Ingeniería Molecular

Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

Enzimas de restricción

OBJETIVO GENERAL
● Identificar los plásmidos a través de los cortes observados en electroforesis por
enzimas de restricción.

INTRODUCCIÓN
Las enzimas de restricción se denominan también nucleasas de restricción,
endonucleasas de restricción y en ocasiones restrictasas, y son enzimas que cortan ADN.
Cada enzima reconoce una o un número pequeño de secuencias blanco y corta el ADN en o
cerca de esas secuencias. Muchas enzimas de restricción hacen cortes escalonados que
producen extremos sobresalientes de ADN de cadena sencilla. Sin embargo, algunos
producen extremos romos. Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde
actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre
en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir
entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA
metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial. Estas enzimas
son utilizadas para aislar a un gen del resto del cromosoma o pueden ser empleadas para
cortar el DNA en el sitio en el cual un fragmento será insertado. (Segal, 2005) Las enzimas de
restricción se encuentran en bacterias (y otros procariontes). Reconocen secuencias
específicas de ADN, llamadas sitios de restricción, y se unen a ellas. Cada enzima de
restricción reconoce solo uno o unos pocos sitios de restricción. Cuando encuentra su
secuencia blanco, la enzima de restricción cortará las dos cadenas de una molécula de ADN.
Por lo general, el corte es en o cerca del sitio de restricción y ocurre en un patrón ordenado
y predecible. Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas se
nombran de acuerdo a las bacterias de las que fueron aisladas por primera vez. La primera
letra es referente al género, las siguientes dos a la especie de la bacteria y la cuarta indica la
cepa. Al final del nombre se agrega un número en romano que indica la cantidad de enzimas
que se han aislado de esa cepa.

EcoRI: HindIII: SacI:

• E = género Escherichia
• co = especie coli
• R = cepa RV 13
• I = Primera endonucleasa
aislada de esta cepa
• H = género Haemophilus
• in = especie influenzae
• R = cepa Rd
• III = Tercer endonucleasa
aislada de esta cepa
• S = género Streptomyces
• ac = especie archromogenes
• c = cepa E. coli
• I = Primera endonucleasa
aislada de esta cepa
Ingeniería Molecular
Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

Las enzimas de restricción son herramientas imprescindibles en biología molecular,

ingeniería genética y biotecnología. La importancia de las enzimas de restricción radica en su
gran especificidad para reconocer una secuencia corta de DNA bicatenario e hidrolizar un
enlace fosfodiéster en cada hebra, siempre en la misma posición. Cada enzima se
caracteriza, pues, por su sitio o secuencia de reconocimiento o de restricción, o secuencia
diana. Los fragmentos de DNA resultantes son útiles para iniciar la clonación celular o
acelular, para el análisis del DNA, para elaborar mapas físicos de restricción o para la
detección de polimorfismos. Las diversas enzimas de restricción se agrupan en tres
familias,ver fig.1, de acuerdo con sus propiedades: Tipo I, Tipo II y Tipo III [​ 1]​.

Fig.1 Tipos de enzimas de restricción. [2]

Las enzimas de restricción de Tipo I y III reconocen una secuencia específica pero
cortan a una distancia variable del sitio de reconocimiento (sitio de restricción). Las enzimas
de restricción de Tipo II reconocen una secuencia específica conocida como secuencia diana
y siempre cortan entre los mismos nucleótidos. De ahí que generen siempre los mismos
fragmentos de restricción. La secuencia diana es de tamaño variable, la mayoría de 4 y 6
nucleótidos, y con frecuencia es parcialmente palindrómica. Algunas enzimas de restricción
cortan generando extremos llamados romos mientras que otras cortan generando extremos
llamados cohesivos, ver fig.2.
Ingeniería Molecular
Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

Fig.2 Tipos de cortes.

Ingeniería Molecular
Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

METODOLOGÍA
Tabla 1.- Componentes utilizados con concentraciones por equipo para realizar cortes en plásmidos

Tabla 2.-Posición de cortes de la enzima de restricción HIND III

Fragmentos pCR3.1 pGST-FSL1A pGST-GFP pBlueScript pJet
[5044 pb] [6525 pb] [5729 pb] [2980 pb] [2974 pb]

1 686 2508 1714 711 624

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

Fig 3. Corrida de plásmidos sin cortar y cortados con enzima de restricción HindIII
Ingeniería Molecular
Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

Fig 4. Corrida de plásmidos sin cortar y cortados con enzima de restricción HindIII con alto contraste.

Como se puede observar en las figuras se muestra la corrida de gel con plásmidos que se
hicieron reaccionar con enzimas de restricción con el fin de identificar los sitios de
restricción que estos tienen. Se utilizó la enzima ​Hind(III) y un ​Buffer B marca SuRE/Cut​, el
cual teóricamente posee un 100% de capacidad de corte cuando se combina con la enzima
Hind(III). De acuerdo con la información de la empresa, el buffer consiste en cinco buffers de
incubación optimizados y con una concentración (10x), espesificamente diseñado para
realizar digestiones con enzimas de restricción.

Fig 5. Tabla de composiciones de Buffers marca SuRE/Cut

Ingeniería Molecular
Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

Fig 6. Tabla de afinidades de enzimas de restricción respecto a cada buffer, marca SuRE/Cut
(En negritas los que tiene un 100% de corte en la digestión)

Fig.7 Marcador de peso molecular utilizado

Ingeniería Molecular
Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

Análisis del Gel

Equipo 1

Respecto al análisis de la muestra que no se le adicionó enzima de restricción, es posible ver

que no hay una sola banda después de correr la electroforesis. Esto se debe a que los
plásmidos pueden presentar más de una estructura al momento de ser inyectados al gel;
hay tres formas en las que se puede configurar la estructura de los plásmidos:
Superenrollados, lineales de longitud completa y circulares relajados; cada una de estas
estructuras tiene una mayor o menor dificultad de migración dentro del gel. Nuestro gel
presentó dos tipos de estructuras.

La línea inferior, la que se ve mejor definida, corresponde a plásmidos lineales. Mientras que
la línea difusa superior representa plásmidos circulares relajados. Esto se debe a que los
plásmidos lineales migran con una mayor facilidad respecto a los circulares. De entre las dos
bandas que se ven la que se debe de considerar como el peso en pb es la banda lineal de
plásmidos, ya que ésta es la que presenta el desplazamiento correcto en el gel.

Los resultados expuestos del plásmido cortado se interpretar en que no hubieron cortes en
los plásmidos tratados, y que solo hay una ‘franja’ en la sección de abajo que no es más que
una interferencia ya sea por polvo en la lente de la cámara o algún otro agente externo. Esto
se puede deber a que no se contaron con las condiciones mínimas para que la enzima de
restricción llevara a cabo su función correctamente,el factor principal al que se le puede
atribuir el fallo es la temperatura o inclusive si se le hubiera añadido Mg a la muestra se
hubieran tenido resultados positivos.

Comparando los resultados obtenidos con el marcador de peso molecular se concluye que la
enzima con la que trabajamos (Equipo 1) es: pCR3.1; esto debido a que la banda de
plásmidos lineales se encuentra casi exactamente a la altura de 5,000 pb, mientras que el
plásmido pCR3.1 tiene 5044pb.

Equipo 2

El equipo 2 presenta igualmente más de un tipo de configuración de plásmidos por lo cual se

ven ‘lineas’ inclusive con un mayor número de pb que el marcador de peso molecular. Sin
embargo se descartan por que no representan el peso molecular real del plásmido.
Tomando en cuenta eso, se analizaron los carriles y de acuerdo a las alturas que presentan,
tanto con y sin corte, concluimos que se trata del plásmido: pBlueScript KS pGST-GFP
Ingeniería Molecular
Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

Equipo 3

En el equipo 3 ocurre algo similar que en la muestra del equipo 1, se logra observar la banda
al mismo nivel que el ADN cerrado, esto indica que no hubo cortes en el ADN; Esto se
ocurre debido a que no se tuvo una gran concentración de ADN o mejor dicho no se tuvo
cuidado al momento de manejar la muestra. Además, se pudo haber degradado pues se
observa una gran mancha al final del gel esto posiblemente a que el agua o el material no
contaba con los estándares de esterilidad que se esperaba. Analizando los resultados se
concluyó que el plasmido del equipo 3 es: pGST-FSL​1A

Equipo 4

Para el equipo 4 se logra apreciar en el abierto una banda la cual se asume que corresponde
HindIII ya que la banda se encuentra en el nivel entre 2000 y 3000 que es como se debe ver
por solo tener un corte. Se ven unas manchas en la parte superior del carril, pero lo
atribuimos a los superenrollamientos y es por ello que no se aprecia correctamente. Debido
a esto concluimos que se trata del plásmido pBlueScript KS

Equipo 5

Finalmente para este último carril se observan varias bandas, esto debido a una posible
contaminación; el equipo usó la misma punta de otro equipo o estaba contaminada, al
hacer la mezcla lo que promueve mayores interferencias en el gel y provoca que se vea una
mayor cantidad de las esperadas para este buffer. Aunque se ve unas a una distancia
parecida del cerrado hay algunas que permanecen a la altura de corte, por lo que al
desconocer la causa y al identificar las otras decidimos atribuirle que corresponde el
plásmido: pJet.
Ingeniería Molecular
Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

Figura 8. Mapa del plásmido que proporcionó al ​equipo 1​.

Figura 9. Mapa del plásmido que proporcionó al​ equipo 3.

Ingeniería Molecular
Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

Figura 10. Mapa del plásmido que proporcionó al equipo 2.

Figura 11. Mapa del plásmido que proporcionó al equipo 4.

Ingeniería Molecular
Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

Figura 12. Mapa del plásmido que proporcionó al equipo 5.

Ingeniería Molecular
Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

CONCLUSIONES

Las enzimas de restricción tienen aplicaciones importantes en el ámbito de la ingeniería

molecular como en la transformación de bacterias.

El uso de estas enzimas debe ser bajo condiciones estrictas si se desea un trabajo de calidad.

Es importante observar el efecto de las enzimas de restricción en los plásmidos ya que de

esta manera se puede comprobar si el mapa de éste es correcto, además de poder observar
qué enzimas son necesarias para abrir las cadenas en un sitio especÍfico que nos permita
comenzar una replicación de un gen específico.

Se deben de considerar los diferentes tipos de migración de los plásmidos en un gel para
determinar correctamente su peso molecular.

Es recomendable hacer más de una corrida para corroborar comportamientos en el gel y

con ello obtener resultados más confiables.
Ingeniería Molecular
Equipo 1:​ Aguirre Rincón Salma Michelle, Lazcano Macías Matías Cuauhtémoc, Torres Nava David
Fernando, Monje Sotelo Ruth Carmina, Montiel Aguirre Juan Carlos.
Grupo:​ 6AV2

BIBLIOGRAFÍA
[1] Introducción a las enzimas de restricción.
http://bioted.es/protocolos/INTRODUCCION-ENZ-RESTRICCION.pdf
[2] Enzimas de restricción.
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/pacopp/2-ENZIMAS_DE_RESTRICCION.pdf
[3] Caracterización de los plásmidos presentes en tres aislamientos multirresistentes
de: Acinetobacter baumannii, Acinetobacter nosocomialis y Acinetobacter pittii obtenidos
en hospitales colombianos [​http://bdigital.unal.edu.co/49595/1/1030552502.2015.pdf​ ]
http://eprints.ucm.es/3159/1/X3017601.pdf
http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Manual%20Electroforesis%20
38.pdf
[4]Segal Claudia, 2005, Manual de prácticas biología molecular, Editorial las prensas
de ciencias, México, pág. 91. [Consultado: 08/06/18]
[5] Páginas Web Educativas. Enzimas de Restricción. Universidad Autónoma
Metrolitana. Unidad Iztapalapa. [consultado: 08/06/18] Disponible:
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/pacopp/2- ENZIMAS_DE_RESTRICCION.pdf
[6] Rivera Denizard Omayra. Enzimas de Restricción. Recinto Universitario de
Mayaguez [consultado:08/06/18] disponible:
http://academic.uprm.edu/~jvelezg/EnzimasDNA.htm