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ARTICULO DE INVESTIGACION
CONTROL BIOLOGICO
1
Estudiante Ingeniería Agronómica. Universidad de Nariño. Colombia, sanpineda1@hotmail.com.
RESUMEN
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UNIVERSIDAD DE NARIÑO
en las cuales el organismo tuvo un crecimiento mayor ocupando gran parte de las unidades
experimentales; y en comparación con el Tratamiento testigo todas las dosis evidenciaron
una amplia diferencia, lo que logra confirmar el efecto inhibitorio por parte de la bacteria
hacia el patógeno, introduciéndola como una alternativa en el manejo de enfermedades, por
parte de los agricultores en la región.
ABSTRACT
This research was carried out in the facilities of the University of Nariño, in the section of
laboratories (microbiology laboratory 1), Pasto-Colombia, using sclerosis of the pathogen in
question, collected in the municipality of Guachucal, Caupueran, with the objective of To
evaluate different concentrations of Bacillus subtilis strain QST 713 in the control of
Rhizoctonia solani Kuhn, (Tel. Thanatephorus cucumeris D), under in vitro conditions. A
Full Batch Block Design (BCA) was used with five treatments and three replicates. The
treatments studied were: T0: Control, T1: dose of 1.25 cm3, T2: dose of 2.5 cm3, T3: dose
of 0.5 cm3, T4: dose of 2 cm3. The results showed that the most effective applications in
pathogen control were 2.5 cm3 (T2) and 2 cm3 (T4) of commercial product (Rhapsody), with
Bacillus subtilis strain QST 713 as IA, without showing significant differences between
them, which They affected the development of the pathogen reducing the percentage of
fungus growth with respect to the dose 1.25 cm3 (T1) and 0.5 cm3 (T3), in which the
organism had a bigger growth occupying a large part of the experimental units; And in
comparison with the control treatment, all the treatments showed a wide difference, for which
the inhibiting effect on the part of the bacteria towards the pathogen, the introduction of an
alternative in the handling of diseases, by the farmers in the region.
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UNIVERSIDAD DE NARIÑO
INTRODUCCIÓN Además, es uno de los cultivos que
presenta la mayor demanda de fungicidas
El cultivo de papa es originario de la
e insecticidas para el control de sus
cordillera de los Andes, de donde se
afecciones, razón por la cual puede
dispersó a todos los continentes y es hoy
presentarse ineficacia en el control del
un pilar fundamental en la alimentación
complejo de patógenos del suelo al no
humana. En Colombia se cultiva en las
existir fungicidas específicos para estos, lo
zonas altas de las tres cordilleras, siendo
anterior es un problema evidente, que ha
los departamentos de Cundinamarca,
contribuido al incremento de
Boyacá y Nariño los mayores productores,
microorganismos perjudiciales para el
con el 80% del área sembrada y de la
cultivo de papa, lo que afecta directamente
producción nacional. De acuerdo con los
al rendimiento, calidad física y sanitaria de
registros de Agronet (2017), el área
los tubérculos, además que permite
sembrada para el último año fue de
generar resistencia hacia el control
169.000 has con una producción de
químico. (ICA, 2011).
3.740.140 ton y un promedio de 22,13
ton/ha. R. solani es probablemente el hongo más
común y dañino en los suelos paperos de
Las condiciones climáticas prevalecientes
Colombia y Ecuador, su tolerancia a la
en nuestro país, la propagación vegetativa
acidez le permite sobrevivir mejor.
del cultivo, la movilización de material de
Ataques moderados de este hongo pueden
siembra y de tubérculos para consumo
inducir pérdidas mayores al 50% en la
humano e industrial y su empaque, la corta
producción (Pumisacho y Sherwood,
rotación en las grandes áreas sembradas,
2002).
entre otros factores, han contribuido a la
diseminación y establecimiento de plagas Por medio de esta investigación se
y enfermedades, situación que se agrava pretende generar una nueva alternativa de
debido a la poca información técnica que manejo en la producción de este cultivo,
tienen muchos productores, para el integrando métodos que permitan dar
oportuno reconocimiento y adecuado soluciones, para de esta manera aplicarlos
manejo de estos problemas fitosanitarios. en forma oportuna en el control de
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patógenos, por medio del control biológico Caupueran del municipio de Guachucal
y en este caso con B. subtilis, con una altura promedio de 3180 msnm.
estableciéndose como una alternativa
El aislamiento se realizó teniendo en
viable en el manejo integrado de
cuenta la metodología descrita por Cedeño
enfermedades. Teniendo en cuenta lo
et al. (2001); los esclerocios fueron
anterior; el objetivo de esta investigación
sumergidos por 3 min en solución 0,5% de
fue evaluar diferentes concentraciones de
hipoclorito de sodio, después se lavaron
Bacillus subtilis cepa QST 713 en el
tres veces en agua destilada estéril, a
control de Rhizoctonia solani Kuhn, (Tel.
continuación se suspendieron en etanol al
Thanatephorus cucumeris D), agente
70 % por un minuto, para seguidamente
causal de la “rhizoctoniasis” en el cultivo
ser lavados con agua destilada,
de papa, bajo condiciones in vitro; así
posteriormente se sembraron
como también conocer el potencial
asépticamente, bajo un ambiente libre de
biocontrolador de la cepa evaluada, y
microorganismos, la siembra se efectuó en
determinar la concentración óptima del
cajas Petri con PDA (papa agar dextrosa),
producto Rhapsody comercial, 1,25; 2,5;
previamente preparadas, las cuales fueron
0,5 y 2 cm3 en el control del patógeno.
incubadas a temperatura ambiente por 15
MATERIALES Y MÉTODOS días, en un ambiente sin presencia de luz;
posterior a estos procedimientos se
La investigación se llevó a cabo entre los
prepararon las cajas Petri con PDA, las
meses de octubre y noviembre del año
cuales sirvieron de unidades
2016, en las instalaciones de la
experimentales; se depositaron discos de 5
Universidad de Nariño, ubicada a 2489
cm de diámetro en el centro de cada caja
msnm, 01° 17′ 7″ LN y 77° 17′ 7″ LO, con
procedentes del primer aislamiento de R.
una temperatura promedio de 13ºC; en la
solani (de esta manera se logró eliminar
sección de laboratorios, en el
contaminaciones por parte de otros agentes
correspondiente a microbiología 1. La
procedentes del material inicial y el
investigación se realizó utilizando
ambiente), al mismo tiempo a una
esclerocios (estructuras de resistencia del
distancia de 3 cm en los cuatro puntos
patógeno) recolectados en la vereda
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cardinales se adiciono la dosis Donde:
correspondiente de producto comercial DCC: Diámetro de la colonia control
con B. subtilis, este proceso fue realizado DCT: Diámetro de la colonia tratada
en una cámara de flujo laminar
previamente esterilizada bajo la influencia El diámetro de la colonia control hace
de rayos U.V, las cajas Petri con cada referencia al testigo, mientras que el
tratamiento se incubaron por 8 días a una diámetro de la colonia tratada, hace
temperatura de 25ºC, cabe resaltar que se referencia a cada uno de los tratamientos
tuvo una caja Petri en donde no se adiciono que contaron con la presencia del patógeno
el controlador biológico, la cual sirvió y el biocontrolador.
como testigo; transcurrido este periodo se
Para este caso la caja Petri correspondió a
evaluó el porcentaje de inhibición, en cada
la unidad experimental, se evaluaron
bloque y se determinó en cual se ejerció un
diferentes dosis de Rhapsody (producto
mayor biocontrol.
comercial que contiene a la bacteria
Cabe destacar que antes de realizar los controladora) de 1,25; 2,5; 0,5 y 2 cm3 por
procesos en el laboratorio se autoclavaron tratamiento, distribuidas en proporciones
los instrumentos a utilizar para evitar iguales a 3 cm del patógeno en los cuatro
contaminaciones, además las cajas Petri puntos cardinales.
fueron esterilizadas a una temperatura de
Los tratamientos estudiados fueron: T0:
180ºC, en una estufa esterilizadora.
Testigo, T1: dosis de 1,25 cm3, T2: dosis
El diseño experimental utilizado fue en de 2,5 cm3, T3: dosis de 0,5cm3, T4: dosis
bloques completos al azar (BCA), con de 2 cm3.
cinco tratamientos y tres repeticiones, el
Se utilizó la prueba de Tukey, ya que los
efecto de control se determinó mediante el
valores obtenidos presentaron diferencias
porcentaje de inhibición, cuya fórmula se
entre sí, el análisis estadístico se realizó a
presenta a continuación:
un nivel de confianza del 95 %, utilizando
𝐷𝐶𝐶 − 𝐷𝐶𝑇 el programa Infostat.
𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛 (%) = 𝑥100
𝐷𝐶𝐶
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RESULTADOS Y DISCUSION repeticiones establecidas, se muestran en
las siguientes tablas.
Diámetro de las colonias
Tabla 1. Diámetros de la colonia formada por R. solani en cajas Petri, en presencia de las
diferentes concentraciones del producto Rhapsody (B. subtilis)
Bloques Tratamiento Diámetro de la colonia (Cm)
1 0 9
1 4,6
2 2,3
3 6,7
4 2,8
2 0 9
1 4,7
2 2,2
3 6,2
4 2,6
3 0 9
1 4,2
2 2,7
3 6,8
4 2,9
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UNIVERSIDAD DE NARIÑO
Teniendo en cuenta las anteriores tablas, Evaluado con ninguna dosis del producto
sin considerar los porcentajes de comercial, por lo que su diámetro
inhibición, se puede concluir que el mejor promedio correspondió a la totalidad de la
tratamiento es el T2 ya que tiene un unidad experimental (caja Petri)
promedio de diámetro de la colonia de 2,4
Porcentaje de inhibición
cm, siendo el inferior con respecto a los
otros; el orden de menor a mayor en cuanto El porcentaje de inhibición en cada
< T4 < T1 < T3 < T0, en donde este último además los valores obtenidos con su
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Tabla 3. Porcentaje de inhibición de R. solani con Rhapsody (B. subtilis)
BLOQUES Tratamiento % De
inhibicion
Rhapsody
1 0 0
1 48.83
2 74.44
3 25.55
4 68.88
2 0 0
1 47.77
2 75.55
3 31.11
4 71.11
3 0 0
1 53.33
2 70
3 24.44
4 67.77
Con los datos registrados en la tabla se Tabla 5; concluyendo que los mejores
realizó el análisis estadístico tratamientos fueron el 2 y 4 con medias de
correspondiente a un BCA para calcular el 73,330 y 69,253 respectivamente no
ANDEVA cuyos resultados se muestran existiendo diferencias significativas entre
en la tabla 4. Debido a que los valores sí; en seguida el tratamiento 1 presento el
finales del porcentaje de inhibición mejor comportamiento en cuanto al
difirieron entre sí, se procedió a aplicar la porcentaje de inhibición, con una media de
prueba de tukey, cuyos resultados de 49,993, presentando diferencias
comparación de medias se muestran en la significativas con los demás, siendo mejor
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que el T3 y T0, pero menos efectivo que el corresponde al testigo, no recibió ningún
T2 y T4; seguidamente se encuentra el tratamiento por lo que su porcentaje de
tratamiento 3 con una media de 27,033, inhibición fue 0, evidenciado en su media,
presentando diferencias significativas con presentando diferencias significativas con
el resto de tratamientos, siendo mejor que los demás tratamientos, pero en este caso
el T0 pero inferior al T2, T4, T1; siendo inferior a todos, (T2, T4, T1, T3).
finalmente se encuentra el T0 que
Análisis estadístico
El análisis de ANDEVA plantea que los cajas Petri, con un Pr > F < .0001 en este
tratamientos tuvieron efecto sobre el caso a un nivel de significancia de
porcentaje de inhibición de R.solani en las mientras que las repeticiones no
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ejercieron efecto sobre el porcentaje de variabilidad no afecta el experimento) lo
inhibición, con un Pr > F de 0,4803, al que indica que no existen diferencias
mismo nivel de significancia, es decir no significativas entre los datos reportados,
existieron diferencias significativas entre concluyendo con un experimento
los bloques; se logra observar también que confiable, además el Pr > F del modelo
el R2, es cercano a 1 (0,995162) lo cual (probabilidad mayor que el F calculado) en
indica que el modelo se ajusta a los datos el ANDEVA es <.0001 lo cual quiere decir
del experimento, midiendo la capacidad que se ajusta al experimento concluyendo
predictiva del modelo ajustado, con que el porcentaje de inhibición es igual
reproduciendo los fenómenos observados a los tratamientos por los bloques,
de la forma más exacta con un 99 % de los existiendo efecto de los tratamientos sobre
datos ajustados al modelo, de la misma el porcentaje de inhibición en el
manera se observa que el valor de CV es experimento a un nivel de significancia de
relativamente bajo (5,962084) siendo
menor de 30 (valor hasta el cual la
A 73.330 3 2
A 69.253 3 4
B 49.993 3 1
C 27.033 3 3
D 0.000 3 0
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Según la comparación de TUKEY, se (1996), son aquellas que no son debidas a
logró concluir que los mejores efectos del azar.
tratamientos fueron: T2 (2,5 cm3) y T4 (2
Sin embargo observando los porcentajes
cm3) sin diferencias significativas entre sí,
de inhibición obtenidos, se puede
por otra parte el T1 (1,25 cm3) fue mejor
establecer sin basarse únicamente en las
que el T3 y T0, pero no mejor que el T2 y
diferencias significativas que el mejor
T4, presentando diferencias significativas;
tratamiento fue el T2 (2,5 cm3), con una
el T3 (0,5 cm3) fue mejor que el T0, pero
media de 73,330 % de inhibición siendo
inferior al T2, T4 y T1, presentando
superior al resto de los tratamientos que
diferencias con cada uno; finalmente el
presentan valores de medias inferiores, lo
tratamiento menos efectivo fue el T0
anterior puede deberse a que la dosis usada
(testigo, el cual no recibió ninguna dosis).
para el T2 fue la mayor de todos los
Teniendo en cuenta el Diámetro de las
tratamientos evaluados, de esta forma se
colonias de cada tratamiento en las
lograría deducir que a una mayor
repeticiones y principalmente el
concentración de Rhapsody (B. subtilis), el
porcentaje de inhibición se puede inferir
porcentaje de biocontrol ejercido sobre los
que la mejor dosis fue 2,5 cm3 (T2) junto a
patógenos, en este caso R. solani, aumenta,
2 cm3 (T4), sin presentar diferencias
lo cual se ve reflejado en la figura 3.
estadísticas entre sí, que según Álvarez
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suelos y acuíferos subterráneos en la zona bacteria, entre los que se encuentran
papera del departamento de Nariño, así péptidos tales como; micobacilinas,
como otros factores perjudiciales tales iturinas, bacilomicinas, surfactinas,
como la eliminación de la microbiota micosubtilinas, fungistatinas, y
benéfica del suelo e incluso graves subporinas, los cuales tienen un PM <
problemas de salud para quienes los 2000 Da.
aplican.
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llevado a condiciones de campo, otra de género proveen de elementos escasos en el
las formas que B. subtilis tendría para ambiente, a las raíces, a cambio de hidratos
ejercer control sobre diferentes patógenos, de carbono, de esta manera el secuestro de
en este caso R. solani, es la producción de algunos elementos como el hierro no
sideroforos, definidos por Koneman et al. afectaría el normal desarrollo de la planta.
(2008), como péptidos, que desempeñan
Con lo anterior se logra deducir que B.
un papel rector en el control de hongos
subtilis, IA del producto comercial
fitopatogenos; en condiciones de ausencia
Rhapsody tiene un efecto antagónico sobre
de hierro, las bacterias producen y
R. solani por diferentes modos de acción
excretan los sideroforos al medio, los
los cuales incluyen competencia por
cuales se acoplan a los iones de Fe, una vez
espacio, nutrientes, antibiosis,
secuestrado el complejo es reconocido por
amensalismo (inhibición de un organismo
receptores de membrana específicos,
por un metabolito producido por otro
atravesando la misma por un sistema de
organismo) principalmente, en donde por
transportadores activos, convirtiendo de
diferentes mecanismos de acción como
esta manera el Fe+++ esencial en procesos
afecciones a la permeabilidad de la
biológicos de los microorganismos como
membrana o sustancias toxicas que
transporte de oxígeno, síntesis de DNA,
provocan una disminución o la muerte del
fijación de nitrógeno, fotosíntesis y
patógeno, se logró observar la capacidad
respiración, en un factor limitante en el
biocontroladora de la cepa, además de
ambiente, inhibiendo de este modo el
evaluar las diferentes concentraciones
crecimiento de patógenos en la rizosfera,
aplicadas en las unidades experimentales,
debido a que al sideroforo acoplarse con el
determinando de esta manera que a una
hierro, este último se hace inaccesible para
mayor concentración de producto
los microorganismos patógenos que no
comercial el efecto antagónico e
posean los receptores proteicos para
inhibitorio aumenta lo cual puede deberse
reconocer el complejo.
al incremento de competencia o
Cabe aclarar que al formar una simbiosis producción de sustancias anti fúngicas por
con las plantas, los individuos de este parte de la bacteria; además determinando
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que independientemente de los resultados indolacetico, solubilizacion de fosfatos
estadísticos que mostraron como los por medio de ácidos orgánicos y enzimas
mejores tratamientos al T2 y T4 sin como la fitasa, así como el aumento de la
diferencias significativas entre si; el mejor resistencia sistémica adquirida (SAR) que
tratamiento por diferencia de medias es el según Gutiérrez y Almaraz (2007) se
T2, logrando definir a la dosis de 2,5 cm3 define como las distintas vías de
como la de mejor desempeño en el control transducción de señales que juegan un rol
del agente causal de la “rhizoctoniasis”. importante en la habilidad de la planta para
defenderse contra patógenos, donde se
Estas pruebas de laboratorio dan la base
destaca la producción de fitoalexinas como
para un análisis de campo más exhaustivo,
isoflavonoides, pisantinas o faseolinas.
en donde realmente se logre definir la
capacidad de biocontrol por parte de la A pesar de que el producto en evaluación
bacteria hacia el patógeno de esta manera no cuenta con un registro ICA para el
definiéndola como una opción para el control del patógeno, con los resultados
agricultor en el manejo integrado de obtenidos se puede establecer un umbral
enfermedades, donde su bajo impacto nominal para su uso en campo, ya que
ecológico le daría una fuerte ventaja sobre posee capacidad inhibitoria sobre R.
el control químico, así como algunos solani, lo cual se respalda por algunos
beneficios adicionales que daría al cultivo; autores que tras investigaciones han
al respecto Tejera et al. (2011) tras logrado definir a B. subtillis como una
investigaciones lograron concluir que bacteria con mucho potencial en el control
muchas de las sustancias secretadas por la de microorganismos que causan
bacteria tienen un efecto positivo en la enfermedades en plantas de interés
nutrición de las plantas promoviendo el agrícola; los resultados obtenidos
aumento de la toma de agua y nutrientes, corroboran las investigaciones de Arcos y
el desarrollo del sistema radical y la Zuñiga (2015), quienes afirman que B.
estimulación de otros microorganismos subtilis proporciona más de 30 lipopetidos
benéficos, así como la síntesis de que trabajan sinérgicamente para destruir
reguladores de crecimiento como el ácido los patógenos causantes de las
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enfermedades de las plantas, sus diferentes estas especies y su producción está dada no
mecanismos de acción evitan que los solo por las características intrínsecas que
patógenos logren el desarrollo de poseen por naturaleza sino en la misma
resistencia, así también Jiménez et al. medida por el estímulo directo de otro
(2001) cuyos resultados sobre la microorganismo, como es que posea una
evaluación del efecto de rhizobacterias relación de antagonismo a través de la
sobre R. solani, identificaron en el cultivo activación del sistema de comunicación y
de papa que la bacteria B. subtilis inhibía señalización bacteriano.
prácticamente todos los grupos de
Tras estas investigaciones se puede
anastomosis de R. solani, además de
deducir que prácticamente la presencia de
reportar algunos casos exitosos en el
fitopatogenos promueven la síntesis de los
control de algunas cepas de Fusarium sp.
diversos metabolitos secundarios ya
y Phytophthora infestans; en relación con
mencionados que le confieren la acción
beneficios en la fisiología; Castillo et al.
biocontroladora a la bacteria, con esto, y
(2015) concluyeron que B. subtilis es
en base a los resultados obtenidos en el
promotora del crecimiento (PGRP) y
experimento, se puede definir a B. subtilis
antagónica a una gran variedad de
como una bacteria promisoria en el control
fitopatogenos como Phytophthora
biológico de microorganismos patógenos
cactorum, Sclerotium cepivorum,
para las plantas teniendo en cuenta los
Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani,
diversos modos de acción ya mencionados
Alternaria carthani, Phytophthora
como la antibiosis, o competencia; además
capsici, Fusarium solani, entre otros,
su actividad anti fúngica se puede
ademas Layton et al. (2011) en sus
favorecer tras el incremento de las dosis en
investigaciones sobre el efecto
las aplicaciones, ya que debido a su
biocontrolador de Bacillus sp.
sistema de reproducción por fisión binaria,
Concluyeron con que los péptidos
entre mayor la cantidad de unidades
antimicrobianos Iturin A, Fengycin y
formadoras de colonia (UFC) mayor serán
Gramicidina S de B. subtilis, son el
las poblaciones al pasar el tiempo lo cual
producto de varios locus genéticos
le permitirá ejercer un control exitoso
existentes en el genoma bacteriano de
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sobre los agentes causales de las diferentes Tras el experimento se logró identificar
enfermedades, teniendo en cuenta el que a pesar de tener registro para otras
potencial anti fúngico, así como la enfermedades diferentes a la tratada el
formación de endosporas definidas como producto Rhapsody con ingrediente activo
estructuras de resistencia que están Bacillus subtilis cepa QST 713 109 UFC,
recubiertas por una membrana llamada tiene un alto efecto biocontrolador para R.
exosporio, lo cual le confiere una alta solani dependiendo de la dosis usada, y ya
protección hacia condiciones que las dosis evaluadas fueron tomadas de
desfavorables del ambiente, esta bacteria experiencias de campo de técnicos y
puede permanecer latente en el suelo por profesionales, se puede definir que 2,5 cm3
varios años hasta encontrar condiciones de producto comercial / 500 cm3 de agua
óptimas para germinar, y seguir es la dosis candidata para evaluar en
reproduciéndose, debido a esto, su uso en campo para así obtener los mejores
el campo sería adecuado, principalmente resultados en el control de la enfermedad,
en el control de R. solani, ya que este logrando de esta manera reafirmar la
microorganismo también desarrolla capacidad antagónica e inhibitoria de la
estructuras de resistencia llamadas bacteria observada en condiciones de
esclerocios que permanecen viables en el laboratorio, contribuyendo a una
suelo por más de 5 años, como inoculo agricultura con menor uso de
inicial de la enfermedad; así de esta agroquímicos, y proveyendo de otras
manera al estar latente tanto el controlador opciones a los agricultores.
como el patógeno, ante condiciones
favorables ambos pueden desarrollarse,
pero en este caso la bacteria ejercería una
alta limitación sobre el hongo, esta y otras
ventajas son las que pueden brindar el uso
de controladores microbiológicos en el
tratamiento de enfermedades.
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UNIVERSIDAD DE NARIÑO
COCLUSIONES comportamiento como umbral
nominal, de esta manera dando
- El mejor tratamiento en el control
paso a ensayos de campo para
de R. solani bajo condiciones in
lograr concluir a nivel in situ la
vitro fue el T2, dosis de 2,5 cm3,
actividad biocontroladora de la
esto mediante comparación visual
bacteria.
de los resultados de medias, ya que
- No se observó formación de
estadísticamente se obtuvo que el
colonias bacterianas en las
tratamiento en mención junto al
unidades experimentales, por lo
T4, (dosis de 2 cm3) no presentan
cual el producto comercial no
diferencias estadísticas.
cuenta con la bacteria como IA, por
- Se logró identificar el potencial
tanto su composición estaría
biocontrolador de la bacteria, el
basada en metabolitos secundarios
cual se debe a diversos
del microorganismo.
mecanismos como competencia o
antibiosis.
- En la evaluación de las diferentes
dosis del controlador biológico se
determinó que al aumentar las
concentraciones del producto
comercial dentro de la caja Petri el
porcentaje de inhibición
aumentaba, teniendo una relación
directamente proporcional
- El producto Rhapsody a pesar de
no tener un registro ICA para el
control de R. solani puede empezar
a ser utilizado como una medida de
control para los agricultores,
basándose en la dosis de mejor
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UNIVERSIDAD DE NARIÑO
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