereinamosios būse-
nos substratų molekulėse esančius krūvius, nes aktyviuosiuose centruose yra tiksliai orientuotos įkrau-
tos grupės, prie kurių prisijungia substratų molekulės, netekdamos hidratuoto vandens. Vandenyje e-

40
sančių jonų hidratuoto vandens molekulių dipoliai yra deorientuojami tirpiklio vandens molekulėmis ir
įkrauti jonai destabilizuojami.

2.9. Katalizė metalų jonais

Svarbiausias metalų vaidmuo metalofermentuose yra elektrofilinės katalizės metu stabilizuoti nei-
giamus krūvius, atsirandančius susidarant pereinamajai būsenai, pvz., karboksipeptidazės katalizuoja-
moje reakcijoje substrato molekulės karbonilo grupės deguonies atomas yra koordinuojamas fermento
aktyviajame centre esančiais Zn2+ jonais (20 pav.). Toks koordinavimas poliarizuoja amidą ir susidaro
palankios sąlygos nukleofilinei atakai:

2+ 2+
Zn Zn
O O
R C R C
- NHR' R O NHR'
RO
Zn2+ jonai stabilizuoja reakcijos metu susidarantį tetraedrinį tarpinį junginį. Toks substratų koordi-
navimas metalų jonais pagreitina reakcijas nuo 104 iki 106 kartų.
Kitas svarbus metalų vaidmuo fermentinėje katalizėje yra hidroksilo grupių aktyvavimas neutra-
lioje terpėje. Prie metalų prisijungusios hidroksilo grupės yra stiprūs nukleofilai, pvz., prie kobalto pri-
sijungusios vandens molekulės pKr yra 6,6. Ši vertė 9 vienetais mažesnė už laisvųjų H2O molekulių
pKr:

(NH3)5Co3+ OH2 (NH3)5Co2+ OH + H+

Fermentinėje katalizėje, prisijungiant vandens molekulėms prie aktyviuosiuose centruose esančių

metalų jonų, yra sustiprinamas hidroksilo grupių nukleofiliškumas. Taip, neutralioje terpėje (pH 7) at-
siranda daug nukleofilinių hidroksilo grupių. Kadangi prie metalų prijungtų H2O molekulių pKr lygi 7,
tai neutralioje terpėje daug jų yra jonizuotų. Taip veikia karboanhidrazė. Karboanhidrazė katalizuoja
CO2 hidratacijos reakciją. Fermento aktyviajame centre yra Zn2+ jonas, prisijungęs prie trijų histidinų
liekanų. Ketvirtoje laisvoje padėtyje prisijungia H2 O molekulė, kurios pKr 7. Gaunama prie cinko jono
prijungta aktyvuota hidroksilo grupė. Chemijoje yra žinomi cinko organiniai junginiai, kurie taip pat
gali aktyvuoti vandens molekules:

N
RZn2+OH2 R= N N
N

41
Šie junginiai katalizuoja CO2 ir acetaldehido hidratacijos reakcijas. Karboanhidrazinės reakcijos metu
Zn2+ jonas poliarizuoja CO2 molekulės anglies atomą ir prie jo prijungia aktyvuotą hidroksilo grupę:

O
2+
E Zn C 2+ -
O E Zn + HCO3
O
H
Vidumolekulinėse cheminėse reakcijose, kuriose nėra indukuojamos reaguojančių molekulių de-
formacijos, hidroksilo grupių aktyvavimas metalais labai padidina reakcijų greitį, pvz., glicilglicino
kompleksas su (etilendiaminas)2Co3+ ir cis-hidroksilu hidrolizuojasi neutralioje terpėje (pH 7) 1010 kar-
tų greičiau nei laisvas glicilglicinas:

-
NH2CH2CONHCH2CO2
2+
k1 = 5,5x10-3 s-1
Co
OH pH 7, 25oC

Metalai fermentinėje katalizėje yra panaudojami ir elektronų pernašai oksidacijos-redukcijos

reakcijose bei kitais sudėtingesniais atvejais, pvz., fermentinėse reakcijose, kuriose dalyvauja
kofermentas B12, kobaltas sudaro kovalentinius ryšius su substratų anglies atomais.

2.10. Izotopų pakeitimo kinetiniai efektai

Izotopų pakeitimo kinetiniai efektai (IPKE) stebimi tuomet, kai reaguojančio substrato molekulėje
vieno atomo pakeitimas jo izotopu keičia reakcijos greitį. Jeigu vandenilio atomas pakeičiamas deute-
riu, tai IPKE = kH/kD, čia k yra reakcijos greičio konstanta. Tiriant izotopų pakeitimų įtaką reakcijos
greičiui, sužinoma apie cheminių ryšių suirimo ir naujų ryšių susidarymo eigą, formuojantis pereina-
majai būsenai.
Pirminiai izotopų pakeitimo efektai stebimi tuomet, kai vieno ar kito atomo pakeitimas turi įtakos
reakcijos greitį lemiančiai stadijai. Dažniausiai tai būna atomas, ties kuriuo reakcijos metu suardomas
cheminis ryšys, arba kuris dalyvauja susidarant naujam ryšiui. Antriniai izotopų pakeitimo efektai ste-
bimi tuomet, kai senieji ryšiai suardomi arba naujieji susidaro reakcijos greitį nelemiančiose stadijose.
Reakcijos greičio, kai molekulėje yra lengvesnis izotopas, ir reakcijos greičio, kai yra sunkesnis, san-
tykio skaitinė vertė rodo, ar efektas yra pirminis ar antrinis. H/D sistemoje pirminių efektų atvejais
IPKE≥2, o antrinių atvejais IPKE skaitinės vertės yra nuo 0,7 iki 1,5. Jeigu pirminių efektų atvejais
IPKE>20, tai vyksta kvantinis tuneliavimas. Šis reiškinys stebimas judant protonams ir elektronams.
Antrinių efektų atvejais atomo pakeitimas sunkesniu izotopu ne visada sumažina reakcijos greitį.
Substrato molekulėje atomo pakeitimas jo izotopu didžiausią įtaką reakcijos greičiui turi tuomet,
kai keičiamo atomo ir izotopo masių skirtumas yra didžiausias. Pavyzdžiui, pakeitus vandenilio atomą
deuteriu, buvusio atomo masė padidėja 100 proc., o pakeitus 12
C atomą izotopu 13C – tik 8 proc. C-H
42
ryšio suardymo greitis yra 6–10 kartų didesnis nei C-D, o reakcijų, kuriose dalyvauja 12
C izotopas,
greitis tik ~ 1,04 kartų didesnis už reakcijų greitį, kuriose dalyvauja 13
C. Izotopų pakeitimai substratų
molekulėse turi įtakos cheminių ryšių, kuriuos jie sudaro, virpėjimo dažniui, nors jų elektroninė konfi-
gūracija yra panaši. Sunkesnių izotopų sudaromų cheminių ryšių virpėjimo dažnis yra mažesnis, todėl
ir jų nulinių energijų vertės mažesnės, o reakcijų, kuriose dalyvauja šie junginiai, aktyvacijos energijos
barjeras yra didesnis (21 pav.).

C---H---B
ar
C---D---B
Pereinamoji
būsena
Energija

C–H
C–D

Atstumas tarp C-H ar C-D atomų

21 pav. Vandenilio ar deuterio pernešimo nuo anglies atomo energijos pokyčiai. Nulinė C-H ryšio
energija yra didesnė už C-D ryšio, todėl vandenilio atomo pernešimo reakcijos energetinis barjeras
yra mažesnis nei deuterio

Molekulių, sudarytų iš dviejų atomų, izotopų pakeitimo efektai gali būti aprašomi remiantis har-
moninio osciliatoriaus teorija. Cheminio ryšio tarp atomų A ir B virpėjimo dažnis yra lygus:

1 k
  ,
2 

čia: k – cheminio ryšio tamprumo konstanta;  – A-B sistemos redukuota masė.

mAmB
 ,
mA  mB

čia: mi – i atomo masė.

Kvantinėje mechanikoje harmoninio osciliatoriaus n-tojo lygio energija En yra lygi:

 1
En  h  n   .
 2

Taigi sistemos nulinė energija (n=0) mažėja didėjant jos redukuotai masei . C-H ryšyje pakeitus
vandenilio atomą deuteriu, ryšio tamprumo konstanta nekinta, tačiau kinta redukuota masė (padidėja
apie du kartus) ir C-D ryšio virpėjimo dažnis  sudaro 0,71 dalį C-H ryšio virpėjimo dažnio. Vandeni-
lio atomo pakeitimas deuteriu sukuria didesnį efektą nei 12C atomo pakeitimas 13C izotopu.
43
 Izotopų pakeitimų kinetiniai efektai panaudojami tiriant cheminių ir fermentinių reakcijų mecha-
nizmus, pvz., tolueno halogeninimo reakcija:

Šioje reakcijoje tiriamas vandenilio atomo pakeitimo bromu mechanizmas, panaudojant monodeu-
terintą tolueną, kuris gaunamas redukuojant benzilchloridą cinku, kai reakcijos mišinyje yra deuterinta
acto rūgštis. Monodeuterintas toluenas reaguoja su N-bromosukcinamidu (NBS). Jeigu reakcijos metu
vandenilio atomas būtų pakeičiamas bromu greičiau nei deuteris, tai padaugėtų deuterinto reakcijos
produkto. Reakcijos produktai buvo redukuojami ličio-aliuminio hidridu, susidarant toluenui, ir tiriami
masių spektroskopu. Šios reakcijos IPKE yra 4,86. Tai puikiai dera su visuotinai priimtu radikalų pa-
keitimo mechanizmu, kai reakcijos metu bromo laisvasis radikalas pakeičia protoną ir tai yra reakcijos
greitį nulemianti stadija [22].
Reakcijose, kurios vyksta keletą stadijų, izotopų pakeitimas reaguojančių substratų molekulėse ga-
li turėti įtakos tik vienos ar kitos stadijos greičiui, pvz., reakcija, kurioje hidrido pernešimas yra susijęs
su C-C ryšio suirimu. Tiriant 13
C/12C ir D/H izotopų pakeitimo kinetinius efektus, galima nustatyti, ar
šios abi reakcijos stadijos vyksta vienu metu (suderintos reakcijos), ar pakopomis. Tokia reakcija yra
oksidacinis malato dekarboksilinimas, katalizuojamas obuolių rūgšties fermento. Ji galėtų vykti stadi-
jomis, susidarant stabiliam tarpiniam junginiui, reakcija (2.9), arba suderintai (2.10):

44
 H H NADP+ NADPH O H CO2
- -O C -
-O C C C CO2 2 C C CO2
2

OH H H

OH O

-O C -O C C CH3 (2.9)
2 C CH2 2

O
NADPH + CO2 OH O
HO
C
-OC O
-O C C CH2 -O C C CH3 (2.10)
2 C C 2 2
H
H H

NADP+

Šioje reakcijoje pernešamas vandenilio atomas yra pakeistas deuteriu, o malato anglies atomas, iš
kurio susidaro CO2, pakeistas 13C izotopu. Jeigu C–C ryšio suardymas ir hidrido pernešimas nėra reak-
cijos greitį lemiančios stadijos, tai izotopiniai pakeitimai turės skirtingą įtaką pakopiniam ir suderintam
mechanizmams. Pakeitimas deuteriu sulėtina reakciją ir tuomet, jeigu mechanizmas yra pakopinis, 13
C
kinetinis izotopinis efektas bus mažesnis deuterinto substrato atveju. Priešingai, jeigu reakcija vyksta
suderintai ir abi stadijos yra lemiančios reakcijos greitį, tai pakeitimo į 13
C kinetinis efektas nebus pa-
veiktas deuterinimu. Taigi įrodyta, kad su kofermentu NADP + obuolių rūgšties fermento katalizuojama
reakcija vyksta pakopomis (2.9), o NADP+ pakeitus acetilpiridin-NADP+, suderintai (2.10). Fermenti-
nių reakcijų eiga kinta pasikeitus reaguojančių molekulių struktūroms.
Reakcijose, kurių metu pernešami lengvi izotopai, kartais stebimas kvantinio tuneliavimo reiški-
nys, pvz., nitroizobutano deprotonizacijos ir jodinimo reakcija dalyvaujant piridino bazei:

Šios reakcijos IPKE vertė yra labai didelė – 24,8 [23].

Izotopų pakeitimo tirpiklio molekulėse kinetiniai efektai stebimi atliekant reakcijas skirtinguose
tirpikliuose, pvz., H2O ir D2O. Matuojami protonų ir deuteronų pernašos tarp dviejų elektroneigiamų
atomų greičiai. Šio pernešimo metų susidaro naujas ryšys ir suyra senasis:

45
 H D
O O
H O D O
H H D D
O O
H3C C H3C C
(2.11)
O O R O R
B: H H O
B: D D (2.11)
Savo prigimtimi izotopų pakeitimo tirpiklio molekulėse kinetiniai efektai skiriasi nuo tų, kurie
gaunami tiriant C–H ir C-D ryšių skaidymą. Protono pernaša tarp dviejų elektroneigiamų atomų yra
labai greita, palyginti su cheminių ryšių suirimu ir susidarymu. Matyt, reakcijos metu protono energija
yra artima nulinio taško energijai. Izotopų pakeitimo tirpiklio molekulėse kinetiniams efektams įtakos
turi reaguojančių medžiagų solvatacija bei antriniai izotopiniai efektai, keičiant vandenilio atomą deu-
teriu. Izotopų pakeitimo tirpiklio molekulėse kinetiniais efektais dažnai remiamasi tiriant cheminių re-
akcijų katalizės mechanizmus. Pavyzdžiui, jeigu reakcijoje (2.11) būtų stebima bendroji bazinė katali-
zė, tai tuomet kH/kD santykis būtų lygus 2, o nukleofilinės katalizės atveju šis santykis lygus 1. Izotopų
pakeitimų įtaką fermentinėse reakcijose sudėtinga įvertinti, nes fermento molekulėje esantys protonai
gali keistis su D2O deuteronais. Be to, kintant tirpiklio sudėčiai, šiek tiek kinta ir baltymo molekulės
struktūra.
Įvairūs mechanizmai panaudojami substratų molekulių stabilizavimui pereinamojoje būsenoje.
Kuris jų yra svarbiausias katalizėje? Geriausias atsakymas būtų toks, jog kiekvienos konkrečios reakci-
jos metu katalizei panaudojamas tam tikras rinkinys aukščiau aprašytų mechanizmų, o katalizės efek-
tyvumą lemia tai, kad visų fermentų aktyvieji centrai yra komplementarūs pereinamosios būsenos
substratų molekulėms. Šių mechanizmų panaudojimą katalizėje galima iliustruoti serino peptidazių
pavyzdžiu.

2.11. Serino peptidazių veikimo mechanizmai

Serino peptidazių šeimos fermentai katalizuoja savitų peptidinių ryšių skaidymą baltymų ir pep-
tidų molekulėse. Šių fermentų veiklai jų aktyviuosiuose centruose yra būtina aminorūgščių triada: se-
rino liekana (iš čia kilęs šeimos pavadinimas), histidino liekana ir aspartatas. Fermentinės reakcijos
metu serino hidroksilo grupė atakuoja peptidinio ryšio karbonilo grupės anglies atomą (nukleofilinė
katalizė), o jos nukleofiliškumą sustiprina histidino imidazolo šoninė grupė (bendroji rūgštinė-bazinė
katalizė), kuri sąveikauja su aspartato karboksigrupe. Kryptingos mutagenezės būdu buvo įrodytas se-
rino ir histidino liekanų būtinumas katalizėje. Vieną jų arba abi pakeitus kitomis aminorūgštimis, reak-
cijos greitis sumažėdavo 106 kartų [24]. Serino peptidazės buvo vienos pirmųjų fermentų, kurių veiki-
mo mechanizmai buvo ištirti. Tai gyvulių ir žmogaus virškinimo fermentai, tačiau įvairiuose organiz-
muose – nuo bakterijų iki žinduolių, jie gali atlikti ir kitas funkcijas. Pavyzdžiui, žmogaus organizme
serino peptidazės svarbios kraujo krešėjime, uždegiminiams procesams, žaizdų gijimui, imuninio atsa-
ko susidarymu ir kitiems fiziologiniams procesams. Daugelio šios šeimos fermentų nustatyta erdvinė
46
struktūra, fermentai tyrinėti įprastiniais biocheminiais, kryptingos mutagenezės ir kt. metodais [25].
Todėl, aiškinantis cheminius fermentinės katalizės mechanizmus, jie yra tapę standartiniu pavyzdžiu.
Reakcijos pradžioje serino peptidazės prisijungia polipeptido grandinės dalį, tinkamai orientuo-
damos aktyviajame centre kerpamą peptidinį ryšį. Įvairios peptidazės aktyviajame centre prisijungia
skirtingo ilgio polipeptidinius fragmentus, tačiau dažniausiai tai būna kelių aminorūgščių liekanos.
1967 m. Schechter ir Berger pasiūlė schemą, pagal kurią būtų galima numeruoti polipeptidinio substra-
to aminorūgščių liekanas, dalyvaujančias prijungime ir katalizėje. Pagal šią schemą galima pažymėti ir
atitinkamas sąveikos vietas peptidazių aktyviuosiuose centruose. Pagal šią schemą suardomas peptidi-
nis ryšys yra tarp P1 ir P1′ aminorūgščių liekanų. P1 aminorūgštis kerpamo ryšio atžvilgiu yra N-
pusėje, o P1′–C-pusėje. Aminorūgšties liekana, esanti N-pusėje šalia P1 aminorūgšties, žymima P2, o
C-pusėje šalia P1′–P2′. Peptidazės aktyviojo centro vieta, kurioje prisijungia P1 aminorūgšties liekana,
yra žymima S1, o ta vieta, kur jungiasi P1‘ aminorūgštis – S1′. Tokia numeracija gali būti tęsiama į abi
puses nuo kerpamo peptidinio ryšio. 22 pav. parodyta numeracija, kai peptidazės aktyviajame centre
prisijungia šešių aminorūgščių peptidas.

Peptidinis substratas

P3 P2 P1 P1' P2' P3'

S3 S2 S1 S1' S2' S3'

Peptidazė

22 pav. Schechter ir Berger pasiūlyta peptidazių ir peptidinių substratų sąveikos schema. Substra-
to molekulėje aminorūgščių liekanos, esančios N-pusėje nuo kerpamo peptidinio ryšio, žymimos
P1–Pn, o C-pusėje – P1′–Pn′. Skaidomas peptidinis ryšys yra tarp P1 ir P1‘ aminorūgščių. Atitin-
kamos vietos fermento aktyviajame centre žymimos S1–Sn ir S1′–Sn′
Pagal struktūros ypatybes serino peptidazės suskirstytos į tris klases: chimotripsino, subtilizino ir
serino karboksipeptidasės II. Kiekvienos klasės baltymų antrinė ir tretinė struktūros skiriasi, tačiau
visų fermentų aktyviuosiuose centruose yra konservatyvios serino, histidino ir aspartato aminorūgščių
liekanos, o jų katalizės mechanizmai yra vienodi. Šie fermentai katalizuoja esterinių ir peptidinių ryšių
hidrolizę, padidindami reakcijos greitį 109 ir daugiau kartų. Reakcijos metu acilo liekana yra kovalen-
tiškai prijungiama peptidazės aktyviajame centre (23 pav.).

47
 Bendroji bazinė katalizė Bendroji rūgštinė katalizė

His -64 His -64

Nukleofilinė
katalizė

Ser -221 O HN
O HN
N H O Asp-32 - N H Ser -221
Asp-32 - O
O R'
O R' N -
N O H H O
N H
H R H H
E-S R
155-Asn (E-S‡)1 N

155-Asn

His -64
His -64

O HN
O HN N
Asp-32 -
N Ser -221
Asp-32 - O
O H O Ser -221
O O H H
O
N
H R O H H
155-Asn H N
R
R' N
E-Ac E-Ac 155-Asn
H

His -64
His -64

O HN
+ N H Ser -221 O HN Ser -221
Asp-32 -
Asp-32 - N H O
O O
- O
O O
H R H H O H H
H O
N N
(E-S‡)2
155-Asn
R E-P 155-Asn

23 pav. Pagrindiniai fermentinės katalizės cheminiai mechanizmai (serino peptidazės subtilizino

pavyzdžiu)
Susidarius fermento ir substrato kompleksui E-S, aktyviajame centre esanti nukleofilinė serino
hidroksilo grupė atakuoja P1 aminorūgšties karbonilo grupės anglies atomą ir susidaro tarpinis tetraed-
rinis oksianijoninis junginys (E-S‡)1, primenantis reakcijos pereinamąją būseną. Pereinamoji būsena
stabilizuojama susidarant vandeniliniams ryšiams tarp aktyviojo centro aminorūgščių liekanų ir subst-
rato oksianijono. Subtilizine tokius ryšius sudaro polipeptidinėje grandinėje esantis Ser 221 liekanos
(aktyviojo centro nukleofilas) azoto atomas ir Asn 155 šoninė grupė (23 pav.). Chimotripsino klasės
fermentuose vandenilinius ryšius sudaro nukleofilinio serino polipeptidinėje grandinėje esantis azoto
atomas ir aktyviojo centro glicino liekana, o serino karboksipeptidazėse–polipeptidinėje grandinėje
esantis tirozino azoto atomas ir aktyviojo centro glicino liekana. Rentgenostruktūrinės kristalografinės
analizės metodu nustatyta, kad subtilizino ir substrato komplekse E-S tarp Asn 155 ir substrato yra
48
vandenilinis ryšys, kuris žymiai sustiprėja susidarant pereinamajai būsenai. Aktyviojo centro konfor-
maciniai pokyčiai stabilizuoja pereinamąją būseną. Fermentinės reakcijos greitis labai sumažėja, pa-
keitus Asn 155 kitomis aminorūgštimis, negebančiomis sudaryti vandenilinių ryšių.
Reakcijos metu susidariusi pirmoji pereinamoji būsena (E-S‡)1 suyra, kai nuo aktyviajame centre
esančio histidino prie P1′ aminorūgšties aminogrupės prisijungia protonas ir susidaro pirmasis reakci-
jos produktas – peptidas, kurio N-gale yra P1′ aminorūgštis. Peptido liekana, kurios C-gale yra P1 a-
minorūgštis, kovalentiškai prisijungia prie aktyviajame centre esančio serino. Susidaro acil-fermentas
E-Ac (23 pav.). Deacilinimas įvyksta vandens molekulėmis nukleofilinės atakos metu. Susidaro antroji
reakcijos pereinamoji būsena (E-S‡)2, kurios struktūra yra labai panaši į pirmąją pereinamąją būseną
(E-S‡)1. Į fermento aktyvųjį centrą vanduo patenka per plyšį, atsiradusį susidarius pirmajam reakcijos
produktui. Antroji pereinamoji būsena suyra prijungiant protoną aktyviojo centro histidinui ir susida-
rant antrajam reakcijos produktui – peptidui, kurio C-gale yra P1 aminorūgštis.
Serino peptidazių aktyviuosiuose centruose yra aspartato liekana, kuri yra būtina katalizei, nors
šios aminorūgšties vaidmuo dar nepakankamai žinomas. Ankstesni tyrimai parodė, jog kartu su serino
ir histidino liekanomis aspartatas aktyviajame centre sudaro katalizinę triadą, kuri veikia kaip protonų
šaudyklė. Kad ši protonų šaudyklė veiktų, vandenilinio ryšio susidarymui reikalinga labai tiksli geo-
metrinė sąveika tarp aspartato ir histidino šoninių grupių. Tačiau visose trijose serino peptidazių klasė-
se aspartato šoninės grupės išsidėstymas Ser-His atžvilgiu labai skiriasi, todėl tikėtina, kad reakcijos
metu nevyksta tiesioginė protonų pernaša tarp histidino ir aspartato. Kai kurie mokslininkai teigia, jog
reakcijų metu serino peptidazių aktyvieji centrai veikia ne kaip katalizinės triados, bet kaip dvi atskiros
diados – viena Ser-His ir kita His-Asp [26], tačiau viena aišku, kad aspartato karboksilato anijonas turi
įtakos histidino reaktyvumui.
Pirmasis kiekvienos fermentinės reakcijos etapas yra substrato molekulių prisijungimas fermento
aktyviajame centre. Tai įvyksta prieš katalizines stadijas susidarant fermento ir substrato kompleksui
E-S. Fermento aktyviajame centre gali prisijungti tik tos substratų molekulės, kurių struktūra atitinka
aktyviojo centro struktūrą, pvz., chimotripsino ir subtilizino klasių peptidazių substratiniai savitumų
skirtumai aiškinami remiantis jų aktyviųjų centrų struktūros ypatybėmis. Šios peptidazės prisijungia
substratus, sudarydamos vandenilinius ryšius tarp aminorūgščių liekanų, esančių aktyviojo centro -
klostėje, ir substrato P1–P4 aminorūgščių. Tai sudaro sąlygas prisijungti substratus, tačiau peptidazių
savitumą nulemia P1–S1 sąveika aktyviajame centre (24 pav.).

49
 A
His 57
Asp 102
Ser 195

P3 P2

Gly 193

Gly 216 P1-Arg

Ser 214

Asp 189

B
Asp 32 His 64

Gly 102 Ser 221

Gly 100

P3

P4 Asn 155
P2

P1-Phe
Gly 127 Ser 125

24 pav. Substratų prisijungimas serino peptidazių aktyviuosiuose centruose: A – tripsino poklasio

peptidazėse; B – subtilizino klasės peptidazėse
Subtilizinas nėra ypatingai savita peptidazė. Jo substratai yra įvairūs peptidai, kuriuose P1 padėty-
je yra aminorūgštys, turinčios dideles hidrofobines šonines grupes. Perona ir Craik pateikia tokią ami-
norūgščių, esančių P1 padėtyje, seką: Tyr, Phe>Leu, Met, Lys>His, Ala, Gln, Ser>>Glu, Gly [25]. Ge-
riausi subtilizino substratai, kurių P1 padėtyje yra tirozino arba fenilalanino liekanos, o blogiausi – glu-
tamo rūgštis arba glicinas. Subtilizinų aktyviųjų centrų S1 vieta yra lėkštas, platus plyšys, kurį sudaro
du -lakštai ir įvairaus ilgio kilpa (24 B pav.). Fermentų, kurie prisijungia substratus, P1 padėtyje tu-
rinčius lizino liekaną, S1 plyšio dugne yra glutamatas, sudarantis su lizinu druskų tiltelį. Jungiantis
substratui, neutralizuojamas krūvis.
Skirtingai nuo subtilizino klasės peptidazių chimotripsino klasės peptidazėse S1 yra gilus plyšys, į
kurį patenka substrato P1 aminorūgšties liekana. S1 plyšyje esančios aminorūgštys nulemia fermento
savitumą. Chimotripsino klasės fermentai dar yra skirstomi į tris poklasius: tripsino, chimotripsino ir
elastazės. Tripsino poklasio peptidazėse 189 padėtyje S1 plyšio dugne yra konservatyvi aspartato lie-
50
kana, todėl šie fermentai prisijungia substratus, kurių P1 padėtyje yra argininas arba lizinas (24 A
pav.). Chimotripsino ir elastazės poklasių S1 plyšyje yra hidrofobinių aminorūgščių šoninės grupės,
todėl šių poklasių peptidazės prisijungia substratus, kurių P1 padėtyje yra nepolinės aminorūgštys. Ki-
tų aminorūgščių liekanos, esančios S1 plyšyje, taip pat turi įtakos peptidazių savitumui. Elastazės pok-
lasio fermentų S1 plyšyje yra daug didelių nepolinių aminorūgščių šoninių grupių, todėl čia gali prisi-
jungti tik tie substratai, kurių P1 padėtyje yra nedidelės hidrofobinių aminorūgščių šoninės grupės.
Skirtingai nuo elastazės poklasio fermentų chimotripsino poklasio peptidazių S1 plyšyje yra nedidelės
aminorūgščių šoninės grupės (pvz., glicinas), todėl šie fermentai prisijungia substratus, kurių P1 padė-
tyje yra tirozinas arba fenilalaninas.
Serino peptidazės: 1) reikiamoje erdvinėje orientacijoje aktyviajame centre prisijungia substratų
molekules (tarp substrato P1–P4 aminorūgščių ir fermento aktyviojo centro susidaro vandenilinių ryšių
tinklas); 2) stabilizuojama aktyviajame centre susidariusi pereinamoji būsena (pvz., tetraedrinis oksi-
anijoninis tarpinis junginys); 3) stereocheminio atitikimo principu atrenkami substratai, kurie gali pri-
sijungti aktyviajame centre ir dalyvauti reakcijoje.
Apžvelgus serino peptidazių veikimo mechanizmus, galima išsamiau susipažinti su pagrindiniais
fermentinės katalizės principais.

2.12. Fermentų ir substratų komplementarumas. Sąveikos energijos

panaudojimas katalizėje

Norėdami pagreitinti chemines reakcijas, chemikai modeliuoja fermentų veiklą. Cheminių reakcijų
greitį galima padidinti bendrosios rūgštinės-bazinės bei nukleofilinės katalizės metu, taip pat panaiki-
nant reakcijai nepalankius entropinius veiksnius. Tačiau chemikų atliekamos reakcijos modelinėse sis-
temose vyksta žymiai lėčiau nei fermentinės reakcijos. Dar 1930 m. J.B.S. Haldane teigė, jog katalizei
fermentai naudoja sąveikos energiją, susidarančią jungiantis substratams aktyviuosiuose centruose.
Sąveikos energijos panaudojimas sumažina aktyvacijos energijos barjerą.
Šiame skyriuje aptarsime, kokiu būdu sąveikos energija panaudojama aktyvacijos energijos, le-
miančios konstantos kkat/KM skaitinę vertę, sumažinimui. Tačiau vien šios aktyvacijos energijos suma-
žinimas yra nepakankamas, kad žymiai padidėtų fermentinės reakcijos greitis. Dalis sąveikos energijos
turi būti panaudojama aktyvacijos energijos, lemiančios konstantos kkat skaitinę vertę, sumažinimui.

2.12.1. Sąveikos energijos įtaka konstantos kkat/KM skaitinei vertei

KM kkat
E + S ES ‡
E + P
Gs G
kkat/KM
‡
E + S ES
‡
GPB
51
 Fermento ir substrato sąveikos reakcijos, kurios metu susidaro pereinamoji būsena ES ‡, greičio
konstanta yra kkat/KM. Pusiausvyros tarp E + S ir pereinamosios būsenos ES‡ pusiausvyros konstanta
‡
yra proporcinga aktyvacijos energijos pokyčiui ΔGPB , lemiančiam konstantos kkat/KM skaitinę vertę.
‡
ΔGPB aktyvacijos energijos pokytis susideda iš dviejų sudedamųjų dalių: energetiškai nepalankios da-

lies G‡ (cheminių ryšių susidarymo ir suirimo aktyvacijos energija) ir energetiškai palankios dalies
Gs. Taigi

‡
GPB  G ‡  Gs , (2.12)
‡
čia: ΔGPB ir G‡ skaitinės vertės yra teigiamos, o Gs – neigiama. 25 pav. parodytas Gibso lai-

svosios energijos kitimas paprastam Michaelio-Menten fermentinės reakcijos mechanizmui.

‡
ES

‡
GPB G
‡
E+S

G
Gs

ES

Reakcijos eiga

25 pav. Gibso laisvosios energijos pokytis Michaelio-Menten fermentinės reakcijos mechanizmui

Įstačius (2.12) lygties vertes į (2.3) lygtį, gauname:

k kat k T
RT ln  RT ln B  G ‡  Gs . (2.13)
KM h
Fermento ir substrato sąveikos metu gaunama energija panaudojama aktyvacijos energijos, le-
miančios konstantos kkat/KM skaitinę vertę, sumažinimui.

2.12.2. Sąveikos ir aktyvacijos energijų virsmai

Didžiausia sąveikos tarp fermento ir substrato molekulių energija yra tuomet, kai fermento akty-
viojo centro struktūra yra komplementari substrato molekulių struktūrai. Kadangi reakcijos metu subst-
rato struktūra kinta (pradžioje susidarant pereinamajai būsenai, o vėliau reakcijos produktams), tai ne-
pakitęs fermento aktyvusis centras gali būti komplementarus tik vienai substrato struktūrinei formai.
Kaip minėta, kataliziškai palanku yra tai, kad fermento aktyvusis centras būtų komplementarus perei-
namosios būsenos substratams. Kai substrato struktūra kinta, susidarant pereinamajai būsenai, sąveikos
energija padidėja ir tai sumažina aktyvacijos energiją, lemiančią konstantos kkat vertę. Jeigu fermento
aktyvusis centras būtų komplementarus pradinei substrato struktūrai, tai, susidarant pereinamajai būse-

52
nai, sąveikos energija sumažėtų, o tai padidintų konstantos kkat vertę lemiantį aktyvacijos energijos
kiekį.
Tarkime, kad padidiname fermento sąveikos su substratu energiją, įterpdami papildomą cheminę
grupę jo aktyviajame centre, pvz., prie alanino šoninės grupės, esančios aktyviajame centre, prijun-
giama hidroksilo grupė. Taip alaninas paverčiamas serino liekana, kuri gali sudaryti papildomus van-
denilinius ryšius su substrato molekulėmis ir tai būtų papildomas įnašas (GR) į sąveikos energiją. Pa-
nagrinėkime, kurioje reakcijos stadijoje panaudojama sąveikos energija.
‡
‡ Stabilizuojamas ES ir ES
ES

GR

‡
G E+S GPB G

‡
GPB

ES GR

Reakcijos eiga

‡
Stabilizuojamas tik ES Stabilizuojamas tik ES

GR

G G
‡ ‡
GPB GPB

GR

Reakcijos eiga

26 pav. Papildomos sąveikos energijos GR panaudojimas, kai [S] > KM. Sąveikos energijos pa-
naudojimas ES‡ komplekso stabilizavimui sumažina aktyvacijos energiją GR verte. ES komplek-
so stabilizavimas padidina aktyvacijos energiją GR verte. Vienodu laipsniu stabilizuojant ES ir
ES‡ kompleksus, aktyvacijos energija nekinta
Kai [S] didesnė už KM ir fermento molekulės yra įsotintos substratu, tai reakcijos greitis
v = kkat[E]o. Tuomet galimi trys atvejai. Paprasčiausias atvejis, kai sąveikos energija pasiskirsto tolygiai
tarp fermento-substrato (ES) ir fermento–pereinamosios būsenos (ES‡) kompleksų ir taip Gibso laisvo-
ji energija abiem atvejais sumažėja vienodai. Tuomet fermento aktyvusis centras yra komplementarus
tiek substrato molekulėms, tiek pereinamosios būsenos substratams. Tai vadinamasis tolygus sąveikos

53
energijos pasiskirstymas. Toks sąveikos energijos pasiskirstymas sumažina KM, bet neturi įtakos kkat
vertei ir reakcijos greitis nepadidėja, o tai reiškia, kad papildoma grupė aktyviajame centre katalizėje
nereikšminga (26 pav.).
Kitu atveju, kai sąveikos energija panaudojama tik fermento-substrato (ES) komplekse, jo energija
sumažėja, o fermento–pereinamosios būsenos komplekso (ES‡) nepakinta. Tuomet konstantos kkat ver-
tę lemianti aktyvacijos energija padidėja, o reakcijos greitis sumažėja. Šiuo atveju fermento aktyvusis
centras yra komplementarus substrato molekulėms (26 pav.). Kai fermento aktyviojo centro struktūra
yra komplementari tik pereinamosios būsenos substratų molekulėms ir sąveikos energija panaudojama
pereinamosios būsenos komplekse (ES‡), tai sumažėja šio komplekso energija, o fermento-substrato
(ES) komplekso energija nekinta. Tik šiuo atveju konstantos kkat vertę lemianti aktyvacijos energija
sumažėja ir reakcijos greitis padidėja.
Aptarkime papildomos grupės įtaką sąveikos energijos dydžiui, kai [S] mažesnė už KM (27 pav.).

‡
Stabilizuojamas ES ir ES
‡
ES
GR

G G

‡
ES ‡
GPB GPB
GR

E+S

Reakcijos eiga

‡
Stabilizuojamas tik ES Stabilizuojamas tik ES

GR

G G
‡ ‡
GPB GPB

GR

Reakcijos eiga

27 pav. Papildomos sąveikos energijos GR panaudojimas, kai [S] < KM. Sąveikos energijos pa-
naudojimas ES‡ komplekso arba abiejų (ES ir ES‡) kompleksų stabilizavimui sumažina aktyvaci-
‡
jos energiją GR verte. ES komplekso stabilizavimas neturi įtakos aktyvacijos energijos ΔGPB
dydžiui
54
 Kai [S] < KM, ES komplekso Gibso laisvoji energija yra didesnė nei būsenos E + S, o reakcijos
greitis v = (kkat/KM)[E]o[S]. Kai sąveikos energija panaudojama komplekso ES ‡ arba abiejų kompleksų
(ES ir ES‡) stabilizavimui, tuomet aktyvacijos energija sumažėja GR verte ir reakcijos greitis padidė-
ja. Kai papildomos grupės įterpimas stabilizuoja tik ES kompleksą, tuomet ši grupė nėra svarbi katali-
zėje (27 pav.).
Fermento aktyviajame centre įterpta cheminė grupė, kuri yra komplementari pereinamosios būse-
nos substratų molekulėms, sumažina reakcijos aktyvacijos energiją, tačiau neturi įtakos substrato mo-
lekulių deformacijoms aktyviajame centre. Apibendrinę, galima teigti, kad kai [S]<KM, tolygus sąvei-
kos energijos pasiskirstymas padidina kkat/KM vertę ir tuomet reakcijos greitis padidėja. Kai kuriais at-
vejais, kai [S]>KM, tolygaus sąveikos energijos pasiskirstymo metu sumažėja KM vertė. Sąveikos ener-
gijos panaudojimas pereinamosios būsenos stabilizavimui taip pat padidina reakcijos greitį.

‡
ES

GR
‡
Go

E+S

Gj

GR

ES

Reakcijos eiga

28 pav. Gibso laisvosios energijos pokytis, kai fermento aktyvusis centras yra komplementarus
substrato molekulėms (punktyrinė linija) ir pereinamosios būsenos substratui (ištisinė linija). Gj
vertė yra neigiama, o Go‡ ir GR vertės teigiamos

Kai fermento aktyviojo centro struktūra yra komplementari pereinamosios būsenos substratų mo-
lekulėms, tai fermentinės reakcijos kkat/KM konstantos skaitinė vertė yra didžiausia. Tarkime, kad di-
džiausias galimas sąveikos energijos pokytis yra Gj. Jeigu fermento aktyvusis centras būtų komple-
mentarus pradinių substratų molekulėms, tai šis energijos kiekis išsiskirtų susidarant pradiniam fer-
mento ir substrato kompleksui ES, kuriame substratų molekulės būtų stipriai prijungtos aktyviajame
centre ir KM skaitinė vertė būtų maža. Tuomet, susidarant pereinamajai būsenai ir kintant substrato
struktūrai, turėtų sumažėti sąveikos energija ir kartu konstantos kkat vertė. Jeigu šis sąveikos energijos
sumažėjimas yra nepalankus ir lygus GR, o cheminių ryšių susidarymo ir suirimo aktyvacijos energi-
jos pokytis yra Go‡ , tai aktyvacijos laisvosios energijos pokytis, lemiantis konstantos kkat vertę

G ‡  Go‡  GR ir Gs  G j (28 pav.). Aktyvacijos energija, lemianti konstantos kkat/KM vertę,

yra lygi G ‡  Gs , t.y.

55
 GPB
‡
 Go‡  GR  G j . (2.14)

Jeigu sąveikos energijos pokytis Gj yra panaudojamas vien pereinamojoje būsenoje, tai fermento
ir substrato komplekso ES susidarymo metu dėl atsiradusios nepalankios energijos GR padidėja kons-
tantos KM vertė. Tuomet, reakcijos metu susidarant pereinamajai būsenai, padidėja sąveikos energija ir
tuo pačiu metu konstanta kkat. Taigi G ‡  Go‡  GR ir Gs  G j  GR , o aktyvacijos laisvosios
‡
energijos pokytis, lemiantis konstantos kkat/KM vertę GPB  G ‡  Gs , t.y.

GPB
‡
 Go‡  G j . (2.15)
Palyginę (2.14) ir (2.15) lygtis, matome, kad tada, kai fermentas yra komplementarus pereinamo-
sios būsenos substratams, tai kkat/KM padidėja exp(GR/RT) kartų, o konstantos kkat/KM skaitinė vertė
nepriklauso nuo pradinio komplekso ES susidarymo energijos.

2.12.3. Eksperimentai, įrodantys sąveikos energijos panaudojimą katalizėje

Sąveikos energijos panaudojimo eksperimentiniai duomenys buvo gauti tiriant serino peptidazių
veikimo mechanizmus. Šių fermentų aktyvieji centrai turi vietas, kuriose gali prisijungti tik tam tikro
dydžio polipeptidų substratai (24 pav.). Chimotripsino aktyviajame centre gali prisijungti tik tokios
substratų molekulės, kurių aminorūgščių šoninės grupės yra didelės (Phe, Tyr). Nustatyta, kad kuo di-
desnės polipeptido substrato aminorūgščių šoninės grupės, tuo daugiau sąveikos energijos panaudoja-
ma. Tuomet konstantos kkat/KM vertės padidėja. Panašiai, ilginant elastazės substratų polipeptidinę
grandinę, didėja kkat/KM skaitinės vertės. Reikia pažymėti, kad visais šiais atvejais KM nemažėja, t.y.
sąveikos energija nenaudojama substratų prisijungimui. Sąveikos energijos padidėjimas tiesiogiai pa-
didina kkat. Panašūs rezultatai gauti su pepsinu. Įvairių substratų, panaudotų pepsino katalizuojamoje
reakcijoje, KM yra lygi apie 0,1 mM. Sąveikos energija taip pat panaudojama konstantos kkat padidini-
mui. Didesnėms substratų molekulėms konstantos kkat/KM skaitinės vertės yra didesnės. Gauti rezulta-
tai pateikiami 7 lentelėje.

7 lentelė. Fermento ir substrato sąveikos energijos panaudojimas katalizėje

Fermentai ir substratai kkat (s-1) KM (mM) kkat/KM (s-1M-1)
a
Chimotripsinas
Ac-Tyr-NH2 0,17 32 5
Ac-Tyr-Gly-NH2 0,64 23 28
Ac-Tyr-Ala-NH2 7,5 17 440
Ac-Phe-NH2 0,06 31 2
Ac-Phe-Gly-NH2 0,14 15 10
Ac-Phe-Ala-NH2 2,8 25 114
Elastazė b (skaido ties NH2)
Ac-Ala-Pro-Ala-NH2 0,09 4,2 21
Ac-Pro-Ala-Pro-Ala-NH2 8,5 3,9 2,2  103
Ac-Gly-Pro-Ala-NH2 0,02 33 0,5
Ac-Pro-Gly-Pro-Ala-NH2 2,8 43 64
Pepsinas c (skaido Phe-Phe ryšį)
56
 Fermentai ir substratai kkat (s-1) KM (mM) kkat/KM (s-1M-1)
Phe-Gly-Phe-Phe-OP4P 0,5 0,3 1,7  103
Z-Phe-Gly-Phe-Phe-OP4P 25 0,11 2,2  105
Z-Ala-Gly-Phe-Phe-OP4P 145 0,25 5,8  105
Z-Ala-Ala-Phe-Phe-OP4P 282 0,04 7  106
Z-Gly-Ala-Phe-Phe-OP4P 409 0,11 3,7  106
Z-Gly-Ile-Phe-Phe-OP4P 13 0,07 1,8  105
Z-Gly-Leu-Phe-Phe-OP4P 134 0,03 4,2  106
Phe-Gly-Gly-Phe-Phe-OP4P 6 0,6 1  104
Z-Phe-Gly-Gly-Phe-Phe-OP4P 127 0,13 9,8  105
a
25ºC temperatūra, pH 7,9. (W.K. Baumann, S.A. Bizzozero, H. Dutler, FEBS Lett. 8, 257 (1970); Eur.
J. Biochem. 39, 381 (1973)).
b
37ºC temperatūra, pH 9,0. (R.C. Thompson, E.R. Blout, Biochemistry 12, 51 (1973)).
c
37ºC temperatūra, pH 3,5; OP4P – 3-(4-piridil)-1-oksi-propilas (G.P. Sachdev, J.S. Fruton, Biochemistry
9, 4465 (1970)).

Puikus sąveikos energijos panaudojimo katalizėje pavyzdys yra chimotripsino katalizuojama sin-
tetinių esterių hidrolizė. Kai didėja substratų molekulių šoninių grupių dydis, kurios chimotripsino ak-
tyviajame centre jungiasi hidrofobinėje srityje, kkat/KM padidėja net 106 kartų. Reakcijos metu sąveikos
energija panaudojama fermento-substrato komplekso (ES) disocijacijos konstantos sumažinimui bei
acilinimo ir deacilinimo reakcijų greičių padidinimui (8 lentelė).

8 lentelė. N-acetilaminorūgščių metilo esterių hidrolizės chimotripsinu kinetiniai parametrai a

Ks k2 k3
E + RCO2CH3 E . RCO2CH3 RCO E E + RCO2H

Aminorūgštis k2 (s-1) k3 (s-1) Ks (mM) kkat/KM (s-1M-1)

Gly 0,49 0,14 3,38  103 0,13
But 8,8 1,7 417 21
Norval 35,6 5,93 100 360
Norleu 103 19 34 3  103
Phe 796 111 7,6 1  105
Tyr b 5  103 200 17 3  105
a
25ºC temperatūra, pH 7,8
b
Etilo esteris

Tiesioginiai eksperimentiniai duomenys, įrodantys fermentų komplementarumą pereinamosios

būsenos substratams, gauti panaudojant sintetinius pereinamosios būsenos substratų analogus. Tokie
tyrimai buvo atlikti su serino peptidazėmis ir lizocimu. Šį tyrimo metodą 1940 m. pirmą kartą panau-
dojo L. Polingas. Chemikai, žinodami organinių reakcijų mechanizmus, gali susintetinti pereinamosios
būsenos substratų analogus, tinkančius fermentinėms reakcijoms. Lyginama sąveika tarp fermentų ir
pereinamosios būsenos substratų analogų, fermentų ir substratų.
Lizocimas katalizuoja peptidoglikanuose esančių polisacharidų hidrolizę, kuriuose N-
acetilmuramo rūgšties (NAM) liekana prijungta (1  4) ryšiu prie N-acetilgliukozamino (NAG), taip
pat glikozidinio ryšio hidrolizę tarp N-acetilgliukozamino liekanų chitodekstrinuose. Tiriant modelines
nefermentines šio tipo reakcijas, nustatyta, kad lizocimu katalizuojamos reakcijos vienas iš tarpinių
57
junginių yra oksokarbenio jonas, o reakcijos metu gliukopiranozės žiedo konformacija keičiasi iš „kė-
dės“ į „sofos“. Susintetintas pereinamosios būsenos substrato analogas (I), kurio molekulės laktono
žiedas pamėgdžiojo pereinamosios būsenos karbonio jono (II) struktūrą:

CH2OH CH2OH -OC

+ 2
(Asp-52)
O O

OH O OH H
(NAG)3 O (NAG)3 O
NH NH

C O C O

CH3 CH3
I II
Pereinamosios būsenos substrato analogas (I) labai stipriai prisijungia lizocimo aktyviajame centre –
Kd=8,310-8 M. Buvo palyginta lizocimo sąveika su pereinamosios būsenos substrato analogu ir subst-
ratais (NAG)4 ir NAG-NAM-NAG-NAG. Fermento (NAG)4 komplekso Kd=10-5 M, o komplekso
NAG-NAM-NAG-NAG – 5x10-6 M. Pereinamosios būsenos substrato analogas prisijungia 100 kartų
stipriau nei patys substratai. Manoma, kad tai įvyksta dėl elektrostatinės sąveikos, susidarančios tarp
neigiamai įkrautos Asp 52 liekanos, esančios lizocimo aktyviajame centre, ir laktono molekulėje kar-
bonilo grupės anglies atome esančio dalinio teigiamo krūvio.
Prolino racemazės katalizuojamoje reakcijoje prolino (III) chiralinis anglies atomas įgauna trikam-
pę konfigūraciją. Sintetiniai šios reakcijos pereinamosios būsenos substratų analogai (IV ir V) prisi-
jungia prolino racemazės aktyviajame centre 160 kartų stipriau nei prolinas.

-
CO2 -
+ -
CO2 CO2
N H N N
H2
H
III IV V
Pereinamosios būsenos substratų analogai 102–104 kartų stipriau prisijungia fermentų aktyviuo-
siuose centruose nei substratų molekulės. Tokio fermentų komplementarumo padidėjimo pereinamo-
sios būsenos substratams energinė vertė yra apie 20 kJ/mol, pvz., serino peptidazių aktyviuosiuose
centruose prisijungus polipeptidiniam substratui ir reakcijos metu susidarant naujam papildomam van-
deniliniam ryšiui tarp substrato karbonilo grupės deguonies atomo ir fermento aktyviajame centre e-
sančio His liekanos, sąveika sustiprėja 20–25 kJ/mol.
Aiškinant rezultatus, gautus tiriant fermentų ir pereinamųjų būsenų substratų analogų sąveiką, ga-
limos tam tikros klaidos ir netikslumai, pvz., fermentų aktyviuosiuose centruose esančios nedidelės
cheminės grupės gali labai padidinti savitosios sąveikos energiją. Papildoma metileno grupė sąveikos
energiją padidina 12 kJ/mol, tačiau, tais atvejais, kai aktyviajame centre nėra savitos sąveikos, tai są-
veikos energija gali padidėti dėl bendrųjų hidrofobinių efektų. Netikslumai galimi tiriant daugiasubst-

58
ratines reakcijas. Eksperimentinius rezultatus gali iškreipti chelatinio efekto pasireiškimas, pvz., dau-
giavalenčiai junginiai, tokie kaip EDTA, žymiai stipriau prijungia metalų jonus nei vienvalenčiai li-
gandai. Prisijungiant metalų jonams prie daugiavalenčių ligandų, žymiai labiau sumažėja sistemos ent-
ropija nei prisijungiant prie vienvalenčių ligandų. Šis reiškinys stebimas fermentinėse reakcijose pa-
naudojant „daugiasubstratinius“ ar „daugiaproduktinius“ analogus. Tarkime, kad pereinamosios būse-
nos substratų analogai A ir B prisijungia fermento aktyviajame centre šalia vienas kito ir jų laisvoji
sąveikos energija yra atitinkamai x ir y kJ. Jeigu pereinamosios būsenos substrato analogas A–B pana-
šiai prisijungtų fermento aktyviajame centre, tai jo sąveikos laisvoji energija būtų lygi Gsav = x+y+S,
S – papildomas energijos kiekis, nes jungiantis A ir B molekulėms, sistemos entropija sumažėja labiau
nei jungiantis A–B, o tai reiškia, kad daugiasubstratiniai analogai prisijungia stipriau.
Fermentų komplementarumas pereinamosios būsenos substratų molekulėms tiriamas panaudojant
antikūnus, turinčius katalizinių savybių (abzimai). Antikūnai – tai baltymai, kuriuos gamina imuninės
sistemos ląstelės. Jie atpažįsta ir prisijungia antigenų molekules. Tyrinėdamas antikūnus, Ehrlich iškėlė
labai svarbią biologijoje komplementarios sąveikos tarp molekulių hipotezę. 1940 m. L. Polingas rašė,
kad fermentai yra antikūnai, kurie reakcijos metu savitai atpažįsta pereinamosios būsenos substratų
molekules. Monokloninių antikūnų radimas paskatino biologus ir chemikus ieškoti antikūnų, atpažįs-
tančių pereinamosios būsenos molekules. Tokie antikūnai vadinami abzimais. Jų katalizinė galia yra
žymiai mažesnė nei fermentų (pagreitina reakcijas 102–104 kartų). Pereinamosios būsenos substratų
analogai panaudojami sąveikai su abzimais tirti. Jeigu pereinamosios būsenos substratų analogai nėra
reikiamos struktūros, tai jie nesąveikauja su abzimais ir antikūnų koncentracija nepadidėja. Tik tinka-
mos struktūros pereinamosios būsenos substratų analogai sukelia antikūnų (abzimų) koncentracijos
padidėjimą.
Fermentų ir pereinamosios būsenos substratų sąveika yra tiriama kryptingos mutagenezės metodu.
Baltymų inžinerijos metodais aktyviajame centre yra pakeičiamos svarbių aminorūgščių liekanos ki-
tomis aminorūgštimis ir stebima sąveika bei katalizė.
Fermentai yra labai sudėtingi katalizatoriai ir dažnai aktyvacijos energijos barjero sumažinimui
panaudoja ne tik įvairias sąveikas aktyviajame centre, bet ir už aktyviojo centro ribų ir taip indukuoja
reakcijos pereinamosios būsenos susidarymą. Todėl modeliuoti įvairias fermentinės reakcijos stadijas
yra labai sudėtinga.

2.12.4. Fermentinių reakcijų greičio didinimo principai

Silpnesnė fermentų sąveika su substratais suteikia katalizinį pranašumą. Nors fermentų komple-
mentarumas pereinamosios būsenos substratams ir padidina konstantos kkat/KM skaitinę vertę, tačiau to
dar nepakanka, kad fermentinė reakcija pagreitėtų. Esant tam tikrai substrato koncentracijai, didžiau-
sias fermentinės reakcijos greitis priklauso nuo konstantų kkat ir KM verčių. 9 lentelėje pateikiami reak-
cijų greičiai esant skirtingoms konstantų kkat ir KM vertėms ir pastoviam kkat/KM santykiui. Didžiausias

59
greitis yra tuomet, kai KM> [S]. Norint padidinti reakcijos greitį, reikia padidinti konstantos KM vertę,
todėl fermentai ir prisijungia substratus silpniau nei pereinamojoje būsenoje esančias molekules.

9 lentelė. Fermentinės reakcijos greitis kintant konstantoms kkat ir KM, tačiau esant pastoviam
kkat/KM santykiui a
kkat/KM = 106 M-1 s-1 ; [S] = 10-3 M

KM (M) kkat (s-1) Greitis b (s-1)

10-6 1 1
10-5 10 9
10-4 102 90
10-3 103 500
10-2 104 909
10-1 105 990
1 106 999
a
1) fermento molekulės yra komplementarios pereinamosios būsenos substratams, todėl kkat/KM santykis
yra didžiausias; 2) kad šis santykis nepakistų, turėtų padidėti konstantos KM vertė. kkat/KM ir [S] vertės yra
sutartinės.
b
Reakcijos metu susidariusio produkto kiekis išreikštas moliais per vieną sekundę esant vienam moliui
fermento.

Atrodytų, kad konstantos KM padidėjimas prieštarauja nuomonei, kad mažos KM vertės yra svar-
bios fermentinėje katalizėje.

(a) KM < [S] (b) KM > [S]

‡ ‡
ES ES
‡
GPB
‡
GPB
E+S E+S ES
G G

G

ES

Reakcijos eiga Reakcijos eiga

29 pav. Du fermentų evoliucionavimo atvejai. Fermentų molekulės vienodai tvirtai prisijungia pe-
reinamosios būsenos substratus, tačiau: A atveju substratų molekulės stipriai prisijungia aktyvia-
jame centre, B atveju – silpnai. [S] abiem atvejais vienoda. A atveju reakcijos ES  ES‡ aktyva-
‡ ‡
cijos energija lygi ΔGPB +G; B atveju reakcijos E + S  ES‡ aktyvacijos energija ΔGPB (abiem
atvejais substrato koncentracija nėra standartinė 1 M, o tokia, kokia yra ląstelėse, arba eksperi-
mentuose in vitro).

Šiame skyriuje pateiksime porą pavyzdžių, kurie įrodys konstantos KM didinimo būtinumą katali-
zėje. Tarkime, kad [S]> KM. Reakcijos metu susidaręs fermento ir substrato kompleksas (ES) turi ma-
‡
žesnę energiją nei E+S ir aktyvacijos energija yra ΔGPB +G (29 pav.). Jeigu reakcija vyktų tomis pa-

čiomis sąlygomis, išskyrus tai, kad KM>[S], tai tuomet susidaręs kompleksas (ES) turėtų didesnę ener-

60
 ‡
giją nei E+S, o reakcijos aktyvacijos energija būtų mažesnė ir lygi ΔGPB . Sumažėjus konstantos KM
vertei, fermentinės reakcijos eiga patektų į tam tikrą termodinaminę „duobę“. Didesnė konstantos KM
vertė suteikia fermento ir substrato kompleksui (ES) galimybę tapti termodinamiškai palankiu „laipte-
liu“ (29 pav.).
Michaelio-Menten lygtį galima užrašyti tokia forma:

k kat
v  [E][S] . (2.16)
KM
Santykis kkat/KM susieja fermentinės reakcijos greitį su reakcijos mišinyje esančio laisvojo fermen-
to koncentracija [E]. Kai substrato koncentracija yra maža, tuomet [E][E]0, [E]0 – pradinė fermento
koncentracija. Didžiausią reakcijos greitį fermento molekulės galėtų pasiekti dviem būdais: a) didėjant
kkat/KM vertei, kai fermentas yra komplementarus pereinamosios būsenos substratų molekulėms; b) di-
dinant konstantos KM vertę ir taip padidinant laisvojo fermento koncentraciją [E] reakcijos mišinyje
(2.16) lygtis. Fermentai evoliucionavo didėjant konstantos KM vertėms, kurios buvo derinamos su ląs-
telėse esančių substratų koncentracijomis. Dėl to padidėdavo konstanta kkat. Šis evoliucinis spaudimas
labai susilpnėja, kai KM tampa didesnė už substrato koncentraciją. Kai KM=[S], pusė fermento moleku-
lių, esančių reakcijos mišinyje, yra laisvos formos ir pagal (2.16) lygtį reakcijos greičio vertė yra lygi
50 proc. maksimalios greičio vertės. Kai KM=5[S], 5/6 fermento molekulių yra laisvos formos ir reak-
cijos greičio vertė yra lygi 83 proc. maksimalios vertės. Tolesnis konstantos KM didėjimas tik nežymiai
padidina reakcijos greitį. Pasiekiama riba, nuo kurios pradeda silpnėti pereinamosios būsenos substrato
ir fermento sąveika. Tai ypač aktualu didelėms substratų molekulėms, esančioms koncentruotuose tir-
paluose.
Evoliucijos eigoje konstantos KM didėjimas ir buvo prielaida fermentinių reakcijų greičio padidi-
nimui, ir šį principą naudoja dauguma fermentų, tačiau yra atvejų, kai reakcijos greitis yra kontroliuo-
jamas. Metabolinio kelio reakcijos dažniausiai yra reguliuojamos moduliuojant kelių fermentų akty-
vumą. Šių kontroliuojamų fermentų aktyvumas dažniausiai reguliuojamas alosteriniais efektoriais, kei-
čiant KM vertes svarbiausiems substratams. Reguliuojamų fermentų substratų KM vertės atitinka meta-
bolinio kelio vertes ir ne visuomet yra tokios, kad reakcijos greitis būtų didžiausias. Mažos KM vertės
dažniausiai yra pirmųjų metabolinio kelio fermentų, kur kontroliuojamas atitinkamų substratų pateki-
mas į šį kelią. Mažos KM vertės apsaugo nuo substratų pertekliaus susidarymo ir tarpinių reakcijos
produktų kaupimosi. Pavyzdžiui, pirmojo glikolizės fermento heksokinazės KM vertė gliukozei yra 0,1
mM, o gliukozės koncentracija žmogaus eritrocituose yra apie 5 mM. Net 10 kartų gliukozės koncent-
racijos padidėjimas arba sumažėjimas nepakeistų glikolizės greičio.

61
 2.12.5. Konstantos KM vertės

Sąveikos tarp fermentų ir substratų energija gali būti didelė, tačiau realios KM skaitinės vertės daž-
nai yra didesnės. Pvz., NAD+ molekulė. Ši didelė molekulė sudaryta iš dviejų ribozės liekanų, adenino
ir nikotinamido. NAD+ molekulėje ribozės liekanos sujungtos difosfatiniu ryšiu. Jeigu, NAD + moleku-
lei jungiantis fermento aktyviajame centre būtų realizuojamos visos galimos sąveikos, tai disociacijos
konstantos vertė būtų lygi 10 -20 M. Iš tikrųjų NAD+ disociacijos iš tetramerinės glicerolio aldehido 3-
fosfato dehidrogenazės aktyviojo centro, konstanta yra maža ir lygi 10 -11 M. Tačiau dažniausiai NAD+
molekulių KM ir disociacijos konstantų vertės yra tarp 0,1 ir 1 mM. ATP molekulių konstantos KM
skaitinės vertės dažniausiai yra nuo 0,1 iki 10 mM, tačiau ATP ir miozino sąveikos disociacijos kons-
tanta yra lygi 10-13 M.
Palyginti konstantų KM vertes su ląstelėse esančių substratų koncentracijomis yra sudėtinga, nes
dažniausiai šios koncentracijos nežinomos. Tačiau yra žinomi keli gerai apibūdinti atvejai, pvz., kar-
boanhidrazės katalizuojama reakcija, nes anglies dvideginio ir hidrokarbonato koncentracijas kraujyje
lengva nustatyti. Ląstelėje tik 6 proc. šio fermento molekulių yra įsotintos abiem substratais, o KM ver-
tė CO2 molekulėms yra labai didelė.

2.12.6. Glikolizės metabolitų koncentracijos ląstelėse ir KM konstantų vertės

Glikolizės fermentai yra labai gerai ištirti ir jų metabolitų koncentracijos ląstelėse yra žinomos.
Nereguliuojamiems glikolizės fermentams šie duomenys pateikiami 10 lentelėje ir 30 pav.

10 lentelė. Kai kurių glikolizės metabolitų koncentracijos ląstelėse ir KM vertės a

Fermento Koncentracija KM
Fermentas Substratas KM /[S]
šaltinis (M) (M)
Gliukozės 6-fosfato i- Smegenys G6P 130 210 1,6
zomerazė Raumenys b
G6P 450 700 1,6
Smegenys FDP 200 12 0,06
FDP 32 100 3,1
Aldolazė c
Raumenys G3P 3 1000 333
DHAP 50 2000 40
d
Eritrocitai G3P 18 350 19
Triozių fosfatų izomera-
G3P 3 460 153
zė Raumenys e
DHAP 50 870 17
Smegenys G3P 3 44 15
Glicerolio aldehido 3- G3P 3 70 23
fosfato dehidrogenazė Raumenys f
NAD +
600 46 0,08
Pn 2000 >10 g
1,3 DPG <1 9 >9
Smegenys
ADP 1500 70 0,05
Fosfoglicerato kinazė Eritrocitai h
3PG 118 1100 9,3
3PG 60 1200 200
Raumenys i
ADP 600 350 0,6
Smegenys 3PG 40 240 6
Fosfoglicerato mutazė
Raumenys j 3PG 60 5000 83

62
 Fermento Koncentracija KM
Fermentas Substratas KM /[S]
šaltinis (M) (M)
Smegenys 2PG 4,5 33 7
Enolazė
Raumenys k 2PG 7 70 10
PEP 23 200 9
Piruvato kinazė Eritrocitai l
ADP 138 600 4,4
Smegenys Pyr 116 140 1,2
Pyr 51 59 1,2
Laktato dehidrogenazė Lac 2900 8400 2,9
Eritrocitai m
NADH 0,01n 10 o 100
NAD+ 33 150 4,6
Pelė Gly-P 170 37 0,22
Glicerolio fosfato dehid-
Gly-P q 220 190 0,9
rogenazė Raumenys p
DHAP 50 190 3,8
a
Santraupos: G6P – gliukozės 6-fosfatas, F6P – fruktozės 6-fosfatas, FDP – fruktozės 1,6-bisfosfatas,
G3P – glicerolio aldehido 3-fosfatas, DHAP – dihidroksiacetono fosfatas, Pn – ortofosfatas, 1,3DPG – 1,3-
bisfosfogliceratas, 3PG – 3-fosfogliceratas, 2PG – 2-fosfogliceratas, PEP – fosfoenolpiruvatas, Pyr – piru-
vatas, Lac – laktatas, Gly-P – L-glicerolio fosfatas. Lentelėje pateikti pelės smegenų fermentai ir metaboli-
tai [O.H. Lowry, J.V. Passonneau, J. Biol. Chem. 239, 31 (1964)]. Žmogaus eritrocitų metabolitai [S. Mi-
nakami, T. Saito, C. Suzuki, H. Yoshikawa, Biochem. Biophys. Res. Commun. 17, 748 (1964)]. Žiurkės
diafragmos metabolitai [E.A. Newsholme, P.J. Randle, Biochem. J. 80, 665 (1961)], H.J. Hohorst, M.
Reim, H. Bartels, Biochem. Biophys. Res. Commun. 7, 137 (1962)]. Metabolitų koncentracijos suskaičiuo-
tos, kai smegenų ir raumenų ląstelėse yra 60proc. vandens, o eritrocituose – 70proc. Skaičiuojant metaboli-
tų koncentracijas nėra atsižvelgta į jų kompartmentalizaciją raumenų ir smegenų ląstelėse. Nurodytos kon-
centracijos yra ląstelių citozolyje [A.L. Greenbaum, K.A. Gumaa, P. McLean, Archs. Biochem. Biophys.
143, 617 (1971)]. Metabolitų koncentracijos pelės smegenyse yra tuojau pat po dekapitacijos.
b
J. Zalitis, I.T. Oliver, Biochem. J. 102, 753 (1967).
c
W.J. Rutter, Fedn. Proc. 23, 1248 (1964), P.D. Spolter, R.C. Adelman, S. Weinhouse, J. Biol. Chem. 240,
1327 (1965).
d
A.S. Schneider, W.N. Valentine, M. Hattori, H.L. Heins, New Engl. J. Med. 272, 229 (1965).
e
P.M. Burton, S.G. Waley, Biochem. Biophys. Acta 151, 714 (1968).
f
M. Oguchi, E. Gerth, B. Fitzgerald, J.H. Park, J. Biol. Chem. 248, 5571 (1973).
g
Kai G3P koncentracija yra didelė, tai ortofosfato KM ~ 6 mM ir reakcijos metu kaupiasi acilfermentas. Kai
G3P koncentracija yra maža, tai KM vertė yra neišmatuojamai didelė [P.J. Harrigan, D.R. Trentham, Bio-
chem. J. 143, 353 (1974)].
h
A. Yoshida, S. Watanabe, J. Biol. Chem. 247, 440 (1972).
i
D.R. Rao, P. Oesper, Biochem. J. 81, 405 (1961).
j
R.W. Cowgill, L.I. Pizer, J. Biol. Chem. 223, 885 (1956), S. Grisolia, W.W. Cleland, Biochemistry 7,
1115 (1968).
k
F. Wold, R. Barker, Biochim. Biophys. Acta 85, 475 (1964).
l
S.E.J. Staal, J.F. Koster, H. Kamp, L. Van Milligan-Boersma, C. Veeger, Biochim. Biophys. Acta 227, 86
(1971).
m
J.S. Nisselbaum, O. Bodansky, J. Biol. Chem. 238, 969 (1963).
n
Suskaičiuota iš laktato/piruvato koncentracijų santykio, kai NAD+ ir NADH yra pusiausvyroje, o pusiaus-
vyros konstantos vertė yra lygi 1,11 × 10-4 [R.L. Veech, L.V. Eggleston, H.A. Krebs, Biochem. J. 115, 609
(1969).
o
S.Rapoport, Essays in Biochemistry 4, 69 (1969).
p
T.P. Fondy, L. Levin, S.J. Sollohub, C.R. Ross, J. Biol. Chem. 243, 3148 (1968).
q
R.M. Denton, R.E. Yorke, P.J. Randle, Biochem. J. 100, 407 (1996).

Pateiktoje histogramoje matome, kad glikolizės metabolitų KM/[S] vertės daugiausia pasiskirsčiu-
sios srityse nuo 1 iki 10 ir nuo 10 iki 100. Iš visų glikolizės fermentų išsiskiria triozių fosfatų izomera-
zė, kuri yra „evoliuciškai tobula“. Nors jos substratų KM vertės yra didelės, tačiau šis fermentas veikia
labai efektyviai.
63
 15
15
F
e
r
m

Substratų skaičius
e
n 10
10
t
ų

s
k
a 55
i
č
i
u
s

0,01 0,1
0,01 0,1 0,1
0,1 11 1 10 10 100 100 1000
KKMM /[S]
/ [S]

30 pav. Glikolizės substratų KM/[S] verčių pasiskirstymo histograma

Apie konkrečių fermentų evoliucionavimą galima spręsti pagal konstantos kkat/KM skaitinę vertę.
„Evoliuciškai tobulų“ fermentų KM vertė turi būti didesnė už ląstelėje esančią substrato koncentraciją.
Didžiausia kkat/KM konstantos vertė gali būti artima fermento ir substrato sąveikos greičio konstantai,
kurios skaitinė vertė priklauso nuo šių molekulių difuzijos greičio. Ši vertė yra lygi 108-109 s-1M-1. To-
kius fermentų evoliucijos kriterijus puikiai atitinka karboanhidrazė ir triozių fosfatų izomerazė.
Yra vienas svarbus pastebėjimas, pagal kurį termodinamiškai nepalankių reakcijų kkat/KM konstan-
tų skaitinės vertės negali būti lygios greičių konstantoms, kurių vertės priklauso tik nuo difuzijos grei-
čio. Tai seka iš Haldane lygties, pagal kurią reakcijos pusiausvyros konstanta yra lygi tiesioginės ir
grįžtamosios reakcijų kkat/KM verčių santykiui. Jeigu nepalankios reakcijos kkat/KM vertė būtų lygi 108-
109 s-1M-1, tuomet pagal Haldane lygtį termodinamiškai palankios grįžtamosios reakcijos kkat/KM skai-
tinė vertė turėtų būti didesnė už difuzijos apspręstos greičio konstantos vertę. Termodinamiškai nepa-
lankioms reakcijoms didžiausia kkat/KM vertė gali būti rasta iš difuzijos lemiamos greičio konstantos ir
pusiausvyros konstantos sandaugos. Kai konstantos kkat/KM dydis yra lemiamas tik reaguojančių mo-
lekulių difuzijos greičio, tuomet reakcijos greitis yra aprašomas Briggs-Haldane, bet ne Michaelio-
Menten kinetinėmis lygtimis. Kuo fermentų molekulės yra „evoliuciškai tobulesnės“, tuo reikšminges-
nė tampa Briggs-Haldane kinetika.
Kokios turėtų būti „evoliuciškai tobulais“ fermentais katalizuojamų reakcijų greičių konstantų
vertės? Jeigu nebūtų jokių struktūrinių apribojimų, tai tokiais fermentais katalizuojamų tiesioginių re-
akcijų greičių konstantų vertės turėtų būti artimos galimai didžiausiai greičio konstantos vertei 6×10 12
s-1, 25°C temperatūroje, o fermento ir substrato sąveikos greičio konstantos dydį nulemtų tik molekulių
difuzijos greitis.

64
 3. Fermentinių reakcijų nuostoviosios būsenos kinetika

19 a. pabaigoje pasirodė pirmieji darbai, kuriuose buvo matuojami fermentinių reakcijų greičiai.
Tuo pačiu metu tokie darbai nepriklausomai buvo atliekami kelių mokslininkų grupių. 19 a. pabaigoje
dar nebuvo išgrynintas nė vienas fermentas, o reakcijos terpės rūgštingumo kontrolei nebuvo naudo-
jami buferiniai tirpalai. Fermentinių reakcijų greičiai buvo matuojami primityviai, tam tikrais laiko
tarpais nustatant susidariusių produktų koncentracijas. Nors buvo naudojami netobuli tyrimo metodai,
šie ankstyvieji tyrimai padėjo pagrindus šių dienų enzimologijai.
Dauguma pirmųjų fermentinių reakcijų kinetikos tyrimų atlikta su rūgimo fermentais, ypač su in-
vertaze, kuri katalizuoja sacharozės hidrolizę:

Sacharozė + H2O → gliukozė + fruktozė.

Vykdydami šią reakciją, C. O‘Sullivan ir V.W. Tompson padarė keletą svarbių atradimų [27]. Jie
įrodė, kad reakcijos greitis labai priklauso nuo terpės rūgštingumo, o tuomet, kai terpės „rūgštingumas
yra palankiausias“, reakcijos greitis yra proporcingas fermento koncentracijai. Reakcijos metu mažė-
jant substrato koncentracijai, greitis sumažėja. C. O‘Sullivan ir V.W. Tompson nustatė, kad reakcijos
greitis taip pat priklauso ir nuo substrato koncentracijos. Kai temperatūra yra maža, fermentinės reak-
cijos greitis dukart padidėja padidinus temperatūrą 10ºC, tačiau, skirtingai nuo daugumos įprastų che-
minių reakcijų, invertazės katalizuojama reakcija vyko tik tam tikroje temperatūroje (optimali tempera-
tūra) ir, didėjant arba mažėjant temperatūrai, reakcija gerokai sulėtėdavo. Šie mokslininkai taip pat į-
rodė, kad invertazė yra „tikrasis“ katalizatorius, nes reakcijos metu jis nesuirdavo ir nepasikeisdavo.
Be to, fermentas buvo aktyvus atlikus sacharozės hidrolizę, kurios kiekis 100 tūkst. kartų buvo dides-
nis už fermento kiekį. Sacharozė padidindavo invertazės termostabilumą. Kai reakcijos terpėje buvo
sacharozės, invertazė išlikdavo aktyvi padidinus temperatūrą net 25ºC. Tai buvo labai svarbus atradi-
mas, nes pirmą kartą įrodyta, kad invertazė jungiasi su savo substratu sacharoze. Panašius rezultatus
gavo A. Wurts, tyrinėdamas fibrino hidrolizę papainu [28]. Iš reakcijos mišinio A. Wurts išskyrė nuo-
sėdas, kuriose buvo papaino ir fibrino kompleksas. Fermento-substrato komplekso susidarymo idėją
kinetikoje toliau plėtojo A.J. Braunas [29]. A.J. Braunas atrado, kad fermentinių reakcijų greitis negali
būti aprašomas antrojo laipsnio greičio lygtimis. Jis įrodė, kad sacharozės hidrolizės greitis rūgimo
metu nepriklauso nuo sacharozės koncentracijos. Nors jo rezultatai prieštaravo C. O‘Sullivan ir V.W.
Tompson gautiems rezultatams, tačiau pakankamai dėmesio į tai nebuvo kreipiama, nes manyta, kad
katalizė grynais fermentais iš principo skiriasi nuo rūgimo metu vykstančių procesų. Šį prieštaravimą
pakoregavo E. Biuchnerio darbai, kuriais jis įrodė, kad iš mielių išgautas ekstraktas, kuriame nebuvo
gyvų ląstelių, taip pat gali sukelti rūgimą [30]. Tai paskatino A.J. Brauną dar kartą patikrinti anksčiau
gautus rezultatus [31]. Įsitikinęs, kad jie yra teisingi, A.J. Braunas įrodė, kad tokius pat rezultatus ga-
lima gauti panaudojant ir negryną invertazę. Jis padarė išvadą, kad tais atvejais, kai fermentinė reakcija

65
vyksta susidarant fermento-substrato tarpiniam junginiui, tai reakcijos greitis negali viršyti tam tikros
ribos. Susidaręs fermento-substrato tarpinis junginys egzistuoja tam tikrą laiką, todėl reakcijos greitis
yra didžiausias, esant tokiai substrato koncentracijai, kurios pakaktų įsotinti fermento molekules. Esant
mažoms substrato koncentracijoms, bendrą fermentinės reakcijos greitį riboja fermento-substrato
komplekso susidarymo greitis, todėl reakcijos greitis priklauso nuo substrato koncentracijos. V. Henri
kritiškai atsiliepė apie A.J. Brauno pasiūlytą fermentinės reakcijos modelį, pagal kurį fermento-
substrato kompleksas egzistuoja tam tikrą fiksuotą laiką [32, 33]. V. Henri pasiūlė fermentinės reakci-
jos mechanizmą, kuris iš principo yra labai panašus į A.J. Brauno mechanizmą. Pagal V. Henri fer-
mentinės reakcijos metu susidaro pusiausvyra tarp laisvojo fermento (E), fermento-substrato (ES) ir
fermento-produkto (EP) kompleksų. V. Henri įrodė, kad nepriklausomai nuo to, ar reakcijos metu su-
sidaro vienas ar abu tarpiniai kompleksai, reakcijos produktų susidarymo schema, suyrant ES komp-
leksui (3.1), ir schema, kai fermentas veikia kaip aktyvatorius (3.2), yra lygiavertės:

E+S ES E+P (3.1) (3.1)

ES

E+S E+P (3.2) (3.2)

Vėliau buvo nustatyta, kad (3.2) schema yra nereali, todėl šiuo metu ji nenagrinėjama. Savo dar-
buose V. Henri parodė, kad galima gauti tokias pačias greičio lygtis aprašant fermentines reakcijas,
vykstančias skirtingais mechanizmais (tai vadinama homeomorfizmu). Į tai atsižvelgiama vertinant
gautus kinetinius rezultatus.

3.1. Michaelio ir Menten darbai

A.J. Braunas ir V. Henri gavo iš esmės teisingus rezultatus, tačiau jų atlikti eksperimentai kelia
tam tikrų abejonių. C. O‘Sullivan ir V.W. Tompson gauti rezultatai buvo prieštaringi todėl, kad jie
fermentinių reakcijų metu neįvertindavo reakcijos terpės rūgštingumo pokyčių. Ankstyvieji tyrimai su
invertaze buvo vykdomi tokiomis sąlygomis, kuriose nevyksta gliukozės mutarotacija, nors tai turi įta-
kos galutiniams eksperimentų rezultatams.
1909 m. Sørensen pasiūlė vandenilio jonų koncentraciją išreikšti lokaritmine pH vienetų skale
[34]. 1913 m. Michaelis ir Menten atliko naujus eksperimentus su invertaze. Jie pirmą kartą panaudojo
acetato buferį, kuris, vykstant reakcijai, neleido kisti terpės rūgštingumui [35]. Eksperimento metu jau
buvo matuojamas pradinis fermentinės reakcijos greitis esant įvairioms substrato koncentracijoms.
Matuojant pradinius reakcijų greičius, susidarančių produktų įtakos nėra, todėl gaunamos paprastesnės
reakcijos greičio lygtys. Nors Michaelis ir Menten tiksliau kontroliavo vykstančios fermentinės reakci-
jos sąlygas, jų gauti rezultatai pakankamai gerai atitiko V. Henri gautus rezultatus. Gerbdami V. Henri
ir A.J. Brauno pasiekimus, Michaelis ir Menten pasiūlė vykstančios fermentinės reakcijos kelią:

66
 E+S ES E+P (3.1)

Jie padarė prielaidą, kad pirma grįžtamoji šios reakcijos stadija yra pakankamai greita, todėl ją ga-
lima aprašyti pusiausvyros konstanta Ks = [E][S]/[ES], čia [ES] – tarpinio fermento-substrato komp-
lekso koncentracija. [ES]=[E][S]/Ks. Tačiau reakcijos metu E ir S koncentracijas, nustatyti sudėtinga,
todėl, žinant pradines fermento [E] o ir substrato [S]o koncentracijas jas galima išsireikšti:
[E]o=[E]+[ES], o [S]o=[S]+[ES]. ES koncentracija negali būti didesnė už [E]o, ir kai [S]o koncentracija
žymiai didesnė už [E]o, tai ji yra žymiai didesnė ir už ES koncentraciją. Taigi, [S]  [S]o, tuomet
[ES] = ([E]o– [ES])[S]/Ks ir:

[E] o
[ES] 
( K s /[S])  1

Antroji reakcijos stadija ES k

2
  E  P yra paprasta pirmojo laipsnio reakcija, kurios greičio
konstanta yra k+2. Reakcijos greitis:

k 2 [E] o k [E] [S]

v  k 2 [ES]   2 o (3.3)
( K s /[S])  1 K s  [S]
Michaelio ir Menten pasiūlyta teorija ir (3.3) lygtis aprašo rezultatus, gaunamus matuojant inver-
tazinės reakcijos greitį. Michaelio ir Menten eksperimentai tapo standartu kitiems fermentinės kineti-
kos tyrėjams, todėl šie mokslininkai yra šiuolaikinės enzimologijos kūrėjai.
Maždaug tuo pačiu metu D.D. Van Slyke ir G.E. Cullen gavo panašius rezultatus su fermentu ure-
aze [36]. Jų pasiūlytame fermentinės reakcijos mechanizme pirmoji reakcijos stadija yra negrįžtama:
E  S k
1
ES k

2
E  P ir ES koncentracijos negalima išsireikšti remiantis pusiausvyros kons-
tanta. Šiuo atveju d[ES]/dt = k+1([E]o – [ES])[S] – k+2[ES]. D.D. Van Slyke ir G.E. Cullen pirmieji pa-
reiškė, kad fermentinės reakcijos metu tarpinio fermento-substrato komplekso koncentracija nekinta,
t. y. d[ES]/dt = 0 ir

k 1[E] o [S]
[ES]  .
k  2  k 1[S]

Tuomet

k 1k  2 [E] o [S] k  2 [E] o [S]

v  k  2 [ES]   . (3.4)
k  2  k 1[S] k  2 /k 1  [S]
(3.4) lygtis sutampa su (3.3) lygtimi, todėl eksperimentiškai neįmanoma jų atskirti.
Tuo metu kai buvo gauti pirmieji fermentinės katalizės tyrimų rezultatai, I. Langmuir tyrinėjo dujų
adsorbciją kietais paviršiais [37, 38]. Nors I. Langmuir darbai yra daugiau bendrojo pobūdžio, tačiau
dujų adsorbcijos mechanizmas yra labai panašus į Henri ir Michaelio-Menten pasiūlytus fermentinių
reakcijų mechanizmus. Langmuir nuomone, dujų adsorbcija kietais paviršiais vyksta panašiai kaip

67
substrato molekulių prisijungimas prie fermento. Jis manė, kad visas fermento molekulės paviršius yra
aktyvus.

3.2. Nuostoviosios būsenos principas

Michaelio ir Menten bei Van Slyke ir Cullen darbuose gautos fermentinių reakcijų greičio lygtys
yra tokios pačios. G.E. Briggs ir J.B. Haldane išanalizavo fermentinės reakcijos mechanizmą, kuriame
apjungė Michaelio ir Menten bei Van Slyke ir Cullen atvejus [39]. Briggs ir Haldane pasiūlyta reakci-
jos schema:

k+1 k+2
E+S ES E+P
k-1

Šiuo atveju:

d[ES]/dt=k+1([E]o–[ES])[S]–k-1[ES]–k+2[ES]. (3.5)
Nuostoviosios būsenos sąlygomis fermento-substrato komplekso koncentracija nekinta, t. y.
d[ES]/dt=0, tuomet k+1[E]o[S]=(k+1[S] + k-1 + k+2)[ES] ir:

k 1[E] o [S]
[ES]  . (3.6)
k 1[S]  k 1  k  2
Reakcijos greitis lygus:

k 1k  2 [E] o [S] k  2 [E] o [S]

v  k  2 [ES]   .
k 1[S]  k 1  k  2 (k 1  k  2 )/k 1  [S]

Šią lygtį galima perrašyti:

v = Vmax[S]/(KM + [S]) (3.7)

(3.7) lygtyje KM vadinama Michaelio konstanta, kuri lygi (k-1 + k+2)/k+1), o Vmax yra maksimalus
reakcijos greitis, kuris lygus k+2[E]o. (3.7) lygtis yra vadinama Michaelio-Menten lygtimi. Michaelio-
Menten lygtimi galima aprašyti daugumos fermentinių reakcijų mechanizmų, tačiau tuomet konstantų
KM ir Vmax matematinės išraiškos yra sudėtingesnės. Vmax nėra pagrindinė konstanta, nes jos skaitinė
vertė priklauso nuo fermento koncentracijos. Jeigu fermento koncentracija žinoma, tuomet k+2 greičio
konstanta yra lygi reakcijos katalizinei greičio konstantai (kkat). kkat=Vmax/[E]o.
Michaelio-Menten lygtis nusako pradinio fermentinės reakcijos greičio priklausomybę nuo substra-
to koncentracijos (31 pav.).

68
 Vmax

0,5Vmax

0 KM 2KM 3KM 4KM 5KM

[S]

31 pav. Fermentinių reakcijų, kurių greitį galima aprašyti Michaelio-Menten lygtimi, pradinio
greičio (v) priklausomybė nuo substrato koncentracijos [S]

Pradinio fermentinės reakcijos greičio priklausomybė nuo substrato koncentracijos aprašoma ly-
giašonės hiperbolės lygtimi. Lygiašonės hiperbolės asimptotės yra [S] = -KM ir v = Vmax. Kai fermenti-
nėje reakcijoje substrato koncentracija yra maža, tuomet pradinis reakcijos greitis yra tiesiog propor-
cingas substrato koncentracijai ir v  Vmax[S]/KM. Tokia fermentinė reakcija yra pirmojo laipsnio ir
Vmax/KM yra šios reakcijos greičio konstanta. Kai [S] = KM, tuomet v = 0,5 Vmax. Didinant substrato
koncentraciją, v skaitinė vertė artėja prie Vmax ir reakcija tampa nulinio laipsnio. Tuomet fermento mo-
lekulės yra įsotintos substratu. Iš tiesų v artėja prie Vmax labai lėtai ir netgi, kai [S] = 10KM, v = 0,9
Vmax. Dėl šios priežasties neįmanoma tiesiogiai rasti Vmax skaitinės vertės. Ją galima apskaičiuoti ma-
tuojant reakcijos greitį, esant mažoms substrato koncentracijoms.
Michaelio konstanta nėra lygi tikrajai fermento ir substrato sąveikos konstantai. KM = Ks tuomet,
kai greičio konstantos k+2 skaitinė vertė yra žymiai mažesnė už konstantos k-1 vertę. Kadangi konstanta
KM nėra tikroji fermento ir substrato sąveikos konstanta, tuomet kyla klausimas, kokia yra šios kons-
tantos enzimologinė vertė? Visų pirma, analizuojant sudėtingus fermentinių reakcijų mechanizmus,
stengiamasi įvairius kinetinius reiškinius išreikšti kuo paprastesniais dydžiais. Dažniausiai tiriami pag-
rindinių kinetinių parametrų (KM, Vmax ir Vmax/KM) pokyčiai keičiant eksperimento sąlygas. Michaelio
konstantos skaitinės vertės žinojimas suteikia galimybę teisingai suplanuoti fermento aktyvumo nusta-
tymo eksperimentą. Šiame eksperimente fermentinės reakcijos greitis turėtų priklausyti tik nuo fer-
mento koncentracijos, o nedideli substrato koncentracijos pokyčiai neturėtų turėti jam įtakos. Tokiu
atveju fermentinė reakcija turėtų vykti esant substrato pertekliui. Dažniausiai fermento aktyvumas nus-
tatomas esant substrato koncentracijai ~ 10KM.
Nuostoviosios būsenos principas pirmą kartą buvo paminėtas M. Bodenšteino darbuose. Šį prin-
cipą jis aptiko matuodamas fotocheminių reakcijų greičius [40]. Van Slyke ir Cullen bei Briggs ir Hal-
dane pirmieji šį principą be jokių įrodymų pritaikė fermentinėms reakcijoms. Susidarė nuomonė, kad
dauguma fermentinių reakcijų būtent vyksta nuostoviosios būsenos sąlygomis. Kadangi nuostoviosios
69
būsenos principu remiamasi išvedant daugumos fermentinių reakcijų greičio lygtis, todėl iškilo būtiny-
bė įrodyti šio principo egzistavimą enzimologijoje. 1955 m. K.J. Laidler išanalizavo atvejį, kai fermen-
tinės reakcijos metu d[ES]/dt ≠ 0. Šiuo atveju (3.5) lygtį reikia integruoti:
d [ES]
k 1 [ E ]o [S]  ( k 1 [S]  k 1  k  2 )[ ES]
  dt .

Gaunama:

ln [k 1[E] o [S] - (k 1[S]  k 1  k  2 )[ES]]

 t  .
- (k 1[S]  k 1  k  2 )

Reakcijos pradžioje dar nėra susidariusio tarpinio fermento-substrato komplekso, todėl kai t = 0,
ln [k 1[E] o [S]]
tai [ES] = 0. Iš čia   ir
- (k 1[S]  k 1  k  2 )

k 1[E] o [S] - (k 1[S]  k 1  k  2 )[ES]]

ln  -(k 1[S]  k 1  k  2 )t . (3.8)
k 1[E] o [S]
(k 1[S]  k 1  k  2 )[ES]]
(3.8) lygtį galima perrašyti: 1   exp [(k 1[S]  k 1  k  2 )t ] .
k 1[E] o [S]
Iš čia:

k 1[E] o [S]{1 - exp [-(k 1[S]  k 1  k  2 )t ]}

[ES]  ir
k 1[S]  k 1  k  2
Vmax [S]{1 - exp [-(k 1[S]  k 1  k  2 )t ]}
v . (3.9)
K M  [S]
(3.9) lygtyje Vmax = k+2 [E]o ir KM = (k–1 + k+2)/k+1. Kai reakcija vyksta pakankamai ilgai ir t vertės
yra didelės, tuomet (3.9) lygtyje eksponentinis narys tampa labai mažas ir (3.9) lygtis virsta paprastes-
ne (3.7) greičio lygtimi. t vertės, kurioms esant tai įvyksta, priklauso nuo (k+1[S] + k–1+ k+2) nario dy-
džio. Daugumos fermentinių reakcijų kinetikai aprašyti tinka (3.7) lygtis (išskyrus pradinę fermentinės
reakcijos stadiją iš karto po reaguojančių medžiagų sumaišymo), todėl dažniausiai (k+1[S] + k–1 + k+2)
nario skaitinė vertė yra žymiai didesnė už 1 s–1. (3.9) lygtį išvedė K.J. Laidler [41]. Laidler tyrė fer-
mentinių reakcijų kinetiką, kai reakcijos vyksta pakankamai ilgai ir substrato koncentracija sumažėja
tiek, kad [S]  [S]o. Tuo atveju fermentinė reakcija pereina į nuostoviąją būseną ir:

k 1[E] o ([S]o  [P])

[ES]  ,o (3.10)
k 1  k 2  k 1 ([S]o  [P])
k 1k 2 [E] o ([S]o  [P]) V ([S]o  [P])
v  max . (3.11)
k 1  k 2  k 1 ([S]o  [P]) K M  [S]o  [P]
(3.10) ir (3.11) lygtys yra identiškos (3.6) ir (3.7) lygtims, tik jose S koncentracija pakeista į ([S]o
– [P]).

70
 Taigi, fermentinės reakcijos kinetinė kreivė yra sudaryta iš trijų dalių (32 pav.).

1,0

Nuostoviosios būsenos dalis

0,8
Pradinė reakcijos stadija Pradinio greičio dalis Pagrindinė reakcijos stadija
(3.9) lygtis (3.7) lygtis (3.11) lygtis

0,6
ν, μM · s-1

0,4

0,2

0
10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 1 10 102 103 104
t, s

32 pav. Fermentinės reakcijos kinetinė kreivė. Šiuo atveju: k+1 = 107 M-1s-1, k-1 = 1000 s-1, k+2 =
100 s-1, k-2 = 0, [S]o = 2·10-4 M ir [E]o = 10-8 M
Pirmoji fermentinės reakcijos dalis – pradinė reakcijos stadija – yra aprašoma (3.9) lygtimi, antro-
ji dalis – pradinio reakcijos greičio – yra vienintelė, kurioje reakcijos greitis yra pastovus. Dauguma
paskelbtų fermentinės kinetikos darbų skirti šios dalies analizei. Trečioji fermentinės reakcijos dalis –
pagrindinė reakcijos stadija, kurioje labai pakinta substrato ir produkto koncentracijos. Ši reakcijos
dalis aprašoma (3.11) lygtimi, kuri paprastai taikoma integruotoje formoje.

3.3. Michaelio–Menten lygtis grįžtamajai fermentinei reakcijai

Dauguma cheminių reakcijų yra grįžtamosios, t. y. pasiekiama pusiausvyros būsena, kurioje subst-
ratų ir produktų koncentracijos nemažos. Tuomet Michaelio ir Menten pasiūlytas mechanizmas yra
nepilnas. Šiame mechanizme įvedama papildoma grįžtamosios reakcijos stadija:

k+1 k+2
E+A EA E+P
k-1 k-2

Nuostoviosios būsenos sąlygomis:

d[EA] / dt  k1 ([E]o  [EA])[A ]  k2 ([E]o  [EA])[P ]  (k1  k2 )[EA]  0 .

Pertvarkius gaunama:

k 1[E] o [A]  k 2 [E] o [P]

[EA ]  .
k 1  k 2  k 1[A]  k -2 [P]

Produkto P susidarymo greitis yra lygus tiesioginės ir grįžtamosios reakcijų greičių skirtumui:

71
 v  k2 [EA]  k2 ([E] o  [EA])[P] .

Į šią lygtį įrašius [EA] išraišką, gaunama:

k 1k  2 [E] o [A]  k 1k 2 [E] o [P]

v . (3.12)
k 1  k  2  k 1[A]  k 2 [P]
Kai (3.12) lygtyje [P] = 0, gaunama įprasta Michaelio-Menten lygtis, o kai [A] = 0, gaunama pra-
 k 1 k  2 [E] o [P]
dinio greičio lygtis grįžtamajai reakcijai: v  . Tiek tiesioginės, tiek grįžtamosios
k 1  k  2  k  2 [P]

reakcijų pradinių greičių lygtys sutampa su įprasta Michaelio-Menten lygtimi (3.7), todėl galima įrašy-

ti Vmax ir KM konstantas: f
Vmax  k 2 [E] o , o A
KM  (k 1  k 2 ) / k 1 ir r
Vmax  k 1[E] o , o
P
KM  (k 1  k 2 ) / k 2 . Vmax
f r
– tiesioginės fermentinės reakcijos maksimalus greitis, Vmax – grįžtamo-

sios fermentinės reakcijos maksimalus greitis. K M

A
– Michaelio konstanta substratui A, o K M
P
–
Michaelio konstanta produktui P. Įrašius šiuos žymėjimus, (3.12) lygtį galima perrašyti:
f r
Vmax [ A ] Vmax [P]
A
 P
KM KM
v . (3.13)
[A ] [P]
1 A  P
KM KM
(3.13) yra empirinė Michaelio-Menten greičio lygtis fermentinei reakcijai, turinčiai grįžtamąją
stadiją. (3.13) lygtimi galima aprašyti ir labai sudėtingus mechanizmus.
Realesnis fermentinės reakcijos kinetinis mechanizmas yra toks, kai reakcijos metu susidaro tarpi-
nis fermento-produkto junginys. Jis suyra susidarant reakcijos produktui ir nepakitusiam katalizatoriui:

k+1 k+2 k+3

E+A EA EP E+P
k-1 k-2 k-3

Nuostoviosios būsenos sąlygomis:

d[EA] / dt  k 1[A]([E] o  [EA]  [EP])  k 2 [EP]  (k 1  k 2 )[EA]  0

ir

d[EP] / dt  k 3 [P]([E] o  [EA]  [EP])  k 2 [EA]  (k 2  k 3 )[EP]  0 .

Išsprendus šią lygčių sistemą, gaunama:

k 1 (k 2  k 3 )[E] o [A]  k 2 k 3 [E] o [P]

[EA ]  ;
k 1k 2  k 1k 3  k  2 k 3  k 1 (k 2  k  2  k 3 )[A]  (k 1  k 2  k  2 )k 3 [P]

k 1k 2 [E] o [A]  (k 1  k 2 )k 3 [E] o [P]

[EP ]  .
k 1k 2  k 1k 3  k 2 k 3  k 1 (k 2  k 2  k 3 )[A]  (k 1  k 2  k 2 )k 3 [P]

72
 Fermentinės reakcijos greitis yra lygus tiesioginių ir grįžtamųjų reakcijų greičių skirtumui:

k 1k  2 k 3 [E] o [A]  k 1k 2 k 3 [E] o [P]

v  k  2 [EA ]  k 2 [EP ]  .
k 1k 2  k 1k 3  k  2 k 3  k 1 (k 2  k  2  k 3 )[A]  (k 1  k 2  k  2 )k 3 [P]

Ši greičio lygtis sutampa su (3.13) lygtimi, tačiau šioje greičio lygtyje skiriasi Vmax ir KM konstan-
tų išraiškos.
Šiuo atveju:

k 2 k 3 [E] o k 1k 2 [E] o

f
Vmax  r
, o Vmax 
k  2  k  2  k 3 k 1  k 2  k 2
ir

k 1k 2  k 1k 3  k 2 k 3
A
KM  ,o (3.14)
k 1 (k 2  k 2  k 3 )
k 1k 2  k 1k 3  k 2 k 3
P
KM  . (3.15)
(k 1  k 2  k 2 )k 3
A
Jeigu greičio konstantos k+2 skaitinė vertė yra maža, palyginti su (k–2 + k+3) verte, tuomet K M = k–

1/k+1 = K sA , čia K sA – tikroji komplekso EA disociacijos konstanta. Analogiškai, kai greičio konstan-
P
tos k–2 skaitinė vertė yra maža, palyginti su (k–1 + k+2) verte, tai K M  K sP . Jeigu galioja nelygybės k+2
A
<< k+3 ir k–2 << k–1, tuomet vienu metu konstanta K M gali būti lygi konstantai K sA ir K M
P
lygi K sP .
Šiuo atveju tiesioginės ir grįžtamosios reakcijų greičius lemia EA  EP stadijų greičiai.
Pusiausvyros sąlygomis reakcijos greitis yra lygus 0, todėl iš (3.13) lygties galima gauti:
f r
Vmax [A]eq Vmax [P]eq
A
 P
 0 , čia: [A]eq ir [P]eq yra substrato A ir produkto P pusiausvyrinės koncentraci-
KM KM
jos. Iš čia:
f
Vmax K MP [P]eq
r
  K eq ; (3.16)
Vmax K MA [A] eq
čia: Keq – fermentinės reakcijos pusiausvyros konstanta. (3.16) lygtis yra vadinama Haldane
lygtimi [42]. Haldane lygtis tinka ne tik paprastam Michaelio-Menten mechanizmui, bet ir sudėtin-
gesniems fermentinių reakcijų mechanizmams. Jeigu fermentinės reakcijos greitį galima aprašyti
(3.13) lygtimi, tuomet santykis tarp kinetinių parametrų ir pusiausvyros konstantos turi būti aprašomas
Haldane lygtimi. Kinetinių parametrų palyginimas su reakcijos pusiausvyros konstanta leidžia išvengti
klaidingų rezultatų interpretuojant vieną ar kitą reakcijos kinetinį mechanizmą.

73
 3.4. Michaelio-Menten lygties transformacijos ir grafinis atvaizdavimas

Gautus fermentinių reakcijų pradinių greičių rezultatus, esant skirtingoms substrato koncentraci-
joms, patogiausia pavaizduoti grafiškai. Taip galima nustatyti reakcijos kinetinius parametrus bei įver-
tinti atlikto eksperimento tikslumą. Pats paprasčiausias grafinis duomenų atvaizdavimas – pradinio
fermentinės reakcijos greičio (v) priklausomybės nuo substrato koncentracijos [S] grafikas. Tokia prik-
lausomybė aprašoma lygiašonės hiperbolės lygtimi (31 pav.). Šis grafikas retai naudojamas, nes: 1)
pakankamai sunku teisingai nubraižyti lygiašones hiperboles; 2) sunku tiksliai rasti lygiašonės hiper-
bolės asimptočių vertes; 3) nelengva palyginti kelias hiperboles tarpusavyje; 4) labai sunku nustatyti
eksperimentinių taškų nukrypimą nuo teorinės kreivės. Žinodami šiuos sunkumus, Michaelis ir Menten
naudojosi pradinio reakcijos greičio (v) priklausomybės nuo lg[S] grafiku (33 pav.).

Vmax

Didžiausias pasvirimas = 0,575 Vmax

0,5Vmax

0
-1 0 1
lg([S]/KM)

33 pav. Vmax ir KM konstantų vertės Michaelio-Menten grafike

v = f (lg[S]) grafikas yra S tipo kreivė. Diferencijuojant Michaelio-Menten lygtį (3.7), gaunama
dv K V [S] dv 2,303K MVmax [S]
 M max 2 arba  . Šios kreivės didžiausias pasvirimo kampas yra
d ln [S] ( K M  [ S ]) d lg [S] ( K M  [ S ]) 2
tuomet, kai [S] = KM. Šio pasvirimo kampo tangentas lygus 2,303Vmax/4, t.y. 0,576Vmax. Taigi Vmax ga-
lima sužinoti padalijus didžiausio kreivės pasvirimo kampo tangentą iš 0,576. Taip sužinoję Vmax,
Michaelis ir Menten rasdavo konstantos KM vertę.
1934 m. H. Lineweaver ir D. Burk paskelbė darbą, kuriame Michaelio-Menten lygiašonės hiper-
bolės lygtį transformavo į tiesės lygtį [43]. Michaelio-Menten lygtį galima transformuoti trimis būdais:

[S] K M [S]
  . (3.17)
v Vmax Vmax
KMv
v  Vmax  . (3.18)
[S ]
1 1 KM
  . (3.19)
v Vmax Vmax [ S ]
74
 (3.17) yra vadinama Hanes lygtimi. [S]/v = f ([S]) grafikas yra tiesė, kurios pasvirimo kampo tan-
gentas lygus 1/Vmax. [S]/v ašyje ši tiesė atkerta atkarpą KM/Vmax, o [S] ašyje – -KM (34 pav.).

[S]/

tg  1/Vmax

K M / Vmax


0
KM [S]

34 pav. Michaelio-Menten lygties Hanes tiesinės transformacijos grafikas

(3.18) yra vadinama Eadye-Hofstee lygtimi. v = f (v/[S]) grafikas yra tiesė, kurios pasvirimo kam-
po tangentas lygus -KM. v ašyje ši tiesė atkerta atkarpą lygią Vmax, o v/[S] ašyje – Vmax/KM (35 pav.).

Vmax

Pasivirimas =  K M

Vmax / K M

 /[S]
35 pav. Michaelio-Menten lygties Eadye-Hofstee tiesinės transformacijos grafikas
(3.19) yra vadinama Lineweaver-Burk lygtimi. 1/v = f (1/[S]) grafikas yra tiesė, kurios pasvirimo
kampo tangentas lygus KM/Vmax. 1/v ašyje tiesė atkerta atkarpą lygią 1/Vmax, o 1/[S] ašyje – -1/KM (36
pav.).

75
 1/

Pasivirimas = K M / Vmax

1/Vmax

0 1/[S]
1/ K M

36 pav. Michaelio-Menten lygties Lineweaver-Burk tiesinės transformacijos grafikas

Šios trys Michaelio-Menten lygties transformacijos turi savų privalumų ir trūkumų. Braižant dvi-
gubų atvirkštinių dydžių grafiką (Lineweaver-Burk grafikas), kai yra mažos substrato koncentracijos,
gaunamas labai didelis eksperimentinių taškų išsibarstymas (36 pav.), todėl sudėtinga teisingai nubrai-
žyti grafiką. Eadye-Hofstee grafiko netikslumas yra tai, kad priklausomas kintamasis dydis v yra ati-
dedamas abiejose koordinačių sistemos ašyse. Palyginus šiuos tris grafikus, tiksliausias yra Hanes gra-
fikas.
1974 m. R. Eisenthal ir A. Cornish-Bowden pasiūlė naują fermentinių reakcijų kinetinių rezultatų
grafinį atvaizdavimo būdą. Tai vadinamasis tiesioginis linijinis grafikas [44]. Eisenthal ir Cornish-
v
Bowden transformavo v = f ([S]) priklausomybės grafiką į Vmax = f (KM) grafiką: Vmax  v  KM .
[S]
Taigi, bet kuriai [S] ir v verčių porai galima nubraižyti Vmax priklausomybės nuo KM grafiką. Gaunama
tiesė, kurios pasvirimo kampo tangentas lygus v/[S]. Vmax ašyje ši tiesė atkerta atkarpą lygią v, o KM
ašyje – -[S] (37 pav.).

*
Vmax

Vmax

1

[S]1 0 KM K M*

37 pav. Tiesioginis linijinis Eisenthal ir Cornish-Bowden grafikas

76
 Nubrėžus keletą tokių tiesių, esant įvairioms [S] ir v vertėms, šios tiesės susikerta viename taške,
kurio koordinatės yra ( Vmax
*
; K M* ). Šios Vmax
*
ir K M* vertės atitinka visas pasirinktas [S] ir v verčių poras
(37 pav.). Dėl galimų paklaidų šios tiesės nesusikerta idealiai viename taške, todėl kartais sudėtinga
rasti optimalias šių tiesių susikirtimo koordinates. Fermentinių reakcijų kinetikoje Eisenthal ir Cornish-
Bowden metodu labai lengva aptikti klaidingus rezultatus, nes tokios tiesės iškrenta iš bendrosios tie-
sių šeimos. Tiesioginį linijinį grafiką galima nubrėžti neatliekant jokių papildomų skaičiavimų.

3.5. Fermentinių reakcijų nuostoviosios būsenos greičio lygtys

Sudėtingų fermentinių reakcijų, vykstančių nuostoviosios būsenos sąlygomis, greičio lygtis galima
išvesti tokiu pat būdu kaip ir paprastam Michaelio-Menten mechanizmui. Tam reikia užrašyti įvairių
tarpinių fermento formų koncentracijų pokyčių išraiškas laiko atžvilgiu ir jas prilyginti 0. Išsprendus
lygčių sistemą, gaunama fermentinės reakcijos nuostoviosios būsenos greičio lygtis, tačiau tai yra pa-
kankamai sunku atlikti.
1956 m. E.L. King ir C. Altman pasiūlė naują metodą sudėtingų fermentinių reakcijų nuostovio-
sios būsenos greičio lygtims išvesti [45]. Jų pasiūlytas metodas remiasi grafų teorija ir tinka bet kuriam
mechanizmui, kuriuose vyksta reakcijos tarp įvairių to paties fermento formų. King–Altman metodas
netaikomas nefermentinėms reakcijoms, taip pat reakcijoms, kurias katalizuoja fermentų mišiniai, bei
fermentinėms reakcijoms, kurių viena ar kelios stadijos yra nefermentinės. Nepaisant to, King–Altman
metodas yra labai praktiškas ir dažnai naudojamas.

3.5.1. King–Altman metodas

Bet kuriam fermentinės reakcijos mechanizmui King–Altman metodu yra lengva gauti nuostovio-
sios būsenos greičio lygtis. Šio metodo esmę galima išsiaiškinti remiantis tvarkingos dvisubstratinės-
dviproduktinės fermentinės reakcijos mechanizmu:

k+1 k+3
E+A EA EPQ EQ + P
k-1 k-3
EAB EPQ
k+2 k+4
EA + B EAB EQ E+Q
k-2 k-4

Šioje schemoje A ir B yra reakcijos substratai, P ir Q – produktai. EAB  EPQ stadijai nenuro-
dytos greičių konstantos, nes, matuojant fermentinės reakcijos greitį nuostoviojoje būsenoje, negalima
aptikti izomerizacijos stadijų, todėl, analizuojant tokią schemą ir išvedant reakcijos greičio lygtį, EAB
ir EPQ fermento formos yra sujungiamos į vieną.
Išvedant nuostoviosios būsenos fermentinės reakcijos greičio lygtį King-Altman metodu, fermen-
tinės reakcijos mechanizmas pateikiamas pagrindinio grafo formos, kurioje yra visos tarpinės fermento
formos:
77
 k+1[A]
E EA
k-1

k+4 k-4[Q] k-2 k+2[B]

k-3[P]
EQ EAB
k+3 EPQ

Visos reakcijos tokioje schemoje aprašomos kaip pirmojo laipsnio reakcijos. Todėl, tarkime, grei-
čio konstanta k+1 yra pakeičiama pseudopirmo laipsnio greičio konstanta k+1[A]. Nubraižomas pagrin-
dinis grafas, kuris yra visos reakcijų schemos pagrindas. Šiuo atveju tai kvadratas:

Nubraižomi visi galimi pografai, kurie turi atitikti šiuos reikalavimus:

1) pografai turi būti sudaryti iš linijų, esančių pagrindiniame grafe;
2) pografuose linijos sujungia visas fermento formas;
3) pografuose negali būti uždarų ciklų. Kiekviename pografe šoninių linijų skaičius yra vienetu
mažesnis nei fermento formų skaičius.
Šiuo atveju yra galimi keturi pografai:

Kiekvienai fermento formai ir kiekvienam pografui yra užrašoma sandauga greičio konstantų, ati-
tinkančių pografo šoninėms linijoms, kurios veda į pasirinktą fermento formą, pvz., formai EQ antras
pografas iš kairės – sandauga k-1k+3k-4[Q].

k -1

k -4 [Q]

EQ
k +3
Kadangi yra keturi pografai, tai kiekvienai fermento formai galima užrašyti po keturias tokias san-
daugas. Tuo tarpu kiekvienos fermento formos dalis reakcijos mišinyje yra lygi sumai šių keturių san-
daugų, padalytai iš visų šešiolikos sandaugų sumos ():

[E]/[E] o  (k1k 2 k 4  k1k 3k 4  k 2 k 3k 4 [B]  k1k 2 k 3[P]) / ,

[EA]/[E] o  (k1k 2 k 4 [A]  k1k 3k 4 [A]  k 2 k 3k 4 [P][Q]  k1k 2 k 3[A][ P]) / ,
[EAB]/[E] o  (k1k 2 k 4 [A][ B]  k1k 3k 4 [P][Q]  k 2 k 3k 4 [B][P][Q]  k1k 2 k 3[A][ B][ P]) / ,
[EQ]/[E] o  (k1k 2 k 4 [Q]  k1k 3k 4 [Q]  k 2 k 3k 4 [B][Q ]  k1k 2 k 3[A][ B]) /  .

78
 Reakcijos greitis yra lygus sumai greičių tų stadijų, kuriose susidaro produktai, atėmus sumą grei-
čių tų stadijų, kuriose šie produktai sunaudojami. Tiriamuoju atveju yra tik viena P susidarymo stadi-
k3 k 3 [P]
ja – (EAB–EPQ)  EQ + P ir viena stadija, kur P sunaudojamas – EQ    (EPQ–EAB).
Tuomet fermentinės reakcijos greitis:

d [P]
v  k 3 [EAB]  k 3 [EQ][P ]  [E] o (k 1 k  2 k 3 k  4 [A][B]  k 1 k 3 k 3 k  4 [P][Q] 
dt
 k  2 k 3 k 3 k  4 [B][P][Q ]  k 1 k  2 k 3 k 3 [A][B][P ]  k 1 k  2 k 3 k  4 [P][Q]  k 1 k 3 k 3 k  4 [P][Q] 
 k  2 k 3 k 3 k  4 [B][P][Q ]  k 1 k  2 k 3 k 3 [A][B][P ]) /   [E] o (k 1 k  2 k 3 k  4 [A][B] 
 k 1 k  2 k 3 k  4 [P][Q]) /  .
Nuostoviosios būsenos sąlygomis visų fermento formų koncentracijos nekinta, todėl produktas Q
susidaro tokiu pačiu greičiu kaip ir produktas P ir substratai A ir B sunaudojami vienodu greičiu.
Tuomet:

d [Q] d [ P ] d [A] d [ B]
   .
dt dt dt dt

3.5.2. King-Altman metodo variantai

1. Jeigu tai pačiai porai fermento formų yra dvi arba daugiau tarpusavio virsmų stadijų, tai, sudė-
jus paralelinių reakcijų greičių konstantas, tas stadijas galima sujungti į vieną stadiją, pvz., Michaelio-
Menten mechanizmas gali būti pavaizduotas:

k+1[S]

k-1
E ES
k-2[P]

k+2

E ES

E ES
Šiam pagrindiniam grafui galimi du pografai: ir
Remiantis 1 taisykle, šiuos abu pografus galima sujungti į vieną:

k +1[S] + k -2[P]
E ES
k -1 + k +2

Tuomet

[E]/[E] o  (k 1  k  2 ) /( k 1  k  2  k 1 [S]  k 2 [P]),

[ES]/[E] o  (k 1[S]  k 2 [P]) /( k 1  k  2  k 1 [S]  k 2 [P])

79
 2. Tuo atveju, kai fermentinėje reakcijoje susidaro įvairios fermento formos, turinčios vienodas
savybes, tai King-Altman metodas tampa paprastesnis, jeigu šios formos yra sujungiamos į vieną, pvz.,
kai fermento molekulė turi du vienodus aktyviuosius centrus.

k +1 k +2
E+S ES E+P k +2
+ k -1 +
S S k +1 [S]
E ES
k -1 k +1 k -3 k +3 k -1

k +3 k +4
SE + S SES SE + P k +2 k -1 k +1 [S] k -3 k +3 [S] k +4
k -3
k +2 k +4 k +3 [S]
SE SES
k -3
E ES
+ +
P P k +4

Kadangi ES ir SE yra vienodi, tai pagrindinis grafas tampa simetriškas ir jį galima supaprastinti:

k+2 2k+4

E ES ES2
2k+1[S] k+3[S]

k-1 2k-3
Be to, pritaikius pirmąją taisyklę, sudaromas vienas grafas, iš kurio nesunkiai galima gauti atitinkamas
išraiškas visoms trims fermento formoms:

2k+1[S] k+3[S]
E ES ES2
k-1 + k+2 2(k-3 + k+4)

Tais atvejais, kai pagrindinio grafo simetrija panaudojama jo supaprastinimui, taikomi statistiniai
daugikliai. Šiame pavyzdyje reakcija E + S → ES vyksta dviem keliais, todėl bendras šios reakcijos
greitis yra lygus abiejų kelių greičių sumai, o greičio konstanta dauginama iš dviejų. Priešinga reakcija
vyksta vienu keliu, todėl statistinis daugiklis yra 1. Schema

k-1 k+1[S]
SE E ES
k+1[S] k-1

virsta

80
 2k+1[S]
E ES
k-1

3. Jeigu pagrindinis grafas susideda iš dviejų arba daugiau dalių ir turi bendrą tašką, atitinkantį
fermento formą, bendrą toms dalims, tai tuomet patogu analizuoti tas dalis atskirai, pvz., konkurenci-
nių substratų atvejis, kai fermentas tuo pačiu metu katalizuoja dvi reakcijas su skirtingais substratais:

A P B Q

k1 k-1 k2 k-2 k3 k-3 k4 k-4

EA FP F FB EQ

E E

EI F'P F' F'B ES

k5 k-5 k6 k-6 k7 k-7 k8 k-8

I P B S

A - CH3COOCH3; I – CH3CH2COOCH3; B – H2O; P – CH3OH; Q – CH3COOH; S – CH3CH2COOH.

Nubraižomas pagrindinis grafas:

F
k-3 k-2[P]

k3[B] k+2
FB EA
+ +
EQ FP
k4 k1[A]
k-4[Q] k-1
E
k8 k5[I]
k-8[S] k-5
F'B EI
+ +
ES F'P
k-7 k-6[P]

k7[B] k6
F'

Iš šio pagrindinio grafo galima sudaryti 16 pografų, tačiau šiuo atveju galima supaprastinti, nes atitin-
kama vienos ar kitos fermento formos koncentracijos išraiška bus lygi sandaugai atitinkamų sumų vie-
noje ir kitoje pagrindinio grafo pusėse:

81
 E E E E

Pvz., fermento formos E koncentraciją reakcijos mišinyje galima rasti:

[E] (k3k2 [P]k1  k3[B]k4 k1  k4 k2 [P]k1  k2 k3 [B]k4 )  (k6 k7 [B]k8  k 7 k 6 [P]k 5  k 5k7 [B]k8  k8k 6 [P]k 5 )
 .
[E]o 

3. Sudėtingus pografus galima kompaktizuoti ieškant ir panaudojant pagrindinio grafo pasikar-

tojimus. Tuomet galima gauti atitinkamus narius keletui pografų iš karto (Volkenšteino ir
Goldšteino variantas). Pavyzdžiui, dvisubstratinė reakcija, susidarant dviem produktams, kai
substratų prisijungimas ir produktų išsiskyrimas vyksta bet kokia tvarka:
P
k+1 k+3 k+5 + k+7
E+ A EA + B EAB EQ E+ Q
k-1 k-3 k-5 k-7
+
B k-6 k+6

k+4 k+8
k-2 k+2 EP E+ P
+ k-8
k-4
EB Q
+
A

Nubraižomas pagrindinis grafas:

EA

k+1[A] k+3[B]

k-1 k-3

k+2[B] EB k+4[A]

k-4
k-2
E EAB
k-8[P] k-6[Q]

k+8 k+6
EP

k-7[Q] k-5[P]
k+7 k+5

EQ

82
 Iš šio pagrindinio grafo galima sudaryti 32 pografus, tačiau visus juos analizuoti yra pakankamai
sudėtinga ir galima greitai suklysti.
Panagrinėkime kelius, besibaigiančius EAB fermento forma. Teisingai sudarytame pografe turi
būti penkios linijos ir vienas iš kelių: EEAEAB; EEBEAB; EEPEAB ir EEQEAB.
Bet kuriame pografe, turinčiame kelią EEAEAB, turi būti šaka EBE arba EBEAB, tačiau ne-
gali būti abiejų šakų kartu, nes tai prieštarauja pografų sudarymo taisyklėms. Yra 8 pografai, turintys
kelią EEAEAB:

EA EA EA EA

EB EB EB EB
E EAB E EAB E EAB E EAB
EP EP EP
EP
EQ EQ EQ EQ

EA EA EA EA

EB EB EB EB
E EAB E EAB E EAB E EAB
EP EP EP
EP

EQ EQ EQ EQ

Pvz., [EAB]/[E]o išraiška:

[EAB] k  2 k 8 k  7 k 1 [A]k 3 [B]  k  2 k  7 k 6 [Q]k 1 [A]k 3 [B]  k  2 k 8 k 5 [P]k 1 [A]k 3 [B] 


[E] o 
k  2 k 6 [Q]k 5 [P]k 1 [A]k 3 [B]  k  4 [A]k  7 k 6 [Q]k 1 [A]]k 3 [B]  k  4 [A]k 8 k  7 k 1 [A]]k 3 [B] 

k  4 [A]k 6 [Q]k 5 [P]k 1 [A]]k 3 [B]  k  4 [A]k 8 k 5 [P]k 1 [A]]k 3 [B]
.


Skaitiklyje esančios sumos, atitinkančios visus pografus, turinčius kelią EEAEAB, bendrasis
dauginamasis yra (k–2 + k+4[A]). Kadangi kiekviename pografe yra keliai, vedantys į EP ir EQ formas,
tai analogiškai gaunama, kad nurodyta suma taip pat turi bendruosius daugiklius – (k-6[Q] + k+8) ir (k-
5[P] + k+7). Tuomet iš aštuonių pografų, turinčių kelią EEAEAB, galima gauti bendrąjį narį –
k+1k+3[A][B](k–2 + k+4[A])(k-6[Q] + k+8)(k-5[P] + k+7), ir tai atitinka [EAB]/[E]o skaitiklį. Analogiškai
analizuojami ir likusieji trys keliai. Gaunama, kad fermento formai EAB 32 nariai gali būti užrašyti
kaip keturių narių suma, turinčių atitinkamus daugiklius. E formos koncentraciją išreiškiantys nariai
gaunami labai paprastai, pakeitus atitinkamas konstantas, gautas formai EAB, į priešingos krypties re-
akcijų greičio konstantas. Tuo atveju kelias EEAEAB virsta keliu EEAEAB. Gauti išraišką
formai EA yra sunkiau, nes ši fermento forma pagrindiniame grafe yra tokioje padėtyje, kuri topolo-
giškai skiriasi nuo E ir EAB formų užimamų padėčių. Panašiai yra ir su formomis EB, EP ir EQ.

83
 3.5.3. Reakcijos, turinčios pusiausvyros stadijas

Kartais, išvedant reakcijos greičio lygtį, yra galimi tam tikri supaprastinimai, tačiau tai ne visada
teisinga, pvz., kai kuriose fermentinės reakcijos stadijose yra pusiausvyra. Remiantis šia prielaida, ana-
lizuoti yra žymiai paprasčiau nei atlikti visą analizę King-Altman metodu, nes kiekviena grupė fermen-
to formų, esančių pusiausvyroje, gali būti apibrėžta kaip vieninga forma. Pavyzdžiui, dvi fermento
formos – X ir Y – yra pusiausvyroje – [Y]/[X]=K ir X forma siejasi su trečia fermento forma Z santy-
kinai lėta reakcija:

k+1
X Z
k-1
K

Y
Tiesioginės lėtosios reakcijos greitis yra lygus k+1[X], tačiau jį galima užrašyti
k 1[X]([ X]  [Y]) k 1 ([ X]  [Y])
 , čia X ir Y yra vieninga forma, kurios koncentracija lygi
([ X]  [Y]) `(1  K )
k 1
([X]+[Y]). Tuomet X formos suirimo greičio konstanta k+1 sumažėja iki dydžio . Bendruoju
(1  K )
atveju, esant bet kuriam skaičiui fermento formų pusiausvyroje, jas galima sujungti į vieningą formą.
Tuomet, kiekviena greičio konstanta ki sumažėja iki fiki, čia fi – reaguojančių molekulių dalis pusiaus-
vyros mišinyje. Jeigu fermentinėje reakcijoje X, Y, Q ir E fermento formos yra pusiausvyroje, o X
forma virsta Z santykinai lėta reakcija, kurios greičio konstanta k+1, tuomet analizuojant šios formos
sujungiamos į vieną:

K
X Y Q E

k-1 k+1

[Y]  [Q]  [E]

K –pusiausvyros konstanta, kuri lygi K  . Reaguojančių molekulių X dalis miši-
[X]
nyje yra lygi:

[X]
[X]  [Y]  [Q]  [E]

ir:

[X] k 1
k 1   .
[X]  [Y]  [Q]  [E] 1  K
84
 k 1 [X]  [Y]  [Q]  E]
Tuomet reakcijos greitis v  .
(1  K )

3.5.4. Fermentinių reakcijų mechanizmų analizė pagal pagrindinio grafo išvaizdą

1. Išvedant fermentinių reakcijų greičio lygtis King–Altman metodu, iš kiekvieno pografo gauna-
mi teigiami nariai, kurie yra reakcijos greičio lygties vardiklyje. Kadangi vardiklyje nėra neigiamų na-
rių, o tai reiškia, kad vardiklyje yra visi nariai, kuriems yra sudarytas pografas. Vienintelė išimtis yra
tuomet, kai skaitiklis ir vardiklis turi bendrą daugiklį, o tai būna tuomet, kai greičio konstantos tarp
savęs yra susietos, pvz., kai fermento molekulė turi du nepriklausomus vienodus aktyviuosius centrus:

P P
k+2 2k+2

E ES ES2
2k+1[S] k+1[S]

k-1 2k-1
Šiuo atveju reakcijų, vykstančių pirmajame ir antrajame aktyviuosiuose centruose, greičio kons-
tantų vertės sutampa (be statistinių daugiklių), o greičio lygties išraiška yra:

4k 1 k  2 [E]o [S](k 1  k  2 )  4k 21 k  2 [E]o [S]2

v .
2(k 1  k  2 ) 2  4k 1 [S](k 1  k  2 )  2k 21 [S]2

Šios greičio lygties skaitiklis ir vardiklis turi bendrąjį daugiklį – 2(k–1 + k+2 + k+1[S]) ir tuomet
greičio lygtį galima perrašyti Michaelio-Menten lygties forma:

2k  2 [E]o [S]
v .
 k 1  k  2 
   [S]
 k 1 

2. Analizuojant pagrindinio grafo atskiras dalis, galima suprasti bendrąjį fermentinės reakcijos
mechanizmą, pvz., fermentinė reakcija, turinti tokią stadiją:

kxy kyz
X Y Z
kyx kzy

X, Y ir Z – trys fermento formos. Šiuo atveju reakcijos greičio lygtyje bus nariai, turintys konstan-
tas kyx, kyz, ir nariai, kuriuose nebus šių greičio konstantų. Lygtyje nebus ir tų narių, kurie turėtų kyxkyz
sandaugą. Kaip pasikeistų greičio lygtis, jeigu fermento formą Y sudarytų dvi viena į kitą virstančios
formos Y1 ir Y2?

85
 kxy k12 kyz
X Y1 Y2 Z
kyx k21 kzy

Pirmiausia visi ankstesni daugikliai bus naujoje lygtyje, tačiau papildomai prisidės bendrieji dau-
gikliai k12 arba k21, todėl neišnyks nė vienas narys su koncentracijomis. Be to, atsiras sandaugos, kurio-
se nebus k12 nei k21, tačiau bus kyx ir kyz. Kai kyx ir kyz yra paprastos pirmojo laipsnio greičio konstan-
tos, tai lygties išvaizda nepakinta, tačiau, kai abi tos konstantos yra susietos su reagentų koncentraci-
jomis (pvz., kyx[A] arba kyz[B]), tai, taip pasikeitus reakcijos mechanizmui, greičio lygtyje atsiras anks-
čiau nebuvusių narių, turinčių [A] ir [B]. Galima daryti svarbią išvadą, kad izomerizacijos stadijos
neturi įtakos reakcijos greičio lygties formai, jeigu nė vienas iš izomerų neprisijungia reagentų. Tai
reiškia, kad, vykstant fermentinei reakcijai nuostoviosios būsenos sąlygomis, negalima aptikti izomeri-
zacijos stadijų.
3. Dvi tarpusavyje susietos fermento formos, tarp kurių vyksta virsmai, dažniausiai nėra pusiaus-
vyroje, tačiau „galutinių“ reakcijų (angl. dead-end reaction) metu, kai šios stadijos yra prisijungusios
prie likusios mechanizmo dalies tiktai viename gale, pusiausvyra gali būti palaikoma. Pavyzdžiui, kai,
vykstant tvarkingai dvisubstratinei-dviproduktinei reakcijai, susidaro „galutinis“ kompleksas EBQ:

k+1[A]
E EA
k-1

k+4 k-4[Q] k-2 k+2[B]

k-5 k-3[P]
EQ EAB
EBQ
k+3 EPQ
k+5[B]
Šiuo atveju kiekvienai fermento formai, išskyrus EBQ, King-Altman metodu gaunama išraiška
padauginama iš k-5. EBQ išraiška gaunama padauginus EQ išraišką iš k+5[B]. Tuomet
[EBQ] k  5 [B]
  K ir EQ, B ir EBQ yra pusiausvyroje. Taigi reakcijos greičio lygties išraiška me-
[EQ] k 5

chanizmui, turinčiam slopinimo stadiją, kurioje susidaro „galutinis“ kompleksas, sutampa su reakcijos
greičio išraiška, kai tokio slopinimo nėra, tik šioje išraiškoje vardiklyje esantį narį, atitinkantį EQ, rei-
 k [B]
kia padauginti iš  1   5  .
 k 5 

Galima nustatyti bendrąsias mechanizmų savybes, kuriuose dvi fermento formos nesujungtos
vienmolekulinių reakcijų stadijomis, pvz., E ir E´ fermento formas jungia tik dvimolekulinių reakcijų
stadijos:

86
 A B

E EA EAB
E'P
R

ER EQR E'
E'C
Q C
Pagal King-Altman metodą kiekvienas pografas turi šakas, vedančias iš E, E´ arba iš abiejų formų,
tai tuomet reakcijos greičio lygtyje kiekvienoje sandaugoje turi būti mažiausiai vienas narys su kon-
centracija ir neturi būti narių, sudarytų tik iš vienų konstantų. Kai yra trys tokios fermento formos, tai
kiekvinoje sandaugoje turi būti mažiausiai po du narius su koncentracijomis.

3.6. Dvisubstratinės-dviproduktinės reakcijos

Formaliai visos dvisubstratinės-dviproduktinės fermentinės reakcijos vyksta pernešant įvairias

chemines grupes. Tai transferazinės reakcijos:

AX + B A + BX

Šių reakcijų yra dauguma (oksidoreduktazės, transferazės, hidrolazės).

Galimi du transferazinės reakcijos mechanizmai:

EAX EX EBX

E EAXB EABX E

EB EA

Šioje schemoje AX ir B yra reakcijos substratai, A ir BX – produktai. Kai fermentinės reakcijos

metu susidaro tik dvinariai kompleksai (viršutinis kelias), aktyviajame centre substratai AX ir B nesu-
sitinka vienas su kitu. Kitu atveju, be dvinarių kompleksų (EAX, EB, EBX ir EA), susidaro ir komp-
leksai, kuriuose fermentas yra prisijungęs abi substratų molekules (apatinis kelias) – tai trinariai komp-
leksai. Šiuo atveju substratai gali jungtis netvarkingai arba tam tikra tvarka. Tarp tvarkingo ir netvar-
kingo mechanizmų gali būti įvairūs tarpiniai variantai, kurie nustatomi tiriant kinetiką nuostoviosios
būsenos sąlygomis.
Fermentinių reakcijų mechanizmams nustatyti taikomi trys pagrindiniai kinetiniai metodai:
a) pradinio reakcijos greičio matavimas nesant produktui;
b) slopinimo produktais prigimties nustatymas;
c) izotopiniai tyrimai naudojant substratus, turinčius žymę.

87
 Vykstant tvarkingai dvisubstratinei-dviproduktinei fermentinei reakcijai ir aktyviajame centre pri-
sijungus pirmajam substratui, kinta aktyviojo centro konformacija ir tik tuomet gali prisijungti antrasis
substratas – tai vadinama priverstine tvarka (angl. compulsory order) (38 pav.).

EXG

XG Y

E EXG . Y EX . GY E

GY

EX

EXY

38 pav. Tvarkingos dvisubstratinės-dviproduktinės reakcijos mechanizmas. XG ir Y yra fermenti-

nės reakcijos substratai, GY ir X – produktai. Reakcijos metu susidaro tarpinis trinaris kompleksas
EXGY. Kai X ir Y koncentracijos yra didelės, gali susidaryti neproduktyvus kompleksas EXY

Kitas atvejis, kai fermentinė reakcija vyksta susidarant tik dvinariams kompleksams. Trinarių
kompleksų susidarymas negalimas, nes X ir Y prijungiantys centrai sutampa arba persidengia
(39 pav.).

EX E . GX EG . X

X GX X

E EG

Y GY Y

EY E . GY EG . Y
39 pav. Dvisubstratinės-dviproduktinės fermentinės reakcijos mechanizmas susidarant tik dvina-
riams kompleksams. GX ir Y yra reakcijos substratai, X ir GY – produktai. Kai X ir Y koncentra-
cijos yra didelės, gali susidaryti neproduktyvūs kompleksai EX ir EY

88
 Fermentinių dvisubstratinių-dviproduktinių reakcijų metu, kai susidaro trinariai kompleksai, fer-
mento aktyviajame centre vyksta betarpiška reakcija tarp substratų – atakuojanti grupė Y pakeičia at-
siskiriančią grupę X:

Y: X Y X:

Y+EGX EGY+X
Šiuo atveju fermento aktyviajame centre įvyksta substratų molekulių konformaciniai pokyčiai. Jie
vienas kito atžvilgiu išsidėsto taip, kad „lengviausiai“ įvyktų reakcija. Aktyviajame centre substratų
molekulės poliarizuojasi ir tai suteikia joms didesnį reakcingumą. Tokias reakcijas Košlandas pasiūlė
vadinti vieno pakeitimo reakcijomis (angl. single-displacement reaction). Šių reakcijų mechanizmas
yra labai panašus į SN2 pakeitimo reakcijas (dvimolekulinio nukleofilinio pakeitimo reakcijos). Vieno
pakeitimo reakcijos vyksta pasikeičiant konfigūracijai prie asimetrinio atomo.
Kai fermentinių reakcijų metu susidaro tik dvinariai kompleksai, aktyviajame centre nevyksta re-
akcija tarp abiejų substratų molekulių:

B: B
X X:

E+GX EG+X

B B:
:Y Y

EG+Y E+GY
Tai dviejų pakeitimų reakcija, kurios metu prie asimetrinio atomo įvyksta du konfigūraciniai pasi-
keitimai ir po reakcijos yra atkuriama pradinė konfigūracija, kuri buvo iki reakcijos.
Tarp vieno pakeitimo ir dviejų pakeitimų reakcijų nėra griežtų ribų, pvz., yra atvejų, kai vieno pa-
keitimo reakcijose prie asimetrinio atomo išlieka pradinė konfigūracija. Taip gali įvykti, kai atakuojan-
ti grupė priartėja prie molekulės iš tos pačios pusės, kur yra atsiskiriančioji grupė. Tai SNi pakeitimo
reakcijos (vidumolekulinio nukleofilinio pakeitimo reakcijos). Organinėje chemijoje tokios reakcijos
yra labai retos, tačiau fermentinėse sistemose jos yra dažnos. Aiškinantis fermentinių reakcijų stere-
ochemiją, galima gauti papildomos informacijos apie reakcijų mechanizmus, tačiau visiškai nebūtina,
kad tie patys rezultatai būtų gaunami kinetiniais ir stereocheminiais analizės metodais. Pavyzdžiui,
dviejų pakeitimų reakcija gali vykti susidarant trinariam kompleksui, jeigu pirmoji atsiskiriančioji gru-
pė X išlieka prisijungusi fermento aktyviajame centre iki tol, kol įvyksta antrasis pakeitimas.

89
 3.6.1. Fermentinių reakcijų mechanizmų klasifikacija ir jų scheminis atvaizdavimas

1963 m. W.W. Cleland pasiūlė scheminį fermentinių reakcijų mechanizmų atvaizdavimą [46]. Jo
pasiūlytose schemose reakcijos metu susidarančios įvairios fermentų formos yra užrašomos horizonta-
laus brūkšnio apačioje, o rodyklėmis parodomos substratų prisijungimo ir produktų susidarymo stadi-
jos. Pvz., tvarkingos dvisubstratinės-dviproduktinės reakcijos mechanizmas, susidarant tarpiniams tri-
nariams kompleksams, pavaizduojamas tokia schema:

A B P Q

E EA EAB EPQ EQ E
Netvarkingų stadijų pavaizdavimui braižomos atsišakojančios linijos:

A B P Q

EA EQ
E E
EAB EPQ
EB EP
B A Q P
Šiose fermentinėse reakcijose A ir B yra substratai, P ir Q – produktai.
Visos dvisubstratinės-dviproduktinės reakcijos vadinamos bi-bi reakcijomis. Netvarkingų reakcijų
mechanizmai, susidarant trinariams kompleksams, vadinami netvarkingais bi-bi mechanizmais (angl.
random bi bi mechanisms). Tvarkingų reakcijų mechanizmai, susidarant trinariams kompleksams, va-
dinami tvarkingais bi-bi mechanizmais (angl. ordered bi bi mechanisms). Tvarkingų reakcijų mecha-
nizmai, susidarant dvinariams kompleksams, vadinami ping–pong bi–bi mechanizmais. Mechanizmai
reakcijų, kurių metu produktai atskyla po to, kai prisijungia visi substratai (dvisubstratinių-
dviproduktinių reakcijų atveju tai trinario komplekso susidarymas), vadinami nuosekliais mechaniz-
mais (angl. sequential mechanisms). Mechanizmai reakcijų, kurių metu kai kurie produktai susidaro
anksčiau nei visi substratai prisijungia prie fermento, vadinami ping-pong mechanizmais. Pavadini-
muose mechanizmų, kuriuose vyksta fermento izomerizacija, yra priešdėlis „izo“. Parodant substratų
prisijungimo stadijų skaičių arba produktų susidarymo stadijų skaičių bei tais atvejais, kai iškyla nea-
pibrėžtumas, vartojami priešdėliai „uni“, „bi“, „ter“, „kvad“, pvz., izo-bi-bi-uni-uni-ping-pong fermen-
tinės reakcijos mechanizmas. Tai trisubstratinis-triproduktinis mechanizmas, kai, tvarkingai prisijun-
gus pirmiesiems dviem substratams, susidaro du produktai. Po to prisijungia trečiasis substratas ir su-
sidaro trečiasis produktas, o reakcijos pabaigoje fermentas izomerizuojasi į pradinę formą.

3.6.2. Dvisubstratinių reakcijų greičio lygtys

Matuojant fermentinių reakcijų, vykstančių nuostoviosios būsenos sąlygomis, greitį galima nusta-
tyti reakcijų kinetinius mechanizmus. H.L. Segal, J.F. Kachmar ir P.D. Boyer pirmieji pradėjo įvairių

90
fermentinių reakcijų mechanizmų kinetinę analizę [47]. Vėliau jų darbus tęsė R.A. Alberty ir K.
Dalziel [48–50]. Nustatant fermentinių reakcijų kinetinius mechanizmus, matuojamas nuostoviosios
būsenos sąlygomis vykstančių reakcijų greitis. Gautos reakcijų greičio lygtys atspindi vieną ar kitą
fermentinės reakcijos mechanizmą, pvz., vykstant tvarkingai dvisubstratinei-dviproduktinei reakcijai,
kurios metu susidaro trinaris kompleksas (38 pav.), gaunama nuostoviosios būsenos greičio lygtis:

[E] o(c1[A][B]  c 2[P][Q])

v
c3  c 4[A]  c5[B]  c 6[P]  c 7[Q]  c8[A][B]  c9[A][P]  c10[B][Q]  c11[P][Q]  c12[A][B][P]  c13[B][P][Q]

Šioje lygtyje yra 13 koeficientų, kurių skaitinės vertės apibrėžiamos aštuoniomis greičio konstan-
tomis:

c1  k 1k  2 k  3 k  4
c 2  k 1k  2 k  3 k  4
c 3  k 1 ( k  2  k  3 ) k  4
c 4  k+1 ( k  2  k  3 ) k  4
c 5  k  2 k  3k  4
c 6  k 1k  2 k  3
c 7  k 1 ( k  2  k  3 ) k  4
c8  k 1k  2 (k 3  k  4 )
c9  k 1k  2 k 3
c10  k  2 k 3 k  4
c11  (k 1  k  2 ) k 3 k  4
c12  k 1k  2 k 3
c13  k  2 k 3 k  4

Nuostoviosios būsenos greičio lygties koeficientai neturi jokios fizikinės prasmės. Šią lygtį galima
perrašyti vartojant kitus koeficientus, turinčius tam tikrą enzimologinę prasmę. Tarptautinės biochemi-
f
kų sąjungos fermentų komisija rekomenduoja maksimalų tiesioginės reakcijos greitį žymėti Vmax ,o
r
maksimalų priešingos krypties grįžtamosios reakcijos greitį – Vmax . Be to, kiekvienam reagentui užra-

šomos Michaelio konstantos ( KMA ; KMB ir t. t.) ir „slopinimo konstantos“ ( K iA ; K iB ir t. t.). Bendruoju
atveju Michaelio konstantos atitinka KM viensubstratinėse reakcijose, o slopinimo konstantos atitinka
(tačiau nebūtinai lygios) konstantoms Ki ir K i' . Tam tikromis sąlygomis slopinimo konstantos yra ly-
gios fermento-substrato kompleksų disociacijos konstantoms, todėl jos kartais žymimos ne Ki, bet Ks.
Taikant šiuos žymėjimus, greičio lygtį galima perrašyti:
f r
Vmax [A][B] Vmax [P][Q]

A B
Ki K M KM P
K iQ (3.20)
v
[A] K A [B] K Q [P] [Q] [A][B] K Q [A][P] K A [B][Q] [P][Q] [A][B][P] [B][P][Q]
1  A  AM B  PM Q  Q  A B  AM P Q  AM B Q  P Q  A B P  B P Q
Ki Ki K M K M Ki Ki Ki K M Ki K M Ki Ki K M Ki K M Ki Ki K M Ki Ki K M Ki

Šioje lygtyje:

k  3 k  4 [E] o (k  2  k 3 )k  4 k 1
f
Vmax  K MB  K iA 
k 3  k 4 k  2 (k 3  k  4 ) k 1
k 1k  2 [E] o (k 2  k 3 )k 1 k 1  k  2 k 4
r
Vmax  K MP  K iB  K iQ 
k 1  k  2 k 3 (k 1  k  2 ) k 2 k 4
k 3k 4 k 1k 2 k 3  k 4
A
KM  K MQ  K iP 
k 1 ( k  3  k  4 ) k  4 (k 1  k  2 ) k3

91
 Kai dvisubstratinė-dviproduktinė reakcija yra netvarkinga ir reakcijos metu susidaro trinaris
kompleksas, tuomet gaunama (3.21) greičio lygtis:

f r
Vmax [A][B] Vmax [P][Q]

K iA K M
B P
KM K iQ
v . (3.21)
[A] [B] [P] [Q] [A][B] [P][Q]
1 A  B  P  Q  A B  P Q
Ki Ki Ki Ki Ki KM KM Ki
(3.21) lygtis gaunama, kai reakcijos metu visos fermento formos yra pusiausvyroje (išskyrus
EAB  EPQ stadiją). Tuomet KiA , KiB , KiP ir KiQ yra atitinkamų kompleksų EA, EB, EP ir EQ diso-
A
ciacijos konstantos. K M B
ir K M – EAB komplekso disociacijos konstantos, susidarant atitinkamai A ir
P Q
B, K M ir K M yra EPQ komplekso disociacijos konstantos susidarant atitinkamai P ir Q. Nors (3.21)

lygtyje nėra K M
A Q
ir K M konstantų, jas galima įrašyti, nes dvisubstratinės-dviproduktinės netvarkingos
A
reakcijos mechanizme K M B
× K iB sandaugą galima pakeisti K iA × K M Q
, o K iP × K M P
– KM × K iQ sandau-
ga. (3.20) lygtyje tokių pakeitimų atlikti negalima, todėl (3.20) lygtis yra sudėtingesnė ir turi daugiau
papildomų narių.
Kai dvisubstratinė-dviproduktinė reakcija vyksta susidarant tik dvinariams kompleksams, gauna-
ma (3.22) greičio lygtis:
f r
Vmax [A][B] Vmax [P][Q]

K iA K M
B
K iP K M
Q
v A P A
. (3.22)
[A] K M [B] [P] K M [Q] [A][B] [A][P] K M [B][Q] [P][Q]
A
 A B
 P
 P Q
 A B
 A P
 
Ki Ki K M Ki Ki K M Ki K M Ki Ki A B
K i K M K iQ K iP K M
Q

P
(3.22) greičio lygtį palyginus su (3.20) lygtimi, (3.20) lygtyje esanti K M KiQ sandauga (3.22) lyg-

tyje yra pakeista į KiP K M

Q
sandaugą.

3.6.3. Dvisubstratinių-dviproduktinių reakcijų pradinio greičio lygtys

Kai reakcijos produktų koncentracijos yra lygios 0 ([P] = 0 ir [Q] = 0), tai lygtys (3.20), (3.21) ir
(3.22) virsta pradinio greičio lygtimis. Tvarkingai dvisubstratinei-dviproduktinei reakcijai, kurios metu
susidaro trinaris kompleksas (38 pav.), gaunama (3.23) pradinio greičio lygtis:

Vmax [A][B]
v . (3.23)
K K  K MB [A]  K MA [B]  [A][B]
i
A B
M

Išanalizavus šią lygtį, esant ribinėms [A] ir [B] vertėms, galima sužinoti konstantų Vmax, K iA , K M
B

A
ir K M vertes. Kai [A] ir [B] yra labai didelės, tuomet v = Vmax. Taigi, Vmax yra greitis, kai [A] ir [B]
koncentracijos yra įsotinančios. Ši Vmax vertė atitinka Vmax viensubstratinėse reakcijose. Norint tai įro-
dyti, reikia išspręsti:

92
 Vmax
limv  A B  Vmax
[A][B]  K K K MB K MA
i
 M
 1
[A][B] [B] [A]

Vmax [A]
Kai [B] yra labai didelė, tai v  . Ši lygtis sutampa su Michaelio-Menten lygtimi. K M
A
K MA  [A]

yra ribinė substrato A Michaelio konstantos vertė, kai [B] įsotinanti. Substratui B konstantos K M
B
vertė

yra analogiška. KiA  K MA . Konstantos K iA vertę galima rasti tuomet, kai [B]0 (tačiau nelygi 0).
Tuomet:

V [B] K MB [A]
v
max
.
KiA  [A]

KiA yra substrato A ribinė Michaelio konstantos vertė, kai [B]0. KiA taip pat yra tikroji EA
komplekso disociacijos konstanta, nes kai [B]0, tai sąveikos greitis tarp B ir EA taip pat sumažėja

iki 0. (3.23) lygtyje nėra K iB konstantos, nes substratas B nesijungia fermento E aktyviajame centre.
Matuojant pradinių reakcijų greičius, negalima nustatyti skirtumų tarp A ir B substratų, nes kei-
čiant substratų A ar B koncentracijas, gaunama tokia pati reakcijos greičio lygtis. Keičiant vieno kurio
nors substrato koncentraciją, esant pastoviai (bet nesotinančiai) kito substrato koncentracijai, lygtį
(3.23) galima užrašyti Michaelio-Menten lygtimi:

 Vmax [B] 
 B  [A]
 K M  [B]
v . (3.24)
 KiA K MB  K MA [B]
   [A]
 K MB  [B] 
(3.24) lygtyje:

Vmax [B]
Vmax [B] K K  K [B]
A B
V A '
K MA
'
Vmax  ir K M' 
i M
be to,
M max
 A B .
K M  [B]
B
K  [B] B
K '
Ki K M
 [B]
M M

K MA

' '
Vmax ir K M vertės priklauso nuo substrato B koncentracijos.
Matuojant reakcijos greitį, keičiama substrato A koncentracija, esant pastoviai substrato B kon-
centracijai. Reakcijos greitis nustatomas esant kelioms skirtingoms fiksuotoms substrato B koncentra-
cijoms. Brėžiamas [A]/v = f([A]) grafikas. Iš šio grafiko, esant skirtingai fiksuotai substrato B koncent-
' '
racijai, galima rasti konstantų Vmax ir K M vertes. Tai pirminis grafikas (40 pav.).

93
 [A]/

 KiA
[A]

( K MA  KiA ) / Vmax

40 pav. [A]/v = f([A]) Hanes pirminis grafikas dvisubstratinės-dviproduktinės fermentinės reakci-

jos mechanizmui, susidarant trinariui kompleksui. Fermento aktyvumas neslopinamas substrato
pertekliumi

Tiesių susikirtimo taškas yra kairėje [A]/v ašies pusėje. Šio taško koordinatės [A] ašies atžvilgiu
A
priklauso nuo to, ar konstantos K M skaitinė vertė yra didesnė ar mažesnė už K iA vertę.

Vmax [B] [B] K MB 1 [B]

Lygtį V '
 B galima perrašyti į '   [ B] . Grafikas '  f ([B]) yra tie-
max
K M  [B] Vmax Vmax Vmax Vmax

1
sė, kurios pasvirimo kampo tangentas lygus (41 pav.).
Vmax

[B]
V'max

B
KM

B Vmax
-KM

[B]

[B]
41 pav. '
 f ([B]) antrinis grafikas dvisubstratinės-dviproduktinės fermentinės reakcijos me-
Vmax
chanizmui susidarant trinariui kompleksui

Vmax [B]
'
V K MA [B]K M' KiA K MB K MA
 A B  
max
Analogiškai iš lygties ' gaunama ' [ B] .
K Ki K M Vmax Vmax Vmax
 [B]
M

K MA

[B]K M' K MA
'  f ([B]) grafikas yra tiesė, kurios pasvirimo kampo tangentas lygus (42 pav.).
Vmax Vmax

94
 [B]K'M
V'max

A B
A B Ki KM
Ki KM
-
A Vmax
KM

[B]

[B]K M'
42 pav. '  f ([B]) antrinis grafikas dvisubstratinės-dviproduktinės fermentinės reakcijos
Vmax
mechanizmui susidarant trinariui kompleksui

[B] [B]K M'

'  f ([B]) ir '  f ([B]) grafikai yra antriniai. Iš jų galima rasti visas keturias (3.23)
Vmax Vmax
A
lygties konstantas – Vmax, K iA , K M B
ir K M .
Analogišką analizę galima atlikti keičiant substrato B koncentraciją, esant pastoviai substrato A
koncentracijai. Brėžiamas [B]/v = f([B]) pirminis grafikas.
Netvarkingai dvisubstratinei-dviproduktinei reakcijai, kurios metu susidaro trinaris kompleksas,
taip pat gaunama (3.23) pradinio greičio lygtis, o tai reiškia, kad vien matuojant pradinius dvisubstra-
tinių-dviproduktinių reakcijų greičius, negalima nustatyti, kokiu būdu fermento aktyviajame centre
jungiasi substratai – tvarkingai ar netvarkingai.
Tvarkingai dvisubstratinei-dviproduktinei reakcijai, kurios metu susidaro tik dvinariai kompleksai
(39 pav.), gaunama (3.25) pradinio greičio lygtis:

Vmax[A][B]
v . (3.25)
K M [A]  K M
B A
[B]  [A][B]
(3.25) lygties vardiklyje nėra narių, turinčių vien konstantas (visuose nariuose yra substratų A ar B
koncentracijos). Šio mechanizmo pirminis grafikas taip pat turi savų ypatybių. Keičiant substrato A
koncentraciją, esant pastoviai substrato B koncentracijai, (3.25) lygtį galima perrašyti Michaelio-
Menten lygtimi:

 Vmax[B] 
 
 K B  [B] [A]
v M A
 . (3.26)
K M [B]
 [A]
KM B
 [B]

95
 Vmax [B] A '
KM [B] Vmax V
(3.26) lygtyje pažymima: V '
 B , KM  B
'
ir  max . Šiuo atveju, kintant
max
K M  [B] K M  [B] KM ' A
KM
'
substrato B koncentracijai, tik Vmax kinta tokiu pat būdu kaip ir susidarant trinariam kompleksui. Labai
'
Vmax
svarbus šio mechanizmo bruožas yra tas, kad '
santykis nepriklauso nuo substrato B koncentraci-
KM
jos. Nubrėžus [A]/v = f([A]) pirminį grafiką, esant pastoviai substrato B koncentracijai, gaunama šeima
tiesių, susikertančių viename taške [A]/v ašyje (43 pav.):

[A]/v

A
KM
Vmax

[A]
43 pav. [A]/v = f([A]) Hanes pirminis grafikas dvisubstratinės-dviproduktinės fermentinės reakci-
jos mechanizmui, susidarant tik dvinariams kompleksams. Fermento aktyvumas neslopinamas
substrato pertekliumi
A
Išskyrus labai retus atvejus, kai K iA << K M , dvisubstratinių-dviproduktinių fermentinių reakcijų,
vykstančių susidarant tarpiniams trinariams kompleksams ir susidarant tik dvinariams kompleksams
pirminiai grafikai skiriasi (40 pav. ir 43 pav.).
B A
Norint sužinoti (3.25) lygtyje esančių konstantų Vmax, K M ir K M vertes, pakanka nubrėžti vieną
[B]
antrinį grafiką '  f ([B]) , kurio savybės yra analogiškos antriniams grafikams, gautiems analizuo-
Vmax

jant dvisubstratinių-dviproduktinių fermentinių reakcijų mechanizmus, kai susidaro tarpiniai trinariai

kompleksai.

96
 4. Fermentų aktyvumo slopikliai. Fermentinių reakcijų lėtinimas

Medžiagos, kurios, prisijungusios prie fermentų molekulių, mažina reakcijos greitį, vadinamos
slopikliais. Jie veikia įvairiais būdais, todėl yra daug įvairių šių medžiagų veikimo mechanizmų. Dalis
slopiklių slopina fermentus negrįžtamai. Šie slopikliai vadinami kataliziniais nuodais. Tokia negrįžta-
mųjų slopiklių veikla yra retai nagrinėjama fermentinėje kinetikoje. Dauguma fermentų netenka akty-
vumo paveikus juos sunkiųjų metalų jonais bei įvairiais junginiais, kovalentiškai prisijungiančiais ak-
tyviuosiuose centruose prie funkciškai svarbių fermento molekulės cheminių grupių. Gryninant fer-
mentus, labai svarbu išvengti negrįžtamo jų aktyvumo praradimo, veikiant sunkiųjų metalų jonams.
Negrynuose fermentų preparatuose yra didelė baltymų koncentracija, todėl baltymų priemaišos prijun-
gia beveik visus tirpale esančius sunkiųjų metalų jonus. Taip baltymai apsaugo gryninamą fermentą
nuo aktyvumo praradimo. Gryninimo metu šie baltymai yra pašalinami, todėl padidėja galimybė sun-
kiųjų metalų jonams prisijungti ir inaktyvuoti gryninamo fermento molekules. Fermentų gryninimo
metu yra būtina naudoti junginius, sujungiančius sunkiųjų metalų jonus. Kai kuriais atvejais negrįžta-
mųjų slopiklių panaudojimas yra naudingas, pvz., dvivalenčio gyvsidabrio jonais galima nustatyti fer-
mento aktyvumui svarbias aktyviajame centre esančias tiolines grupes.
Fermentinių reakcijų kinetikoje nagrinėjami grįžtamieji fermentų slopikliai. Šie slopikliai, sąvei-
kaudami su fermentų molekulėmis, sudaro dinaminius kompleksus, kurių katalizinės savybės skiriasi
nuo laisvųjų fermento molekulių. Grįžtamieji slopikliai gali padidinti konstantos KM vertę (konkuren-
cinis slopinimas), sumažinti Vmax vertę (nekonkurencinis slopinimas), vienodai sumažinti Vmax ir KM
vertes (bekonkurencinis slopinimas) arba gali pasireikšti įvairūs kiti efektai (mišrus slopinimas).
Analizuojant įvairius slopinimo atvejus, dažnai remiamasi J. Botts ir M. Morales schema, kuri ap-
rašo įvairių modifikatorių (slopiklių ar aktyviklių) veikimo mechanizmus (44 pav.).

E ES

P
I I
S

EI EIS

P
44 pav. Botts ir Morales schema
Botts ir Morales schemoje yra keturios fermento formos (E, ES, EI ir EIS) ir šešios reakcijos,
vykstančios tarp šių formų. Konkrečius kiekvieno slopinimo atvejus galima gauti neįskaitant tam tikrų
97
reakcijų, pvz., konkurencinis slopinimas bus tuomet, kai nėra EIS formos ir reakcijų, kuriose ši forma
dalyvauja. Nekonkurencinis, jeigu nėra EI formos, mišrus, jeigu schemoje yra EI ir EIS formos, tačiau
tiesioginio perėjimo tarp jų nėra.
Kai kurie mokslininkai skiria kompleksus EI (slopiklis prisijungęs fermento aktyviajame centre) ir
IE (slopiklis prisijungęs kitoje fermento molekulės vietoje). Toks skyrimas neturi didelės praktinės
vertės, nes paprastai neaptinkama mechanizmų, kuriuose tuo pačiu metu būtų EI ir IE. Bendruoju atve-
ju EIS komplekse slopiklis ir substratas yra prisijungę skirtingose fermento molekulės vietose.
Priklausomai nuo to, ar susidaręs EIS kompleksas yra produktyvus ar neproduktyvus, grįžtamieji
slopinimo atvejai gali būti: visiškas (EIS kompleksas neproduktyvus) arba dalinis (iš EIS komplekso
gali susidaryti reakcijos produktai).

4.1. Konkurencinis slopinimas

Tai labiausiai paplitęs slopinimo tipas. Slopiklis jungiasi fermento aktyviajame centre kaip ir
substratas, sudarydamas neproduktyvų kompleksą. Šiuo atveju gali susidaryti tik vienintelis EI komp-
[E][I]
leksas, kuris yra „galutinis“, nes gali disocijuoti tik į E ir I. Pusiausvyros sąlygomis: Ki  , čia
[EI]
Ki – slopinimo konstanta. Esant sudėtingesniems slopinimo atvejams, ši konstanta nėra pusiausvyros
konstanta, nes EI kompleksas gali būti „negalutinis“.
Visišką nekonkurencinį slopinimą vaizduoja schema:

k+1 k+3
E+S ES E+P
k-1
k2
 Ki
k2
k+2
E+I EI
k-2

Nuostoviosios būsenos sąlygomis k1[S][E]  (k1  k3 )[ES] ir k 2 [I][E]  k 2 [EI ] . Kadangi pra-

dinė fermento koncentracija [E]o = [E] + [ES] + [EI], tai galima perrašyti

k 1 [S] [E]o  [ES]  [EI]   k 1  k  3  [ES] ir k  2 [I] [E]o  [ES]  [EI]  k  2 [EI] . Reakcijos greitis

v = k+3[ES].
Iš čia:

k 3 [E] o
v .
k 1  k 3  k  2 [I] 
1 1  
k 1[S]  k 2 

k 1  k 3 k
Šioje lygtyje  K M ir 2  K i , todėl galima perrašyti
k 1 k 2

98
 Vmax
v (4.1)
K  [I] 
1  M 1  
[S]  K i 

Konkurenciniai slopikliai padidina konstantos KM vertę (1 + [I]/Ki ) kartų ir neturi įtakos Vmax vertei.

Konkurencinio slopinimo efektyvumas priklauso nuo substrato ir slopiklio koncentracijų santykio.

Esant pastoviai slopiklio koncentracijai ir didinant substrato koncentraciją, vis daugiau substrato mo-
lekulių prisijungia fermento aktyviajame centre. Reakcijos mišinyje vyrauja ES kompleksas, o tai reiš-
kia, kad Vmax vertė nepakinta.
Konkurencinio slopinimo atveju pusiausvyros sąlygomis greičio lygtis yra analogiška (4.1)
lygčiai, tik vietoje konstantos KM yra konstanta Ks, t. y. k–1/k+1.
Kartais „konkurencinis“ slopinimas vyksta veikiant negrįžtamiesiems slopikliams, kai substrato
molekulės gali iš dalies apsaugoti fermentą nuo tokio slopiklio poveikio. Tuomet sumažėja slopinimo
greičio konstanta. Tačiau grįžtamai prisijungiantis substratas negali apsaugoti fermento nuo visiško jo
slopinimo, kuris vis dėlto įvyksta, veikiant negrįžtamajam slopikliui. Pusiausvyroje visada yra nedide-
lis kiekis laisvojo fermento molekulių, kurios yra veikiamos tokio slopiklio. Šio negrįžtamojo slopiklio
poveikio negalima sumažinti arba panaikinti didinant substrato koncentraciją.
J. Monod, J.P. Changeux ir F. Jacob aprašė konkurencinio slopinimo atvejį, kai substratas ir slo-
piklis jungiasi skirtingose fermento vietose [51]. Substrato prisijungimas pakeičia fermento molekulių
konformaciją ir todėl slopiklio molekulės sunkiau prisijungia. Analogiškai, prisijungus slopiklio mo-
lekulėms, prisijungia sunkiau substrato molekulės. Kadangi Monod, Changeux, Jacob mechanizme
slopiklis jungiasi kitoje vietoje nei substratas, todėl jo struktūra gali skirtis nuo substrato molekulių
struktūros. Toks konkurencinio slopinimo atvejis vadinamas alosteriniu slopinimu.
Dalinio konkurencinio slopinimo schema:

S k
E ES E+P
Ks

I Ki K'i I

S k
EI EIS EI + P
K's

Kadangi konkurencinis slopiklis turi įtakos tik fermento ir substrato giminingumui, susidarę tarpi-
niai ES ir EIS kompleksai suskyla, susidarant produktams, vienodu greičiu, o bendras fermentinės re-
akcijos greitis yra lygus šių kompleksų suskilimo greičių sumai. Pusiausvyros sąlygomis:

99
 [E] o  [ES]  [EI]  [EIS] [S]  KS [ES]
[E] o  [ES]  [EI]  [EIS] [I]  Ki [EI]
[EI][S]  KS' [EIS]
[ES][I]  Ki' [EIS]

Fermentinės reakcijos greitis v = k([ES] + [EIS]).

Iš čia:

k [E]o
v (4.2)
 [I] 
1 
KS  Ki 
1 
[S]  [I]KS 
1 
 Ki KS' 
k [E]o
Kai [I] = 0, tai (4.2) lygtis tampa Michaelio-Menten lygtimi, o kai [I]  , tuomet v  .
KS'
1
[S]
Taigi, veikiant daliniam konkurenciniam slopikliui, susidaro nauja fermento forma EI, kuri nuo formos
E skiriasi giminingumu substratui. Substrato giminingumą formai EI rodo konstanta K s' . Visiško slo-
pinimo atvejį galima atskirti nuo dalinio, didinant slopiklio koncentraciją, esant pastoviai substrato
koncentracijai. Esant įsotinančiai slopiklio koncentracijai, dalinio konkurencinio slopinimo atveju su-
sidaro fermento forma EI, pasižyminti mažesniu giminingumu substratui nei fermento forma E. Šiuo
atveju reakcija nėra visiškai sustabdoma. Dalinio konkurencinio slopinimo atveju, keičiant substrato
koncentraciją, kinta fermento giminingumas slopikliui. Fermento formos E giminingumą slopikliui
rodo konstanta Ki, o formos ES – konstanta K i' . Šie giminingumo pokyčiai vyksta vienodu laipsniu,
K i KS
todėl dalinio konkurencinio slopinimo atveju:  ir (4.2) lygtį galima perrašyti:
K i' KS'

k [E]o
v (4.3)
 [I] 
1 
KS  Ki 
1 
[S]  [I] 
1 
 Ki' 

Kai Ki = K i' ir Ks = K s' – slopinimo nebus.

4.2. Nekonkurencinis slopinimas

Nekonkurenciniai slopikliai neturi įtakos fermento ir substrato susijungimui (giminingumui), o

keičia tik Vmax. Galimi du atvejai: a) susidaręs kompleksas EIS neskyla susidarant produktams, o reak-
cijos greitis priklauso tik nuo komplekso ES skilimo greičio (reakcijos mišinyje slopiklis sumažina ak-

100
tyvaus fermento kiekį); b) kompleksas EIS skyla skirtingu greičiu nei ES ir bendrasis reakcijos greitis
lygus abiejų šių procesų greičių sumai.
Visiško nekonkurencinio slopinimo schema:

k+1[S]
k
E ES E+P
k-1

k+3[I] k-3 k-5 k+5[I]

k+4[S]
EI EIS
k-4
Kadangi nekonkurencinis slopiklis nepakeičia fermento giminingumo substratui, o prisijungęs
k 1 k 4
substratas nepakeičia giminingumo slopikliui, tai pusiausvyros sąlygomis: K s   ir
k 1 k  4

k 3 k 5
Ki   .
k 3 k 5
Tuomet:

[E] o  [ES]  [EI]  [EIS] [S]  KS [ES]

[E] o  [ES]  [EI]  [EIS] [I]  Ki [EI]
[EI][S]  KS [EIS]
[ES][I]  Ki [EIS]

Fermentinės reakcijos greitis v = k[ES].

Iš čia:

Vmax
[I]
1
Ki
v (4.4)
KS
1
[S]

Nekonkurenciniai slopikliai sumažina Vmax (1 + [I]/Ki) kartų ir neturi įtakos konstantai Ks.

Kai [I]  , tai Vmax  0 (nekonkurencinio slopiklio veikimo negalima pašalinti didinant substra-
to koncentraciją).
Negrįžtamųjų slopiklių veikimas yra panašus į nekonkurencinį slopinimą, nes aktyvaus fermento
koncentracijos sumažėjimas reakcijos mišinyje mažina Vmax vertę, o konstantos KM vertė nekinta. Ta-
čiau negrįžtamojo slopinimo metu gauta „Ki“ neturi jokios kinetinės prasmės.
Dalinio nekonkurencinio slopinimo metu susidaręs EIS kompleksas skyla ir susidaro produktai.
Šios reakcijos greičio konstanta yra lygi k΄. Tuomet bendras fermentinės reakcijos greitis v = k[ES] +
k΄[EIS].
101
 Pusiausvyros sąlygomis:

[I]
k [E]o  k' [E]o
Ki
[I]
1
Ki
v (4.5)
KS
1
[S]
Kai reakcijos mišinyje yra substrato perteklius ir nėra slopiklio, tai Vmax = k[E]o, o esant slopiklio
pertekliui – Vmax = k΄[E]o. Taigi, dalinio nekonkurencinio slopiklio perteklius nesustabdo reakcijos. Kai
k΄ = 0, tai greičio lygtis (4.5) virsta (4.4) lygtimi. Kai k΄ > k, tuomet I yra fermento aktyviklis.
(4.5) lygtį galima perrašyti:

k [E]o
v (4.6)
 [I] 
1 
 KS   Ki 
1 
 [S]   [I] k' 
1  
 Ki k 
(4.6) lygtyje ir dalinio konkurencinio slopinimo greičio lygtyje (4.2) yra viena ir ta pati funkcija
[I], tačiau (4.2) lygtyje santykis K s / K s' (konstantos, rodančios E ir EI fermento formų giminingumą
substratams) (4.6) lygtyje pakeistas k΄/k greičio konstantų santykiu, nes nekonkurenciniai slopikliai
nekeičia konstantos Ks vertės, tačiau sumažina Vmax.

4.3. Mišrus slopinimas

Mišraus slopinimo procese derinasi keli skirtingi slopinimo būdai. Mišrūs slopikliai pakeičia
Michaelio konstantos KM ir Vmax vertes. KM gali didėti arba mažėti, o Vmax visada mažėja. Mišrus slo-
pinimas pasireiškia įvairiose situacijose, todėl sudaryti bendrą reakcijos schemą sudėtinga. J.S. Frie-
denwald ir G.D. Maengwyn-Davies išanalizavo mišraus slopinimo atvejį kai slopiklis veikia kaip vi-
siškas nekonkurencinis ir iš dalies konkurencinis [52]. Vykstant tokiam slopinimui pusiausvyros sąly-
gomis, įrodyta, kad slopiklis ne tik turi įtakos fermento ir substrato sąveikai, bet visiškai sustabdo EIS
komplekso skilimą susidarant produktams. Taigi tai yra dalinio konkurencinio slopinimo schema, ta-
čiau šio mišraus slopinimo metu tik kompleksas ES skyla ir susidaro produktai:

Ks k
E ES E+P

Ki K'i

EI EIS
K's

102
 Išvedant reakcijos greičio lygtį visiško mišraus slopinimo atveju, taikomos tos pačios lygtys kaip ir
dalinio konkurencinio slopinimo atveju, išskyrus tai, kad reakcijos greitis v = k[ES].
Taigi gauname:

Vmax
v . (4.7)
KS  [I]   [I] 
1   1 ' 
[S]  Ki   Ki 
Schemoje, aprašančioje visišką mišrų slopinimą, yra keturios konstantos, o (4.7) greičio lygtyje –
K i KS
tik trys iš jų. Taip yra todėl, kad šio slopinimo metu  . (4.7) lygtį galima perrašyti:
K i' KS'

Vmax
 [I] 
1 ' 
 Ki 
v (4.8)
 [I] 
1 
KS  Ki 
1 
[S]  [I] 
1 ' 
 Ki 
(4.8) lygtis yra panaši į (4.4) visiško nekonkurencinio slopinimo greičio lygtį, tačiau (4.8) lygties
vardiklyje yra papildomas narys, turintis įtakos konstantos Ks vertei. Kai Ki = K i' , (4.8) lygtis virsta
visiško nekonkurencinio slopinimo greičio lygtimi.
Fermentų mišrus slopinimas gali vykti ir tais atvejais, kai slopiklis jungiasi ne prie E ir ES fermen-
to formų, bet prie tarpinių fermentinės reakcijos metu susidarančių junginių, pvz., R.M. Krupka ir K.
Laidler ištyrė acetilcholino esterazės mišraus slopiklio veikimą, kuris sulėtina acetilinto fermento hid-
rolizę [53].
Dalinio mišraus slopinimo schema:

Ks k
E ES E+P

Ki K'i

k'
EI EIS EI + P
K's

Šiuo atveju EIS kompleksas skyla ir susidaro produktai mažesniu greičiu nei ES kompleksas. k΄
yra EIS komplekso skilimo greičio konstanta. Dalinio mišraus slopinimo atveju fermentinės reakcijos
greitis v = k[ES] + k΄[EIS]. Vykstant reakcijai pusiausvyros sąlygomis, gaunama greičio lygtis:

103
  k' [I]
k [E]o  1  
 kK i' 
 [I] 
1 ' 
 Ki 
v
 [I] 
1 
KS  Ki 
1 
[S]  [I] 
1 ' 
 Ki 

Kai reakcijos mišinyje yra substrato perteklius ir nėra slopiklio, tai Vmax = k[E]o, o esant slopiklio
pertekliui – Vmax = k΄[E]o.

4.4. Bekonkurencinis slopinimas

Bekonkurenciniai slopikliai jungiasi tik prie susidariusio ES komplekso ir nesijungia prie laisvojo
fermento E.
Visiško bekonkurencinio slopinimo schema:

k+1 k+2
E+S ES E+P
k-1

k-3 k+3

EIS
Prisijungus bekonkurenciniam slopikliui, sumažėja ES komplekso, iš kurio susidaro reakcijos pro-
duktai, koncentracija, taip pat sumažėja Vmax vertė. Reakcijos mišinyje sumažėjus ES komplekso kon-
centracijai, sulėtėja ir reakcija, kurios metu iš ES susidaro substratas ir laisvas fermentas E, o tai suma-
žina konstantos Ks vertę. Kai bekonkurencinis slopinimas vyksta pusiausvyros sąlygomis, galima para-
[E][S] [ES][I] [E][S][I]
šyti: [ES]  ir [EIS]   . Šiuo atveju, reakcijos greitis v = k+2[ES] ir
Ks Ki Ki Ks
[E]o = [E] +[ES] + [EIS]. Tuomet:

v k  2 [ES]
 . (4.9)
[E] o [E]  [ES]  [EIS]
Padalijus (4.9) lygties abi puses iš k+2, gaunama:

[E][S]
v [ES] Ks
  . (4.10)
k  2 [E] o [E]  [ES]  [EIS] [E]  [E][S]  [E][S][I]
Ks Ki Ks
(4.10) lygties skaitiklį ir vardiklį padauginus iš Ks/[E], gaunama:

104
 v [S] [S]
  . (4.11)
Vmax
K s  [S] 
[S][I]  [I] 
K s  [S]1  
Ki  K i 
Padalijus (4.11) lygties abi puses iš (1 + [I]/Ki), gaunama:

v [S]
 . (4.12)
Vmax Ks
 [S]
 [I]   [I] 
1   1  
 Ki   Ki 
Vmax Ks
(4.12) lygtyje pažymima  Vmax
'
ir  K s' .
 [I]   [I] 
1   1  
 Ki   Ki 

Bekonkurenciniai slopikliai vienodai mažina Vmax ir konstantos Ks vertes – (1+ [I]/Ki) kartų.

Kai bekonkurencinis slopinimas vyksta nuostoviosios būsenos sąlygomis, tuomet:

k 1 [S]([E] o  [ES]  [EIS])  k 3 [EIS]  (k 1  k  2  k 3 [I])[ES]

k 3 [I][ES]  k 3 [EIS]

Fermentinės reakcijos greitis v = k+2[ES].

Iš čia:

k  2 [E] o
 [I] 
1  
 K i 
v ; (4.13)
KM 1
1 
 [I]  [S]
1  
 Ki 
k 1  k  2 k
čia: K M  ir K i   3 .
k 1 k 3

Viensubstratinėse reakcijose bekonkurencinis slopinimas vyksta retai. N.K. Ghosh ir W.H.

Fishman aprašė žiurkės žarnų šarminės fosfatazės bekonkurencinį slopinimą L-fenilalaninu [54].
Dalinio bekonkurencinio slopinimo schema:

k+1 k+2
E+S ES E+P
k-1

k-4 k+4

k+3
EIS E+I+P

Šiuo atveju k+3 < k+2. Vykstant reakcijai pusiausvyros sąlygomis, gaunama greičio lygtis:

105
    [I]  
  1   
v
k  2 [E] o

k  3 [E] o
 k  2 [E] o  Ks  1   Ki  
Ks [I] Ki  Ks   ( k  3 / k  2 )[ I]  [S]  ( k  3 / k  2 )[ I]  
1  1 1    1   1   
[S] K i [I]  [S]   Ki   Ki  

Kai k+3 = k+2, tai I yra fermento aktyviklis, kuris sumažina konstantos Ks vertę ir neturi įtakos Vmax.
k  2 [E] o
Tuomet: v  .
 Ks  1
   1
 1  [ I ] K i  [S]

4.5. Grafinis įvairių slopinimo atvejų iliustravimas

Įvairių slopinimo atvejų grafikai pateikiami dviejose koordinačių sistemose: v = f([S]) ir 1/v =
f(1/[S]) (45 pav.).

1/v 1/v

p
1/Vmax
p
1/Vmax 1/Vmax = 1/Vmax

1/[S] -1/KM -1/Kp 1/[S]

-1/KM = -1/Kp
Nekonkurencinis slopinimas Konkurencinis slopinimas

1/v 1/v

p p
1/Vmax 1/Vmax

1/Vmax 1/Vmax
-1/Kp

-1/KM -1/Kp 1/[S] 1/[S]

-1/KM
Mišrus slopinimas (Ki<K'i) Mišrus slopinimas (Ki>K'i)

1/v

p
1/Vmax

1/Vmax

-1/Kp -1/KM 1/[S]

Bekonkurencinis slopinimas

106
 v Vmax v
p
p
Vmax = Vmax
Vmax

KM = K p [S] KM K p [S]
Nekonkurencinis slopinimas Konkurencinis slopinimas

v Vmax v
Vmax

p p
Vmax Vmax

KM Kp [S] KpM K
K KMp
[S]
Mišrus slopinimas Bekonkurencinis slopinimas

45 pav. Įvairių slopinimo būdų grafinis iliustravimas v = f([S]) ir 1/v = f(1/[S]) koordinačių siste-
mose. Kp – Michaelio konstanta esant slopikliui, Vmax
p
– maksimalus reakcijos greitis esant slopik-
liui
Dalinių slopinimų grafikai yra tokie patys kaip ir visiško slopinimo atvejais, tačiau, didinant slo-
piklio koncentraciją, fermentinė reakcija nesustabdoma, bet pasiekiamas tam tikras ribinis reakcijos
greitis.
Grafinės analizės būdu ne visada galima nustatyti slopinimo pobūdį, pvz., analizuojant mišrų slo-
pinimą Lineweaver-Burk koordinatėse, tiesių susikirtimo taškas gali būti labai arti prie vienos iš koor-
dinačių sistemos ašių, todėl reikia papildomų įrodymų, norint atmesti konkurencinio arba nekonkuren-
cinio slopinimo atvejus. Bekonkurencinio slopinimo atveju reikia įrodyti, kad tiesės yra lygiagretės ir
nesudaro tam tikro kampo. Norint išsiaiškinti fermentų veiklos mechanizmus, būtina vienareikšmiškai
nustatyti slopinimo pobūdį, o tam reikia atlikti reakcijos greičio matavimus esant įvairioms slopiklio
koncentracijoms.

4.6. Slopinimo konstantų verčių apskaičiavimas

Slopinimo konstantų vertes galima apskaičiuoti keturiais būdais: 1) Lineweaver-Burk metodu; 2)

brėžiant tiesės pasvirimo kampo tangento priklausomybės nuo slopiklio koncentracijos grafikus; 3)
Diksono metodu; 4) Cornish-Bowden metodu.

4.6.1. Slopinimo konstantų verčių apskaičiavimas Lineweaver-Burk metodu

Norint apskaičiuoti slopinimo konstantų vertes Lineweaver-Burk metodu, braižomi 1/v = f(1/[S])
grafikai. Šiuose grafikuose išmatuojami koordinačių sistemos ašyse tiesių atkertami atitinkamų atkarpų
ilgiai, kai reakcijos mišinyje yra slopiklis ir kai jo nėra, pvz., konkurencinio slopinimo metu, kai reak-
cijos mišinyje nėra slopiklio, gauta tiesė 1/[S] ašyje atkerta atkarpą, kuri lygi -1/KM, o kai yra slopik-

107
  [ I]  [ I]
lis – -1/Kp. K p  K M 1   , tuomet slopinimo konstanta K i  . Nekonkurencinio slopinimo
 Ki  Kp
1
KM

atveju ašyje 1/v tiesė atkerta atkarpą, lygią 1/Vmax (kai nėra slopiklio) ir 1 Vmax
p
(kai yra slopiklis).

 [I]  [ I]
p
Vmax  Vmax 1   , tuomet slopinimo konstanta K i  .
 Ki  Vmax
p
 1
Vmax

Taip slopinimo konstantas galima apskaičiuoti ir kitiems slopinimo būdams:

 Kp 
[I]1  ' 
1) dalinio konkurencinio slopinimo atveju – K i  
Ks 
.
Kp
1
Ks

 V' 
[I]1  max
p


2) dalinio nekonkurencinio slopinimo atveju – K i    , čia: V ' – maksimalus reak-
Vmax
max
Vmax
p
1
Vmax
cijos greitis esant slopiklio pertekliui.
[ I] [ I]
3) visiško mišraus slopinimo atveju – K i  ir K i'  .
 [ I]  Vmax
1
K p 1  '  p
Vmax
 Ki   1
Ks
[ I]
4) dalinio mišraus slopinimo atveju – K i'  '
, čia: Vmax – maksimalus reakcijos
 Vmax  Vmax
p 
 p 
V V ' 
 max max 
greitis esant slopiklio pertekliui.
[ I]
5) visiško bekonkurencinio slopinimo atveju – K i  .
KM
1
Kp

[ I]
6) dalinio bekonkurencinio slopinimo atveju – K i  .
Ks
1
Kp

11 lentelėje pateikiamos Lineweaver-Burk grafike koordinačių sistemos ašyse atkertamų atkarpų

vertės įvairiais slopinimo atvejais.

108
 11 lentelė. Lineweaver-Burk grafike koordinačių sistemos ašyse atkertamų atkarpų vertės įvairiais
slopinimo atvejais
Slopinimo būdas 1/v ašis 1/[S] ašis
1
Visiškas konkurencinis slo- 1
 [ I] 
pinimas Vmax K M 1  
 Ki 
[ I]K s
1
Dalinis konkurencinis slopi- 1 K i K s'
nimas Vmax  [ I] 
K s 1  
 K i 

[ I]
Visiškas nekonkurencinis 1 1
Ki
slopinimas Ks
Vmax
[ I]
1
Dalinis nekonkurencinis Ki 1
slopinimas V ' [I] Ks
Vmax  max
Ki
 [ I] 
 [ I]  1  ' 
1  '   K 
Visiškas mišrus slopinimas  K   i 
 i 
 [ I] 
Vmax K s 1  
 Ki 
 [ I]   [ I] 
1  '  1  ' 
 K   K 
 i 

1  i 
Dalinis mišrus slopinimas
 k [I]  k[E ]o
'
 [ I] 
1   1   K s
 kKi' 
  Ki 
[ I] [ I]
Visiškas bekonkurencinis 1 1
Ki Ki
slopinimas
Vmax KM
  [ I]  
 1    [ I]
Dalinis bekonkurencinis   Ki   1 1
   Ki
 1  k  3 k  2 [I]   k  2 [E]o
slopinimas
Ks
 
 Ki 

4.6.2. Slopinimo konstantų verčių apskaičiavimas brėžiant tiesės pasvirimo kampo tangento
priklausomybės nuo slopiklio koncentracijos grafikus

Visiško konkurencinio slopinimo atveju (4.1) lygtį galima transformuoti į tiesės lygtį:

1 K M  [I]  1 1
 1    .
v Vmax  Ki  [S] Vmax

109
 K M  [I] 
1/v = f(1/[S]) grafikas yra tiesė, kurios krypties veiksnys (a) lygus 1   . Šios tiesės kryp-
Vmax  Ki 

Kp KM K
ties veiksnio vertė priklauso nuo slopiklio koncentracijos: a   [I]  M . Brėžiamas
Vmax Vmax K i Vmax
Kp/Vmax = f([I]) grafikas, iš kurio randama slopinimo konstantos Ki vertė:

Kp/Vmax

tg= KM/KiVmax

-Ki KM/Vmax


[I]

KM
Be to, K p  [I]  K M . Brėžiant Kp = f([I]) grafiką, taip pat galima rasti slopinimo konstantos
Ki
Ki vertę:

Kp

tg= KM/Ki

-Ki KM


[I]
Visiško nekonkurencinio slopinimo atveju (4.4) lygtį galima transformuoti į tiesės lygtį:

1 K  [I]  1 1  [I] 
 s 1    1  . (4.14)
v Vmax  K i  [S] Vmax  K i 

Ks  [I] 
1/v = f(1/[S]) grafikas yra tiesė, kurios krypties veiksnys (a) lygus 1   . Šios tiesės kryp-
Vmax  Ki 

Ks Ks K
ties veiksnio vertė priklauso nuo slopiklio koncentracijos: a  p
 [I]  s . Brėžiamas
Vmax VmaxK i Vmax
p
K s Vmax  f ([I]) grafikas, iš kurio randama slopinimo konstantos Ki vertė:

110
 p
Ks/Vmax

tg= Ks/KiVmax

-Ki Ks/Vmax


[I]

Visiško nekonkurencinio slopinimo atveju krypties veiksnio a išraiška yra tokia pati kaip visiško
konkurencinio slopinimo atveju. Be to, visiško nekonkurencinio slopinimo atveju:
1 1 1
p
 [I]  p
. Brėžiamas 1 Vmax  f ([I]) grafikas, iš kurio taip pat galima rasti slopinimo
Vmax VmaxKi Vmax

konstantos Ki vertę:

p
1/Vmax

tg= 1/KiVmax

-Ki 1/Vmax


[I]
Visiško mišraus slopinimo schema (= 0,  > 1):

Ks k
E+S ES E+P
+ +
I I

Ki Ki

k
EI + S EIS EI + P
Ks

Visiško mišraus slopinimo greičio lygtį (4.7) galima perrašyti:

1 K  [I]  1 1  [I] 
 s 1    1   (4.15)
v Vmax  Ki  [S] Vmax  K i 

Slopinimo konstantos Ki ir Ki gali būti apskaičiuotos iš Kp ir Vmax

p
verčių. Visiško mišraus slopi-

nimo atveju (4.15) lygtis yra labai panaši į visiško nekonkurencinio slopinimo lygtį (4.14), tik (4.15)
 [ I] 
lygtyje tiesės krypties veiksnys – 1   skiriasi nuo atkertančios atkarpos ilgio faktoriaus –
 Ki 

 [ I]  Kp Ks K
1   . Tiesės lygties (4.15) krypties veiksnys a  [I]  s ir
  K i 
p
Vmax Vmax K i Vmax
111
 1 1 1
 [I]  p
. Brėžiami K p Vmax  f ([I]) ir 1 Vmax
p
 f ([I]) grafikai, iš kurių randamos
V p
max Vmax K i Vmax

slopinimo konstantų Ki ir Ki vertės:

p p
Kp/Vmax 1/Vmax

-Ki Ks/Vmax -Ki 1/Vmax

[I] [I]

Visiško bekonkurencinio slopinimo atveju (4.13) lygtį galima perrašyti:

1 KM 1  [I]  1 1 1 1 1 1
  1   . Be to,  [I]  ir p  [I]  .
v Vmax[S] Vmax  Ki  K p K M Ki KM Vmax VmaxKi Vmax

p
Šiuo atveju brėžiami 1 Vmax  f ([I]) ir 1/Kp = f([I]) grafikai, iš kurių randama slopinimo konstan-

tos Ki vertė:

p
1/Vmax 1/Kp

tg= 1/KiVmax tg= 1/KiKM

-Ki -Ki 1/KM

1/Vmax
 

[I] [I]

4.6.3. Slopinimo konstantų verčių apskaičiavimas Diksono metodu

1953 m. M. Diksonas slopinimo konstantų verčių nustatymui pasiūlė naują grafinį metodą. Reak-
cijos metu matuojamas greitis esant pastoviai substrato koncentracijai, ir keičiama slopiklio koncentra-
ciją. Brėžiamas 1/v = f([I]) grafikas.
Visiško konkurencinio slopinimo atveju (4.1) lygtį galima perrašyti:

1 KM 1 KM [ I]
   
v Vmax [S] Vmax Vmax [S] K i

Brėžiant 1/v = f([I]) grafikus, kai substrato koncentracija lygi [S]1 ir [S]2, gaunamos tiesės, susi-
kertančios viename taške, kurio abscisės vertė [I] = -Ki:

112
 1/v
[S]1

[S]2

[S]2 > [S]1

-Ki [I]

Tiesių susikirtimo taške 1/v ir [I] vertės abiem atvejams yra vienodos. Kadangi slopinimas yra
konkurencinis, tai vienoda ir Vmax vertė. Tuomet galima parašyti:

KM K [ I] K M K [ I]
1 M   1 M 
[S]1 [S]1 K i [S]2 [S]2 K i
arba:

1  [ I]  1  [ I] 
1    1   (4.16)
[S]1  K i  [S]2  K i 
(4.16) lygybė gali būti teisinga tik tuomet, kai [S] 1 = [S]2 (ko nėra šiuo atveju), arba [I] = -Ki. Su-
sikirtimo taško ordinatės vertė lygi 1/Vmax. Taigi, jeigu per 1/Vmax tašką yra nubrėžta tiesė, lygiagreti
abscisių ašiai, tai ji susikerta su tiese, rodančia slopinimo procesą, taške -Ki.
Visiško nekonkurencinio slopinimo atveju (4.4) lygtį galima perrašyti:

1 1  K s  [I] 
 1  1  . (4.17)
v Vmax  [S]  K i 
Esant dviems skirtingoms substrato koncentracijoms, brėžiamas Diksono grafikas 1/v = f([I]), iš
kurio randama slopinimo konstantos Ki vertė:

1/v
[S]1

[S]2

-Ki
[S]2 > [S]1

[I]

Visiško bekonkurencinio slopinimo atveju (4.13) lygtį galima perrašyti:

1 KM 1  [I] 
  1   .
v Vmax[S] Vmax  Ki 

Šiuo atveju, kai yra dvi skirtingos substrato koncentracijos [S] 1 ir [S]2, Diksono grafike gaunamos
dvi lygiagretės tiesės:

113
 1/v
[S]1
[S]2

[S]2 > [S]1

 

[I]

 KM 
1  
Šiame grafike tg = 1/VmaxKi, o atkarpų ilgiai, atkertami 1/v ašyje –  .
[S]
Vmax

Visiško bekonkurencinio slopinimo atveju Diksono metodu negalima apskaičiuoti slopinimo

konstantos Ki vertės.

Visiško mišraus slopinimo atveju (4.7) lygtį galima perrašyti:

1 K s  [ I]  1  [ I] 
 1    1   (4.18)
v Vmax[S]  K i  Vmax  K i' 
Brėžiant 1/v = f([I]) grafikus, kai substrato koncentracija lygi [S]1 ir [S]2, gaunamos tiesės, susi-
kertančios viename taške, kurio abscisės vertė [I] = -Ki:

1/v 1/v [S]1

[S]1
[S]2
[S]2

[S]2 > [S]1 [S]2 > [S]1

-Ki
-Ki [I] [I]

Kai Ki < K i' , tiesių susikirtimo taškas yra aukščiau [I] ašies ir šiuo atveju visiško mišraus slopini-

mo grafikas bus toks pat kaip visiško konkurencinio slopinimo atveju. Kai Ki > K i' , tuomet tiesių susi-

kirtimo taškas yra žemiau [I] ašies. Kai Ki = K i' – (4.18) lygtis tampa visiško nekonkurencinio slopi-
nimo greičio (4.17) lygtimi.

4.6.4. Slopinimo konstantų verčių apskaičiavimas Cornish-Bowden metodu

Tais atvejais, kai slopinimo konstantų verčių negalima apskaičiuoti Diksono metodu, Cornish-
Bowden pasiūlė grafinį slopinimo konstantų verčių nustatymo būdą – [S]/v = f([I]) grafikus. Pavyz-
džiui, visiško mišraus slopinimo atveju (4.7) lygtį galima perrašyti:

[S] K  [I]  [S]  [I] 

 s 1    1   .
v Vmax  Ki  Vmax  Ki' 
114
 Nubraižius [S]/v = f([I]) grafikus, kai substrato koncentracija lygi [S] 1 ir [S]2, gaunamos tiesės, su-
  K i'  
 Ks 1   
sikertančios viename taške, kurio koordinatės  K ;
'  Ki 
 . Kai Ki > K ' , tiesių susikirtimo
 i Vmax  i
 
 

taškas yra aukščiau [I] ašies, o kai Ki < K i' – žemiau.

Visiško bekonkurencinio slopinimo atveju (4.13) lygtį galima perrašyti:

[S] K M [S]  [I] 

  1  .
v Vmax Vmax  K i 

Brėžiant [S]/v = f([I]) grafikus, kai substrato koncentracija lygi [S] 1 ir [S]2, gaunamos tiesės, susi-
kertančios viename taške, kurio abscisės vertė [I] = -Ki:

[S]/v [S]2

[S]1

[S]2 < [S]1

-Ki [I]

Diksono ir Cornish-Bowden metodais galima vienareikšmiškai nustatyti fermentų aktyvumo slo-

pinimo tipus ir apskaičiuoti slopinimo konstantų vertes.

4.6.5. Slopinimo konstantų verčių apskaičiavimas daliniais slopinimo atvejais

Daliniai slopikliai nesustabdo fermentinės reakcijos. Reakcijos mišinyje didinant slopiklio kon-
centraciją, greitis sumažėja iki tam tikros ribos. Šiuo atveju reakcijos greičio priklausomybę nuo slo-
piklio koncentracijos galima aprašyti hiperbolės lygtimi. Apskaičiuojant slopinimo konstantų vertes
dalinio slopinimo atvejais, hiperbolės lygtis transformuojama į tiesės lygtį, pvz., dalinio konkurencinio
slopinimo atveju (4.2) lygtis transformuojama į 1/v = f(1/[S]) tiesės lygtį:

 [ I] 
K s 1  
1
  K i 

1

1
. (4.19)
v  [I]K s  [S] Vmax
Vmax 1  
' 
 K i s 
K

 [ I]   [ I] 
K s 1   K s 1  
 Ki   K i 
(4.19) lygties tiesės krypties veiksnys a   . a = f([I]) grafikas yra
 [ I]K s   [ I] 
Vmax 1   Vmax 1  ' 
'   K 
 Ki Ks   i 

lygiašonė hiperbolė:
115
 a

Ks/Vmax

[I]

Randama Δa vertė, kuri lygi:

 [ I] 
K s 1  
 K i  K
a   s . (4.20)
 [I]  Vmax
Vmax 1  ' 
 Ki 
Δa = f([I]) grafikas yra lygiašonė hiperbolė, kertanti koordinačių sistemos pradžią. (4.20) lygtis

1 VmaxK i K i' 1 VmaxK i

  
transformuojama į 1/Δa = f(1/[I]) tiesės lygtį:
 
 a Ks K i  Ki [I] K s Ki'  K i
'
.
 
Nubraižius 1/Δa = f(1/[I]) grafiką, randamos slopinimo konstantų K i' ir Ki vertės:

1/a

VmaxKi
-1/K'i
Ks(K'i-Ki)

1/[I]
Tokia analizė atliekama ir kitais dalinio slopinimo atvejais.

116
 5. Fermentinių reakcijų greičio priklausomybė nuo pH ir temperatūros

Fermentai yra aktyvūs esant tik tam tikram reakcijos terpės rūgštingumui. Tokia optimali pH
reikšmė yra dėl kelių priežasčių:
1. pH turi įtakos reakcijos Vmax vertei (kai fermento molekulės įsotintos substratu).
2. pH turi įtakos fermento ir substrato sąveikai (abiejose pusėse nuo optimalios pH vertės stebi-
mas fermento aktyvumo sumažėjimas, kurio priežastis yra sumažėjęs fermento giminingumas
substratui).
3. pH turi įtakos fermento stabilumui. Kintant pH, fermento molekulės gali negrįžtamai prarasti
aktyvumą.
Fermentinėse reakcijose dažnai stebimi keli minėti faktoriai, pvz., fermento aktyvumo sumažėji-
mas, kintant pH į vieną pusę nuo optimalios vertės, gali įvykti dėl fermento ir substrato sąveikos su-
silpnėjimo, o kintant pH į kitą pusę nuo optimalios vertės, fermento aktyvumas gali sumažėti dėl dena-
tūracijos.
Minėtų faktorių įtaka fermento aktyvumui lengvai nustatoma eksperimentiškai. Negrįžtamoji fer-
mento denatūracija tiriama inkubuojant fermento molekules įvairaus rūgštingumo terpėse, po to nusta-
tant fermento aktyvumą, esant tam tikrai pH vertei. 46 pav. pateikiami duomenys, nustatyti tiriant mo-
noaminų oksidazės aktyvumą.

250
250
A I
k 200
200
t
Aktyvumas

y 150
150
II
v
100
u 100
m
a 50
50
s
00
44 55 66 77 88 99 10
10 11
11 12
12
pH
pH
46 pav. Monoaminų oksidazės (EC 1.4.3.4) aktyvumo priklausomybė nuo pH. I – fermento akty-
vumas, esant nurodytoms pH vertėms; II – fermento aktyvumo kreivė, kai reakcijos mišinio pH
7,3 (prieš aktyvumo nustatymą 5 min. fermentas inkubuojamas nurodytų pH terpėse)
Monoaminų oksidazės aktyvumas šarminėje terpėje sumažėja dėl fermento denatūracijos. Kadangi
fermento molekulių denatūravimo laipsnis priklauso nuo laiko, tai ir fermento pH optimumo kreivės
pobūdis taip pat priklauso nuo denatūravimo trukmės. Fermento denatūracijos įtakos galima išvengti
matuojant reakcijų pradinius greičius, iškart nustačius tam tikrą terpės rūgštingumą.
Terpės pH įtaką fermento ir substrato sąveikos giminingumui galima sumažinti padidinus substra-
to koncentraciją. Kadangi konstantos KM vertė taip pat priklauso nuo pH, todėl neteisinga manyti, kad
117
substrato koncentracija, reikalinga fermento prisotinimui esant tam tikrai pH vertei, pakitus pH bus
tokia pati. Norint sužinoti pH įtaką fermento aktyvumui, reikia nustatyti reakcijos greičio priklauso-
mybę nuo substrato koncentracijos, esant įvairioms reakcijos terpės pH vertėms, ir apskaičiuoti Vmax ir
KM konstantas. Dauguma pateiktų fermentų aktyvumų priklausomybės nuo pH grafikų yra sudėtingos
kreivės, kurių forma priklauso nuo Vmax ir KM verčių kitimo.
Kintant reakcijos terpės pH, kinta įvairių reakcijos komponentų jonizacijos laipsnis. Tokie poky-
čiai gali vykti laisvojo fermento molekulėse, fermento-substrato komplekse ir pačiame substrate. Ka-
dangi baltymų molekulėse yra daug funkcinių grupių, kurių jonizacija gali kisti, kai kinta terpės pH,
todėl tirpaluose fermentai gali būti įvairių joninių formų. Šių joninių formų koncentracijos priklauso
nuo pH ir jonizuotis gebančių grupių jonizacijos konstantų verčių. 1911 m. Michaelis ir Davidsohn
iškėlė hipotezę, kad kataliziškai aktyvi gali būti tik viena iš daugelio fermento joninių formų (tiksliau
jo aktyviojo centro joninė forma) [55]. Atlikta daug eksperimentų, rodančių, kad grupių, esančių fer-
mento molekulėje toliau nuo aktyviojo centro, jonizacijos pokyčiai beveik neturi įtakos fermento kata-
liziniam aktyvumui, o grupių, esančių pačiame aktyviajame centre, jonizacijos pokyčiai yra labai
reikšmingi.
Michaelis aprašė fermentų aktyvumo priklausomybę nuo pH, kai, kintant pH, fermento aktyviaja-
me centre arba šalia jo kinta tik dviejų grupių jonizacija – tai yra rūgštinė ir bazinė fermento grupės.
Žymiai kintant pH į vieną ar į kitą pusę nuo optimalios vertės, kitų grupių jonizacija taip pat tampa
reikšminga, ir lygtys, aprašančios fermento aktyvumo priklausomybę nuo pH, tampa labai sudėtingos.
Kita vertus, fermento aktyviajame centre gali būti kelios vienodos grupės, kurios tuo pačiu metu joni-
zuojasi, tačiau tai pasitaiko labai retai. Taigi dažniausiai pH įtaka fermentinių reakcijų greičiui yra ap-
rašoma lygtimis, kurios taikomos dvibazių rūgščių jonizacijai aprašyti. Žinoma, tokių lygčių panaudo-
jimas fermentinėje kinetikoje yra labai supaprastintas.
Skirtumai tarp protonų ir kitų fermentų modifikatorių:
a) beveik visų fermentų aktyvumas priklauso nuo protonų koncentracijos;
b) protonas yra žymiai mažesnis už kitus modifikatorius, todėl jam nėra erdvinių trukdžių;
c) protonų koncentracija nustatoma ir kontroliuojama žymiai platesniame intervale nei kitų modi-
fikatorių, todėl galima registruoti visus jų sukeltus poveikius;
d) protonai jungiasi prie įvairių fermento molekulės vietų, todėl, norint išanalizuoti fermentinių
reakcijų greičio priklausomybę nuo pH, nepakanka analizuoti protono sąveiką tik su vienu
centru.

5.1. Michaelio pH funkcijos

Fermentų molekulėse yra daug rūgštinių ir bazinių grupių. Neutralioje terpėje dauguma šių grupių
yra visiškai deprotonizuotos (aspartatas ir glutamatas) arba visiškai protonizuotos (argininas ir lizinas).
Be to, fermento molekulėse visada yra kelios grupės, kurių pKr vertės yra 5–9 intervale. Prmiausia tai

118
histidino imidazolo grupė ir cisteino tiolinė grupė. Tokias pKr vertes gali turėti ir kai kurios N-galinės
aminorūgštys, kurių pKr priklauso nuo jas supančių aminorūgščių, esančių baltymo molekulėje, pri-
gimties. Taigi fermento molekulėje yra keletas grupių, kurių jonizacija kinta kintant pH ir tai labai
sunkina fermentinių reakcijų greičio priklausomybės nuo pH tyrimus. 1926 m. Michaelis pasiūlė fer-
mentų jonizacijos aprašymui naudoti dvibazių rūgščių modelį, kur HEH yra fermento molekulė, turinti
dvi rūgštines grupes [56]:

EH- + H+
K11 K22

HEH E2- + 2H+

K12 K21
HE- + H+
Šioje schemoje nurodytos kiekvienos jonizacijos stadijos disociacijos konstantos. Pusiausvyros są-
lygomis kiekvienos fermento joninės formos koncentracijos priklausomybė nuo [H +] užrašoma:
[EH–] = [HEH]K11/[H+].
[HE–] = [HEH]K12/[H+].
[E2–] = [HEH]K11K22/[H+]2 = [HEH]K12K21/[H+]2.
Nors disociacijos konstantos K11 ir K21 aprašo protono disociaciją nuo tos pačios grupės, tačiau
K11 konstantos vertė yra didesnė už K21 vertę, t. y. K11 negali būti lygi K21, nes HE– forma turi vienu
neigiamu krūviu daugiau nei HEH ir todėl ji yra silpnesnė rūgštis. Analogiškai ir K12 > K22. Fermento
formos E2– koncentracija turi būti tokia pati nepriklausomai nuo to, ar ji gaunama iš HEH formos per
EH– ar HE– formas (kitu atveju būtų pažeistas antrasis termodinamikos dėsnis). Tuomet galima užrašy-
ti: K11K22 = K12K21. Bendroji fermento koncentracija [E]o = [HEH] + [EH–] + [HE–] + [E2–]. Įvertinus
tai, užrašoma, kaip visų keturių fermento formų koncentracijos priklauso nuo H + jonų koncentracijos:

[E]o [E] o K11 /[H  ]

[HEH]  , [EH - ]  .
K11  K12 K11 K 22 K11  K12 K11 K 22
1  1 
[H  ] [H  ]2 [H  ] [H  ]2

[E] o K12 /[H  ] [E] o K11 K 22 /[H  ]2

[HE - ]  , [E 2 - ]  .
K11  K12 K11 K 22 K11  K12 K11 K 22
1  1 
[H  ] [H  ]2 [H  ] [H  ]2

Kadangi pH=-lg[H+], tuomet galima sužinoti kiekvienos fermento formos koncentracijos priklau-
somybę nuo terpės pH. 47 pav. parodytos įvairių fermento formų koncentracijų priklausomybės nuo
pH, esant laisvai pasirinktoms disociacijos konstantų vertėms.

119
 Santykinė fermento joninių formų koncentracija
1,0
HEH E 2-
0,8
EH 
0,6

0,4

0,2
HE 

0,0
4 5 6 7 8 9 10
pH

47 pav. HEH fermento joninių formų koncentracijų priklausomybė nuo pH. Šiuo atveju pK11 =
6,1, pK12 = 6,9, pK21 = 7,0 ir pK22 = 7,8
Realiuose eksperimentuose gauti tokias kreives yra labai sudėtinga, nes negalima vienu metu aps-
kaičiuoti visų keturių disociacijos konstantų vertes, nes santykis [EH –]/[HE–] = K11/K12. Šis santykis
nepriklauso nuo H+ jonų koncentracijos, o tai reiškia, kad, kintant H+ jonų koncentracijai, EH– kon-
centracijos pokytis yra proporcingas HE– koncentracijos pokyčiui, todėl negalima nustatyti, kokią įtaką
atskirai turi EH– ir HE– formos. Dažniausiai EH– ir HE– formos sujungiamos į vieningą formą, kurios
koncentracijos priklausomybė nuo H+ jonų koncentracijos išreiškiama:

[E] o
[EH - ]  [HE - ]  (5.1)
 [H  ] K2 
 
 K  1  [H  ] 
 1 
K1 ir K2 yra molekulinės disociacijos konstantos, kurios lygios:

K1 = K11 + K12 = ([EH–] + [HE–])[H+]/[HEH],

K2 = K11K22/(K11 + K12) = [E2–][H+]/([EH–] + [HE–])

Molekulinių disociacijos konstantų K1 ir K2 vertes galima apskaičiuoti iš eksperimentiškai gautų

duomenų. HEH ir E2– formų koncentracijų priklausomybę nuo H+ koncentracijos galima užrašyti:

[E] o
[HEH]  (5.2)
 K KK 
1  1  1 22 
 [H ] [H ] 
[E] o
[E 2 - ]  (5.3)
 [H ] [H  ] 
 2
 
 K K  K  1
 1 2 2 
([EH–] + [HE–]) formos koncentracijos priklausomybę nuo pH vaizduoja „varpo“ formos grafikas
(48 pav.):

120
 1,0

0,8

(EH- + HE- ) koncentracija

0,6 4
3
0,4 2
1
0,2 0
1
0,0
4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH

48 pav. (EH- + HE-) fermento joninių formų koncentracijos priklausomybė nuo pH. Šiuo atveju
pK1 = 6,0, o pK2 vertės kinta intervale 5,0–10,0. Virš kreivių esančių skaičių vertės yra lygios
konstantų pK2-pK1 skirtumui
Analizuojant šias kreives, galimi tam tikri netikslumai. Pirma, esant tam tikroms pK1 ir pK2 ver-
tėms, ši kreivė yra labai panaši į Gauso pasiskirstymo kreivę, nors šiuo atveju ji tokia nėra. Tai galima
pastebėti, kai (pK2 – pK1) > 3. Be to, pH vertė, kuriai esant ([EH–] + [HE–]) koncentracija lygi pusei
galimos didžiausios koncentracijos, neatitinka pK1 ir pK2 verčių, išskyrus tuos atvejus, kai (pK2 – pK1)
skirtumas yra pakankamai didelis, o tai būna retai. Kai pH vertė lygi (pK1 + pK2)/2, tai ji atitinka krei-
vės maksimumo pH vertę.
(5.1), (5.2) ir (5.3) lygtyse vardiklyje esantys nariai vadinami Michaelio pH funkcijomis, kurios a-
titinkamai žymimos: f -, f ir f 2–.

5.2. pH įtaka Vmax

pH įtaką Vmax vertėms galima stebėti matuojant fermentinės reakcijos greitį, esant skirtingoms pH
vertėms, kai substrato koncentracija yra pakankamai didelė ir įsotinanti. Taip sumažinama pH kitimo
įtaka fermento ir substrato sąveikai, nes reakcijos mišinyje esančios fermento molekulės yra ES ko mp-
lekse, todėl fermentinės reakcijos greitis priklauso tik nuo šio komplekso skilimo greičio, susidarant
produktams. pH įtaka Vmax vertei apsprendžiama tik komplekso jonizacija. Laisvojo fermento formos E
ir substrato jonizacija neturės įtakos Vmax vertėms, nors jų jonizacijos gali būti reikšmingos konstantai
KM, tačiau to išvengiama padidinus substrato koncentraciją.
Kai fermentinės reakcijos mišinyje substrato koncentracija yra įsotinanti, tai reakcijos greitis v =
k+2[ES]. Kadangi šiuo atveju [E]o ≈ [ES], tai Vmax = k+2[E]o. ES komplekso koncentracija yra lygi visų
ES komplekso joninių formų koncentracijų sumai, ir greičio konstantos k+2 vertė priklauso nuo pH, nes
tik viena ES komplekso joninė forma skyla, susidarant produktams, arba ji skyla greičiau nei kitos jo-
ninės formos. Šios produktyvios ES komplekso formos koncentracija priklauso nuo pH. Taigi greičio

121
konstantos k+2 vertė apsprendžiama dviejų dydžių: a) tam tikros ES komplekso joninės formos suirimo
~
greičio konstantos verte, kuri nepriklauso nuo pH ir žymima k  2 ; b) Michaelio pH funkcijos, kuri rodo
atitinkamos ES komplekso joninės formos koncentraciją, esant tam tikram pH. Kadangi reakcijos grei-
tis mažėja kintant pH į abi puses nuo optimalios vertės, tai tuomet produktyvi ES komplekso forma yra
(ES– + SE–), kurios koncentracija reakcijos mišinyje aprašoma f – Michaelio pH funkcija.
Tuomet:
~
k 2
k 2  
f ES (5.4)
ir reakcijos greitis:

~ x
v  k 2 
f ES (5.5)
~
čia: x – visų ES komplekso joninių formų bendroji koncentracija. k  2 yra ESn komplekso suirimo
x
greičio konstanta, o 
– ESn komplekso koncentracija, čia: n – produktyvaus ES komplekso nei-
f ES
giamas krūvis. Kai x = [E]o, tai:
~
k  2 [E] o
Vmax  (5.6)
 [H  ] K ES2 
1    
 K
 ES1 [H ] 

Laisvojo fermento ir fermento-substrato komplekso įvairių joninių formų susidarymą, kintant pH,
vaizduoja schema:

KE1 KE2
En-1 En En+1

~ ~
k-1 k+1

KES1 KES2
ESn-1 ESn ESn+1
~
k+2

En + P
(5.7)
Išvedant (5.6) Vmax greičio lygtį, daroma prielaida, kad fermentinės reakcijos metu tik ES n komp-
leksas skyla susidarant produktams, tačiau produktyvios gali būti ir kitos dvi komplekso formos: ES n+1
ir ESn–1. Jeigu fermento molekulėje yra grupė, kurios jonizacijos konstanta KES2 ir ši grupė yra tokioje
fermento vietoje, kad jos jonizacija neturi įtakos fermentinei reakcijai, tai tuomet abi formos (ES n ir
ESn+1) suirs, susidarant produktams, vienodu greičiu. Kai fermentinės reakcijos mišinyje vienu metu

122
egzistuoja ESn ir ESn+1 formos, tuomet H+ koncentracija yra tokios pat eilės, kaip ir konstantos KES2

 K ES2 2 [H  ]
vertė, tuomet f ES vertė artėja prie 1   , o f ES – prie 1  dydžių. Reakcijos greitis:
[H ] K ES2

 
 
~ x ~ x ~  1 1  ~
v  k 2   k 2 2
 k  2 x     k 2 x .
f ES f ES K ES2 [H ]
 1   1 
 [H ] K ES2 

Šiuo atveju greičio lygties matematinė išraiška nesikeičia. Jeigu jonizuotis galinti grupė yra fer-
mento aktyviajame centre arba arti jo ir jos jonizacija turi įtakos komplekso suirimo greičiui, susida-
~ ~
rant produktams, tuomet greičio konstantų k  2 ir k 2 , kurios atitinkamai charakterizuoja ESn ir ESn+1
kompleksų suirimą, vertės nebus lygios. Šiuo atveju reakcijos greičio lygties matematinė išraiška prik-
lauso nuo to, ar kompleksų suirimo metu susidaro vienodos ar skirtingos produktų joninės formos. Jei-
gu, skylant kompleksams ESn ir ESn+1, susidaro En fermento forma ir produktai – ESn → En + P, ESn+1
+ H+ → En + P, tuomet reakcijos greitis:

~ x ~ x
v  k 2   k2 2  [H  ] . (5.8)
f ES f ES

[H  ] K ES2
Kadangi 2
  , tuomet (5.8) lygtį galima perrašyti:
f ES f ES

~
 ~
v  k 2  k2 K ES2  fx
. (5.9)
ES

(5.9) greičio lygtis yra panaši į (5.5) greičio lygtį, tačiau (5.9) lygtyje yra skirtinga greičio kons-
tantos vertė.
Kai ESn ir ESn+1 kompleksai skyla, susidarant skirtingoms produktų joninėms formoms, pvz., iš
ESn susidaro fermento forma En, o iš ESn+1 – forma En+1, kuri reaguoja su H+, susidarant En, tuomet
reakcijos greitis:

~ x ~ x
v  k  2   k 2 2 .
f ES f ES

Kai kuriais atvejais ES komplekso skilimas yra katalizuojamas H + jonais. Tuo atveju reakcijos
greitis yra lygus:

~ x
v  k  2 [H  ]  , (5.10)
f ES

[H  ] K ES1
tačiau 
 . Tuomet (5.10) greičio lygtį galima perrašyti:
f ES f ES

123
 ~ x
v  k  2 K ES1 . (5.11)
f ES
(5.11) greičio lygtis yra tokia, lyg skiltų kompleksas ES n+1, bet ne ESn.
~ 
(5.6) lygtį galima perrašyti: lg Vmax  lg k  2 [E]o  pf ES . Brėžiamas grafikas lg Vmax = f(pH), pvz.,
fumarato hidratazinei reakcijai, kai substratu yra fumaratas, gaunama:

lg Vmax

1
5 5,7 7,7 9 pH
Iš grafiko lg Vmax = f(pH) galima nustatyti pK vertes fermento aktyviajame centre arba netoli jo
esančių funkcinių grupių, svarbių aktyvumui. Tais atvejais, kai negalima išmatuoti reakcijos greičio
platesniame pH verčių intervale, pasinaudojama 1/Vmax = f([H+]) arba 1/Vmax = f(1/[H+]) grafikais.
Šiuos grafikus galima nubrėžti tik tuomet, kai nekinta kitų fermento grupių jonizacija tiriamame pH
intervale. Jeigu ši sąlyga yra tenkinama, tuomet (5.6) lygtyje galima pašalinti [H+]/KES1 arba KES2/[H+]
[H  ] K
1 1  ES2
1 K 1 [H  ]
narius. Gaunama  ~ ES1 , arba  ~ . 1/Vmax = f([H+]) arba 1/Vmax = f(1/[H+]) gra-
Vmax k  2 [E]o Vmax k  2 [E ]o

1 K
fikai yra tiesės, kurių pasvirimo kampo tangentas lygus ~ , arba ~ ES2 , o 1/Vmax ašyje
K ES1k 2 [E]o k 2 [E]o
1
atkertamos atkarpos ilgis – ~ . Taip iš šių grafikų galima apskaičiuoti konstantų KES1 ir KES2
k 2 [E]o
vertes [57].
Palyginus ES komplekso jonizuojančių grupių pK vertes su laisvojo fermento E ir substrato pK
vertėmis, nustatoma, kokią įtaką substrato molekulėje esančių grupių jonizacijai turi prisijungimas
fermento aktyviajame centre. Kai reakcijos mišinyje yra substrato perteklius, nustatomos fermento-
substrato komplekse esančių jonizuojančių grupių pK vertės. Kai substrato koncentracijos mažos, tuo-
met nustatomos jonizuojančių grupių pK vertės laisvojo fermento (E) ir substrato molekulėse. Kai re-
akcijos mišinyje substrato koncentracija yra maža, tuomet reakcijos greitis v=(Vmax/KM)[S]. Žinant
konstantos Vmax/KM vertes, galima nustatyti jonizuojančių grupių pK vertes laisvajame fermente ir
substrate [58].

124
 5.3. pH įtaka Michaelio konstantai KM

1944 m. A.C. Walker ir C.L.A. Schmidt, tirdami histidino-amoniako liazės (EC 4.3.1.3) katalizuo-
jamą reakciją, įvertino reakcijos mišinyje esančių komponentų jonizacijos įtaką Michaelio konstantos
skaitinei vertei. Aprašydami šią priklausomybę, Walker ir Schmidt reakciją supaprastino, kad kiekvie-
nas reakcijoje dalyvaujantis komponentas turėtų tik vieną jonizuotis gebančią grupę [59]. 1953 m.
Diksonas išvedė lygtis, kuriomis bendresne forma aprašė reakcijos komponentų jonizacijos įtaką
Michaelio konstantai [60]. Diksonas aprašė pH kitimo įtaką substrato ir fermento sąveikai. Jo tyrimų
duomenimis, ES komplekso koncentracija yra pusiausvyroje su laisvojo fermento E ir substrato kon-
centracija, t. y. greičio konstantos k+2 vertė yra maža, palyginti su greičio konstantos k–1 verte.
Pusiausvyros sąlygomis (5.7) schemoje fermento forma En prisijungia nejonizuotą substratą (pvz.,
dvibazę rūgštį). Susidaro ESn kompleksas:

En + S ESn
(5.12)
Pusiausvyros konstanta:

~ [E n ][S]
Ks  . (5.13)
[ES n ]
~
K s skiriasi nuo konstantos Ks. Ks yra pusiausvyros konstanta, kai E, S ir ES yra pusiausvyroje.
~
Šios konstantos vertė priklauso nuo pH. Tuo tarpu K s gaunama, kai pusiausvyroje yra ypatingos,
~
(5.13) lygtyje esančių narių joninės formos. Konstantos K s vertė nepriklauso nuo pH. Šiuo atveju
[S] – substrato nejonizuotos formos koncentracija. Konstantos Ks priklausomybė nuo H+ koncentraci-
jos išreiškiama:

[E n ] f E [S] fS ~ f E fS
Ks  
 Ks  . (5.14)
[ES n ] f ES f ES
(5.14) lygtį galima perrašyti:
~  ~
pK s  pK s  lg f ES  lg f E  lg f S  pK s  pf ES

 pf E  pf S . (5.15)

~ ff
Analogiškomis lygtimis galima aprašyti pH įtaką fermento ir slopiklio sąveikai: K i  K i E  i ir
f EI
~
pK i  pK i  pf EI  pf E  pf i . Kadangi įvairios joninės formos tarpusavyje yra pusiausvyroje, tai
(5.12) schemą ir (5.13) lygtį galima taikyti ir kitoms joninėms formoms. Nesvarbu, kuri substrato joni-
nė forma prisijungia fermento aktyviajame centre, susidarant ES kompleksui, pvz., kai fermento akty-
viajame centre jungiasi substrato anijonas (S 2–) ir susidariusio ES komplekso struktūra yra tokia pati

125
kaip ESn komplekso (5.12) schemoje. (5.12) schemą ir (5.13) lygtį galima perrašyti:

2  ~ [E n ][S 2- ][H  ] 2
E S
n
 2H  ES ir K s2- 
n
.
[ES n ]
Tuomet:
~ ~
[E n ] f E [S 2 ] f S2 K s2 f E f S2  K s2 f E f S ~ f E f S
Ks  
     Ks . (5.16)
[ES n ] f ES [H  ] 2 
f ES K s1 K s2 f ES f ES
(5.16) lygtis yra analogiška (5.14) lygčiai.
Michaelio pH funkcijų parinkimas (5.15) lygtyje priklauso nuo to, kokiu būdu yra išreiškiama lyg-
tyje esančios pusiausvyros konstantos vertė. Šiuo atveju (5.15) lygtyje yra f – Michaelio pH funkcija
formoms E ir ES, ir f funkcija S substrato formai.
Nuostoviosios būsenos sąlygomis konstanta KM nėra „tikroji“ pusiausvyros konstanta. Ji išreiškia-
ma (k–1 + k+2)/k+1 santykiu. Bent vienos, ar net visų trijų greičio konstantų vertės gali priklausyti nuo
pH. Analizuojant konstantos KM priklausomybę nuo pH, supaprastinama, kad greitis reakcijos, kurios
greičio konstanta k+1 (ES komplekso susidarymas jungiantis fermentui su substratu), priklauso tik nuo
fermento ir substrato jonizacijos, bet nepriklauso nuo ES komplekso jonizacijos. Be to, greitis reakcijų,
kurių greičio konstantos k–1 ir k+2 (ES komplekso suskilimas, susidarant substratui arba produktui),
priklauso tik tuo ES komplekso jonizacijos ir nepriklauso nuo fermento ir substrato jonizacijos. (5.4)
~ 
lygtyje greičio konstanta k  2 ir Michaelio pH funkcija f ES atitinka tam tikros ES komplekso joninės
formos skilimą susidarant produktams. Jeigu ta pati komplekso ES joninė forma dalyvauja reakcijoje,
~ 
kurios greičio konstanta k–1, tuomet vietoje konstantos k–1 galima užrašyti k 1 / f ES . Reakcijoje, kurios
greičio konstanta k+1, reaguoja fermentas ir substratas, todėl vietoje konstantos k+1 galima užrašyti
~
k 1 /( f E f S ) . Įvertinus tai:

~ ~
k1  k 2 k1  k 2 f E fS
KM   ~   . (5.17)
k1 k1 f ES
Taigi Michaelio konstantos KM priklausomybės nuo pH išraiška (5.17) yra tokia pati kaip pusiaus-
~ ~ ~
vyros konstantos Ks ((5.14) lygtis). Greičio konstantų k1 , k1 ir k  2 vertės nepriklauso nuo pH, nes
atitinka tik tam tikras jonines formas.
1953 m. S.G. Waley išvedė (5.7) schemoje pateiktos fermentinės reakcijos nuostoviosios būsenos
greičio lygtį [61]:

126
 ~
k  2 [E]
[H  ] K ES2
1 
K ES1 [H  ]
v . (5.18)
 [H  ] K E2  K ES1 K ES1 K ES2 
~ 1   1   
1 k 1  k  2  K E1 [H  ]  [H  ] [H  ] 2 
~
1  ~ 
[S] k 1 [H  ] K ES2
1 
K ES1 [H  ]
(5.18) lygtis gaunama padarius prielaidą, kad fermento-substrato komplekso tik ESn joninė forma
yra produktyvi ir ši forma susidaro reaguojant E n ir substratui, kuris gali disocijuoti kaip dvibazė rūgš-
tis.
Kaip jau minėta aprašant pusiausvyros konstantos Ks priklausomybę nuo pH, susidarant komplek-
sui ES, nesvarbu, kokios reakcijos komponentų joninės formos jungiasi tarpusavyje. Priešingai, anali-
zuojant konstantos KM priklausomybę nuo pH, yra svarbu, kokios joninės formos reaguoja, susidarant
ES kompleksui, pvz., jeigu En–1 joninė forma reaguoja su substratu ir susidaro ES n–1 kompleksas, tuo-
~
met šios reakcijos greitis sumuojasi su greičiu reakcijos, kurios greičio konstanta k1 . K.J. Laidler ir
kiti mokslininkai yra analizavę (5.7) schemoje pateiktą reakciją, kai visos trys laisvojo fermento E jo-
ninės formos prisijungia substratą, susidarant produktyviems fermento-substrato kompleksams [62–
64]. Šiuo atveju nuostoviosios būsenos sąlygomis gaunamos labai sudėtingos lygtys, kurias galima su-
paprastinti padarius prielaidą, kad jonizacija vyksta žymiai greičiau nei kompleksų susidarymo ir ski-
limo reakcijos. Laidler įrodė, kad tais atvejais gautos kinetinės lygtys yra tinkamos aprašyti daugumai
fermentinių reakcijų.
Laidler atliktoje analizėje teigiama, kad greičio konstantų k–1 ir k+2 priklausomybė nuo pH yra to-
kia pati, nes šių abiejų reakcijų greičiai priklauso nuo E koncentracijos, tačiau galima teigti, kad taip
yra ne visada, nors pakankamai sunku sudaryti sąlygas, kai pH kitimas skirtingai paveiktų k–1 ir k+2
konstantas. Jeigu greičio konstantos k+2 vertei pH pokytis turi papildomą įtaką, tuomet šios greičio
konstantos vertę reikia padauginti iš atitinkamos Michaelio pH funkcijos, pvz., f+2. Šiuo atveju kitų
greičio konstantų vertės nepakinta ir (5.17) lygtis virsta lygtimi:
~ ~
k1  f  2 k 2 f E fS
KM  ~   .
k1 f ES

~ ~
Ši papildoma pH pokyčio įtaka priklauso nuo greičio konstantų k1 ir k  2 verčių ir Michaelio pH
funkcijos f+2 prigimties.
Tiek pusiausvyros, tiek ir nuostoviosios būsenos sąlygomis galima pritaikyti bendrąją konstantų
Ks ir KM priklausomybės nuo pH teoriją ir atitinkamas pK vertes nustatyti grafiškai, t. y. nubrėžus
pKM = f(pH) grafiką (49 pav.).

127
 pKM pKE
4

2
8 9 10 pH

49 pav. KM priklausomybės nuo pH grafikas šarminei fosfatazei (EC 3.1.3.1)

5.4. Temperatūros įtaka fermentinių reakcijų greičiui

Pirmieji cheminių reakcijų tyrimai parodė, kad reakcijos greitis labai priklauso nuo temperatūros.
Tiriant reakcijų kinetiką ir norint gauti vienareikšmius rezultatus, reikia kontroliuoti temperatūrą. Kita
vertus, vykdant reakcijas skirtingose temperatūrose ir matuojant jų greičius, gaunama svarbios info r-
macijos apie reakcijos mechanizmą.
Dar 1867 m. A.V. Harcourt nustatė, kad daugumos cheminių reakcijų greitis dukart padidėja tem-
peratūrą padidinus 10ºC [65]. 1884 m. J.H. Van‘t Hoff nustatė reakcijos pusiausvyros konstantos prik-
lausomybę nuo temperatūros, kuri išreiškiama Van‘t Hoff lygtimi [66]:

d ln K H o
 ,
dT RT 2

čia: R – universali dujų konstanta, ΔH° – reakcijos standartinis entalpijos pokytis.

Analogiškai Van‘t Hoff lygčiai, 1889 m. Arenijus nustatė reakcijos greičio konstantų priklauso-
mybę nuo temperatūros, kuri išreiškiama Arenijaus lygtimi [67]:

d ln k E
 a2 ,
dT RT

čia: Ea – aktyvacijos energija.

Integruojant Arenijaus lygtį, gaunama lygtis:

lnk = lnA – Ea/RT, (5.19)

čia: lnA – integravimo konstanta. Ši lygtis tinka grafiniam rezultatų pateikimui. lnk = f(1/T) grafi-
kas yra tiesė, kurios pasvirimo kampo tangentas lygus -Ea/R. Patogiau yra naudotis tiesiniu lgk = f(1/T)
grafiku, kurio pasvirimo kampo tangentas lygus -Ea/2,303R (50 pav.). Iš šio Arenijaus grafiko galima
nustatyti aktyvacijos energijos Ea vertę.

128
 Temperatūra, °C
70 60 50 40 30 20 10 0
3,5

3,0
Pasvirimas =  Ea / 2,303R

lg k

2,5

2,0
2,9 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7
3
1/T (x 10 )

50 pav. Arenijaus grafikas

Norint sužinoti aktyvacijos energijos fizikinę prasmę, (5.19) lygtį reikia perrašyti:

k = A exp(-Ea/RT).

Šioje lygtyje eksponentinis narys exp(-Ea/RT) yra vadinamas Bolcmano daugikliu. Pagal Bolcma-
no dėsnį molekulių skaičius, kurių energija didesnė už Ea, yra proporcingas exp(-Ea/RT) dydžiui. Taigi
pagal Arenijaus lygtį reaguoti gali tik tos molekulės, kurių energija yra didesnė už aktyvacijos energi-
ją. Dvimolekulinėms reakcijoms A konstanta yra lygi molekulių susidūrimų dažniui Z. Kai kuriais at-
vejais, vykstant reakcijoms dujinėje fazėje, pvz., skylant vandenilio jodidui, A koeficientas yra lygus Z,
tačiau dažniausiai reikalingas papildomas daugiklis P:

k = PZ exp(-Ea/RT).

Vykstant cheminei reakcijai, molekulių sąveika turi būti orientuota tam tikra tvarka, todėl P dau-
giklis rodo atsitiktinio teisingo molekulių orientavimo tikimybę.
Van‘t Hoff ir Arenijaus nustatytos priklausomybės tinka ir fermentinėms reakcijoms, tačiau yra
tam tikrų ypatybių tiriant fermentinių reakcijų greičio priklausomybę nuo temperatūros. Pirma, dau-
guma fermentų aukštoje temperatūroje denatūruoja, denatūracijos metu kinta fermento molekulės kon-
formacija (dažniausiai negrįžtamai). Kintant konformacijai, fermento molekulės netenka katalizinio
aktyvumo. Denatūracija – tai procesas, kurį aprašyti sudėtinga. Denatūracijos metu kovalentiniai ryšiai
išlieka nesuirę, tačiau suyra labai daug vandenilinių ir kitų silpnų ryšių, kurie yra reikalingi fermento
aktyviai konformacijai palaikyti. Kadangi suyra daug silpnų ryšių, todėl šio proceso standartinis ental-
pijos pokytis (ΔH°) yra labai didelis (200–500 kJ/mol). Suirus daugumai silpnų ryšių, susidaro daug
įvairių fermento molekulių konformamerų, todėl denatūracijos metu labai padidėja sistemos entropija.

129
 Aprašydami fermentinių reakcijų greičio priklausomybę nuo temperatūros, supaprastinsime tai,
kad denatūracija yra grįžtamasis procesas ir denatūruota fermento forma yra pusiausvyroje su aktyvia
forma. Be to, įvairias denatūruoto fermento molekulines formas sujungsime į vieną – tai vaizduoja
schema:

K k
E' E+S E+P
Aktyvaus fermento E forma yra pusiausvyroje su denatūruota neaktyvia E΄ forma ir fermentinė re-
akcija yra antrojo laipsnio, kuri vyksta esant mažai substrato koncentracijai. Denatūracijos proceso pu-
siausvyros konstantos (K) priklausomybę nuo temperatūros aprašo Van‘t Hoff lygtis:

–RTlnK = ΔGo = ΔHo – TΔSo,

čia: R – universali dujų konstanta, T – absoliuti temperatūra, ΔGo, ΔHo, ΔSo – standariniai Gibso
laisvosios energijos, entalpijos ir entropijos pokyčiai. Tuomet pusiausvyros konstanta išreiškiama:

K = exp (ΔSo/R – ΔHo/RT).

Fermentinės reakcijos greitis v = k[E][S]. Kadangi [E]o = [E] + [E’], tuomet:

v = k[E]o[S](1 + K). (5.20)

(5.20) lygtyje greičio konstanta k/(1 + K) žymima k΄. k΄ priklausomybę nuo temperatūros aprašo
lygtis:

A exp(  Ea / RT )
k'  . (5.21)
1  exp( S o / R  H o / RT )
Kai temperatūra yra maža, tuomet (5.21) lygtyje ΔSo/R nario vertė yra maža, palyginti su ΔHo/RT ,
ir eksponentinis narys neturi įtakos k΄ konstantai, o (5.21) lygtis tampa Arenijaus lygtimi. Kai tempera-
tūra yra didesnė už ΔHo/ΔSo, (5.21) lygties vardiklis padidėja ir greičio konstantos k΄ vertė labai suma-
žėja, todėl Arenijaus lygtis netinka aprašyti fermentinių reakcijų greičio konstantų priklausomybę nuo
temperatūros.
Didžiausias daugumos fermentų aktyvumas yra tam tikroje temperatūroje, kuri vadinama optimali
temperatūra. Tačiau šios optimalios temperatūros vertė, kuriai esant greičio konstanta k΄ yra didžiau-
sia, priklauso nuo eksperimento sąlygų, pvz., kuo ilgiau prieš nustatant fermento aktyvumą inkubuo-
jamas reakcijos mišinys, tuo mažesnė optimalios temperatūros vertė. Tai paaiškinama tuo, kad denatū-
racija vyksta lėtai ir šio proceso metu nepalaikoma pusiausvyra. Inkubuojant ilgesnį laiką, denatūruoto
fermento koncentracija didėja.
Yra tam tikrų ypatybių, kurias reikia įvertinti tiriant temperatūros įtaką KM, Vmax ir Vmax/KM kons-
tantų vertėms, pvz., KM konstantos vertė priklauso nuo kelių greičio konstantų, todėl, tiriant KM prik-
lausomybę nuo temperatūros, reikia įvertinti kiekvienos atskiros greičio konstantos vertę, t. y. sužinoti

130
šių greičio konstantų priklausomybę nuo temperatūros. Kai KM yra lygi tikrajai disociacijos konstantai
(Ks), tuomet galima tirti temperatūros įtaką substrato ir fermento sąveikos termodinamikai.
Aprašant fermentinių reakcijų greičio priklausomybę nuo temperatūros, reikėtų atkreipti dėmesį į
tai, kad, kintant temperatūrai kinta ir reakcijos terpės rūgštingumas, o tai turi įtakos disociacijos kons-
tantos vertei. Todėl, aiškinant gautus rezultatus, reikėtų įvertinti reakcijos mišinio pH pokyčius. Kin-
tant temperatūrai, kinta ir vandens jonizacijos konstanta (Kw). Vandens pKw vertė lygi 14,0 esant 24ºC
temperatūrai. 37ºC temperatūroje, kurioje dažniausiai vykdomos fermentinės reakcijos, pKw = 13,62,
todėl šioje temperatūroje neutrali pH vertė yra 6,8, bet ne 7,0. Esant aukštesnei temperatūrai, šie skir-
tumai dar labiau išryškėja. Jonizacijos konstantų priklausomybė nuo temperatūros ypač svarbi tiriant
fermentinių reakcijų, kuriose betarpiškai dalyvauja OH– jonai, greičio priklausomybę nuo temperatū-
ros.

131
 Literatūros sąrašas

1. Radzicka A, Wolfenden R. A proficient enzyme. Science 1995;267(5194):90-3.

2. Bearne SL, Wolfenden R. Enzymic hydration of an olefin: the burden borne by fumarase. J
Am Chem Soc 1995;117(37):9588-9.
3. Radzicka A, Wolfenden R. Rates of uncatalyzed peptide bond hydrolysis in neutral solution
and the transition state affinities of proteases. J Am Chem Soc 1996;118(26):6105-9.
4. Bearne SL, Wolfenden R. Mandelate racemase in pieces: effective concentrations of enzyme
functional groups in the transition state. Biochemistry 1997;36(7):1646-56.
5. Wolfenden R, Lu X, Yourg G. Spontaneous hydrolysis of glycosides. J Am Chem Soc
1998;120(27):6814-5.
6. Walsh C. Enzyme reaction mechanisms. New York: Freeman end Co; 1979.
7. Fersht A. Enzyme structure and mechanism. New York: Freeman and Co; 1985.
8. Pauling L. Nature of forces between large molecules of biological interest. Nature
1948;161(4097):707.
9. Gandour RD, Schowen RL, editors. Transition states of biochemical processes. Chapter 2.
New York: Plenum Press; 1978. p. 77– 114.
10. Menger FM. Analysis of ground-state and transition-state effects in enzyme catalysis.
Biochemistry 1992;31(23):5368-73.
11. So OY, Scarafia LE, Mak AY, Callan OH, Swinney DC. The dynamics of prostaglandin H
synthases. Studies with prostaglandin h synthase 2 Y355F unmask mechanisms of time-
dependent inhibition and allosteric activation. J Biol Chem 1998;273(10):5801-7.
12. Cannon WR, Benkovic SJ. Solvation, reorganization energy, and biological catalysis. J Biol
Chem 1998;273(41):26257-60.
13. Kirby AJ. Effective molarity for intramolecular reactions. Adv Phys Org Chem 1980;17:183-
278.
14. Bender ML, Bergeron RJ, Komiyama M. The bioorganic chemistry of enzymatic catalysis.
New York: Wiley and Sons; 1984.
15. Hartley BS, Kilby BA. The reaction of p-nitrophenyl esters with chymotrypsin and insulin.
Biochem J 1954;56(2):288-97.
16. Bruice TC, Lapinski R. Imidazole catalysis. IV. The reaction of general bases with p-
Nitrophenyl acetate in aqueous solution. J Am Chem Soc 1958;80:2265-7.
17. Jencks WP. Catalysis in chemistry and enzymology. New York: McGraw–Hill; 1969.
18. Hammes GG. Enzyme Catalysis and Regulation. New York: Academic Press; 1982.
19. Fersht A. Structure and mechanism in protein science. A guide to enzyme catalysis and
protein folding. New York: Freeman and Co; 1999.
20. Segel IH. Enzyme kinetics. New York: Wiley and Sons; 1975.
21. Leatherbarrow RJ, Fersht AR, Winter G. Transition-state stabilization in the mechanism of
tyrosyl-tRNA synthetase revealed by protein engineering. Proc Natl Acad Sci U S A
1985;82(23):7840-4.

132
22. Wiberg KB, Slaugh LH. The deuterium isotope effect in the side chain halogenation of tolue-
ne. J Am Chem Soc 1958;80(12):3033-9.
23. Lewis ES, Funderburk L. Rates and isotope effects in the proton transfers from 2-
nitropropane to pyridine bases. J Am Chem Soc 1967;89(10):2322-7.
24. Carter P, Wells JA. Dissecting the catalytic triad of a serine protease. Nature
1988;332(6164):564-8.
25. Perona JJ, Craik CS. Structural basis of substrate specificity in the serine proteases. Protein
Sci 1995;4(3):337-60.
26. Liao D, Breddam K, Sweet RM, Bullock T, Remington SJ. Refined atomic model of wheat
serine carboxypeptidase II at 2.2-A resolution. Biochemistry 1992;31(40):9796-812.
27. O‘Sullivan C, Tompson FW. Invertase: a contribution to the history of an enzyme or unorga-
nized ferment. J Chem Soc (Trans) 1890;57:834-931.
28. Wurtz A. C R Hebd Acad Sci 1880;91:787.
29. Brown AJ. Influence of oxygen and concentration on alcohol fermentation. J Chem Soc
(Trans) 1892;61:369-85.
30. Buchner E. Alkoholische Gährung ohne Hefezellen. Ber Dt Chem Ges 1897;30:117-24.
31. Brown AJ. Enzyme action. J Chem Soc (Trans) 1902;81:373-88.
32. Henri V. Théorie générale de l’action de quelques diastases. C R Hebd Acad Sci
1902;135:916-9.
33. Henri V. Lois générales de l‘action des diastases. Paris: Hermann; 1903.
34. Sørensen SPL. Enzymstudien II. Ueber die Messung und. die Bedeutung der Wasserstoffio-
nenkonzentration bei. enzymatischen Prozessen. Biochem Z 1909;21:131.
35. Michaelis L, Menten ML. Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochem Z 1913;49:333-69.
36. Van Slyke DD, Cullen GE. The mode of action of urease and of enzymes in general. J Biol
Chem 1914;19:141-80.
37. Langmuir I. The constitution and fundamental properties of. solids and liquids. J Am Chem
Soc 1916;38:2221-95.
38. Langmuir I. The adsorption of gases in plain surfaces of. glass, mica, and platinum. J Am
Chem Soc 1918;40:1361-403.
39. Briggs GE, Haldane JBS. A note on the kinetics of enzyme action. Biochem J 1925;19:338-9.
40. Bodenstein M. Eine Theorie der photochemischen Reaktionsgeschwindigkeiten. Z Physik
Chem 1913;85:329.
41. Laidler KJ. Theory of the transient phase in kinetics, with special reference to enzyme
systems. Can J Chem 1955;33:1614-24.
42. Haldane JBS. Enzymes. London: Longmans Green; 1930.
43. Lineweaver H, Burk D. The determination of enzyme dissociation constants. J Am Chem Soc
1934;56:658-66.
44. Eisenthal R, Cornish-Bowden A. The direct linear plot: A new graphical procedure for esti-
mating enzyme kinetics. Biochem J 1974;139(3):715-20.
45. King EL, Altman C. A schematic method of deriving the rate laws for enzyme-catalyzed rea-
ctions. J Phys Chem 1956;60:1375-8.
133
46. Cleland WW. The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or
products. I. Nomenclature and rate equations. Biochim Biophys Acta 1963;67:104-37.
47. Segal HL, Kachmar JF, Boyer PD. Kinetic analysis of. enzyme reactions. Enzymologia
1952;15:187-98.
48. Alberty RA. The relationship between Michaelis constants, maximum velocities and the
equilibrium constant for an enzyme catalysed reaction. J Am Chem Soc 1953;75:1928-32.
49. Alberty RA. On the determination of rate constants for coenzyme mechanisms. J Am Chem
Soc 1958;80(8):1777-82.
50. Dalziel K. Initial steady state velocity in the evaluation of enzyme-coenzyme-substrate rea-
ction mechanism. Acta Chem Scand 1957;11:1706-12.
51. Monod J, Changeux JP, Jacob F. Allosteric proteins and cellular control systems. J Mol Biol
1963;6:306-29.
52. Friedenwald JS, Maengwyn-Davies GD. Elementary kinetic theory of enzymatic activity.
First order theory. In: A symposium on the mechanism of enzyme action. Baltimore: Johns
Hopkins press; 1954. p. 154-79.
53. Krupka RM, Laidler K. Molecular mechanisms for hydrolytic enzyme action. I. Apparent
non-competitive inhibition, with special reference to acetylcholinesterase. J Am Chem Soc
1961;83:1445-7.
54. Ghosh NK, Fishman WH. On the mechanism of inhibition of intestinal alkaline phosphatase
by L-phenylalanine. I. Kinetic studies. J Biol Chem 1966;241(11):2516-22.
55. Michaelis L, Davidsohn J. Die Wirkung der Wasserstoffionen auf Invertin. Biochem Z
1911;35:386-412.
56. Michaelis L. Hydrogen ion concentration. (translated by W. A. Perlzweig from the 2nd revi-
sed German edition). Baltimore: Williams & Wilkins Co.; 1926.Vol. 1.
57. Laidler K. The influence of pH on the rates of enzyme reactions. J Trans Faraday Soc
1955;51:550-61.
58. Alberty RA, Massey V. On the interpretation of the ph variation of the maximum initial velo-
city of an enzyme-catalyzed reaction. Biochim Biophys Acta 1954;13:347-53.
59. Walker AC, Schmidt CLA. Studies on histidase. Arch Biochem 1944;5:445-67.
60. Dixon M. The effect of pH on the affinities of enzymes for substrates and inhibitors.
Biochem J 1953;55(1):161-70.
61. Waley SG. Some aspects of the kinetics of enzymic reactions. Biochim Biophys Acta
1953;10(1):27-34.
62. Alberty RA, Bloomfield V. Multiple intermediates in steady state enzyme kinetics. V. Effect
of ph on the rate of a simple enzymatic reaction. J Biol Chem 1963;238:2804-10.
63. Kaplan H, Laidler KJ. Kinetics of a-chymotrypsin action. 111. Mechanisms of inhibition.
Can J Chem 1967;45:539-49.
64. Peller L, Alberty RA. Multiple intermediates in steady state enzyme kinetics.1,2 I. The me-
chanism involving a single substrate and product. J Am Chem Soc 1959;81(22):5907-14.
65. Harcourt AV. On the observation of the course of chemical change. J Chem Soc
1867;20:460-92.
66. Van‘t Hoff JH. Etudes de dynamique chimique. Amsterdam: Muller; 1884. p. 114–8.

134
67. Arrhenius S. Uber die reaktionsgeschwindigkeit der inversion von rohrzucker durch saeuren.
Z Physik Chem 1889;4:226-48.

135